Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales Lebermodell zu entwickeln, um Viren und virale Vektoren zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse in einem vaskularisierten dreidimensionalen System mit menschlichen Zellen, die sich in ihrer Physiologie von Nagetierzellen in einem Maus- oder Rattenmodell unterscheiden. Darüber hinaus ist es ein Schritt zur Verbesserung des Tierschutzes, da Versuche mit lebenden Tieren vermieden werden und auf lange Sicht tierische Bestandteile vollständig ersetzt werden sollen.

Obwohl wir diese Methode entwickelt haben, um virale Vektoren für den Gentransfer zu untersuchen, kann sie auch auf die Untersuchung infektiöser lebenswichtiger Viren und anderer Forschungsbereiche wie der Krebsforschung angewendet werden. Das Verfahren wird von Viola Rohrs, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Aus Gründen des Tierschutzes wurden für die vorliegende Studie nur überschüssige Tiere verwendet, die für andere Tierversuche geopfert wurden, d.h.

wurden keine zusätzlichen Tiere benötigt, um die Lebergerüste zu erhalten. Erweitern Sie zunächst die hepatische Zelllinie Hep G2. 15 Millionen Zellen in T175-Flaschen in 30 Millilitern Medium aussäen, die 10 % fötales Kälberserum und zwei Millimol Gulatmin, Penicillin und Streptomycin enthalten. Nach vier Tagen Kultivierung verwenden Sie fünf Minuten Trypsinlösung, um die Zellen zu lockern, und ernten Sie sie dann.

Schleudern Sie dann die Zellen drei Minuten lang bei 300 g herunter. Dann suspendieren Sie sie in vier Millilitern PBS und erhalten Sie eine Zellzählung. Jede Flasche sollte etwa 45 Millionen Zellen ergeben.

600 Millionen Zellen werden benötigt, um eine EZM der Rattenleber zu rezellularisieren. Um die EZM zu rezellularisieren, wurde zunächst das Bioreaktorsystem eingerichtet, das eine Leber-Profusionskammer, ein Profusionssystem, ein Reservoir mit Medium und eine Blasenfalle enthält. Das Rezellularisierungsverfahren besteht aus zwei kritischen Schritten.

Eine besteht darin, Luftblasen im Profusionssystem zu vermeiden. Die zweite ist, dass das gesamte System steril gehalten werden muss. Zuerst sterilisieren Sie diese Komponenten des Bioreaktorsystems bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten.

Füllen Sie zweitens die Schläuche und die sterilisierte Profusionskammer mit Medium. Setzen Sie dann das dezellularisierte Rattenlebergerüst in die Leberprofusionskammer ein. Der nächste Schritt besteht darin, die canulierte Pfortader mit Hilfe von Rohrschellen mit dem Profusionssystem zu verbinden.

Setzen Sie nun das Bioreaktorsystem in den Inkubator ein und schließen Sie es an eine Schlauchpumpe an. Als nächstes äquilibrieren Sie das Gerüst über fünf Tage mit 150 Millilitern zugesetztem Medium. Stellen Sie den Durchfluss auf 1,25 Milliliter pro Minute ein.

Trennen Sie nach fünf Tagen das Bioreaktorsystem von der Pumpe und überführen Sie es in eine sterile Haube. Trennen Sie das Lebergerüst vom Medienkreislauf. Laden Sie dann eine Spritze mit fünf Millilitern Medium mit 300 Millionen Hep-G2-Zellen und injizieren Sie die Zellen über die Pfortader, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.

Lassen Sie dann die Zellen eine Stunde lang das ECM neu bestücken, ohne die Pumpe laufen zu lassen. Starten Sie die Pumpe nach einer Stunde mit 1,25 Millilitern pro Minute. Erhöhen Sie nach 10 Minuten den Druck auf 2,5 Milliliter pro Minute.

Nach weiteren 20 Minuten stellen Sie die Pumpe auf die Betriebsdrehzahl von 3,75 Millilitern pro Minute ein. Schalten Sie nach 30 Minuten bei voller Pumpendrehzahl die Pumpe aus, fügen Sie weitere 300 Millionen Zellen hinzu und lassen Sie die Zellen eine Stunde lang das ECM bevölkern. Erhöhen Sie nach einer Stunde die Umwälzung allmählich, indem Sie die Pumpendrehzahl wie bisher schrittweise anpassen.

Lassen Sie nun die Kultur die Leber über zwei Wochen rezellularisieren. Tauschen Sie jeden zweiten Tag 50 Milliliter des Mediums aus und messen Sie die physiologischen Parameter aus einer Probe des verwendeten Mediums. Die Herstellung von AAV-Vektoren ist ein kompliziertes Verfahren mit vielen Schritten, die im Textprotokoll zusammengefasst sind.

In diesem Abschnitt des Videos werden einige der entscheidenden Schritte demonstriert. Erstens, Herstellung, Reinigung und Quantifizierung der AAV-Vektoren. Die AAV-Vektoren werden kurz in Rollflaschen hergestellt und durch Iodixanol-Gradientenzentrifugation gereinigt.

Entfernen Sie das restliche Iodixanol durch Filtration über PD10-Gelfiltrationssäulen. Bestimmen Sie dann die AAV-Vektorkonzentration durch QPCR unter Verwendung genomischer AAV-DNA als Standard. Pro Modell werden insgesamt 27 Billionen AAV-Vektoren benötigt.

Transduzieren Sie nun das Lebermodell. Zuerst werden 27 Billionen Vektoren in fünf Millilitern PBS in eine Spritze geladen. Phenolrot kann in einer Menge von 5 Mikrogramm pro Milliliter zugesetzt werden.

Trennen Sie dann die Leber vom Medienkreislauf und injizieren Sie die Vektoren in das System. Nach der Injektion inkubieren Sie das System eine Stunde lang ohne Pumpen. Erhöhen Sie dann allmählich den Durchfluss, wie zuvor beschrieben.

Später, wenn die transduzierte Leber über sechs Tage inkubiert wird, wechseln Sie jeden zweiten Tag 50 Milliliter des Mediums. Schneiden Sie mit einem Skalpell Proben aus jedem Leberlappen, die etwa einen halben Zentimeter dick und 1,5 bis zwei Zentimeter lang sind. Inkubieren Sie die Scheiben in 4%Paraformaldehyd mit 4%Saccharose für 90 Minuten bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie dann die Probe dreimal eine Minute lang pro Waschgang mit PBS. Nach den Waschgängen inkubieren Sie die Proben über Nacht in 8%iger Saccharose bei vier Grad Celsius. Laden Sie die Proben am nächsten Tag in Kryoformen, die etwas Fixiermedium enthalten.

Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen. Nach dem Laden werden die Proben vollständig mit Fixiermedium bedeckt und bei minus 80 Grad Celsius behandelt. Nach dem Einfrieren werden 10-Mikron-Kryoschnitte aus den Proben mit einem Kryotom hergestellt.

Färben Sie die Proben nach Bedarf, um die Rezellularisierung zu bestätigen. Für die Genexpressionsanalyse entnehmen Sie Proben mit einem vier Millimeter großen Biopsiestanzer. Um die Rezellularisierung zu beurteilen, wurden Kryoschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.

Lappen von zwei transduzierten Lebern und einer Kontrollleber, die rezellularisiert, aber nicht transduziert wurde, wurden alle mit Hep-G2-Zellen besiedelt. Die RNA-Expression und der Vektortiter wurden aus 28 Stanzbiopsien aus jedem Lebermodell quantifiziert. In den beiden transduzierten Lebermodellen wurden 55 und 90 Vektorgenome pro Zelle gemessen, was als Vektor ausreicht, um Gen-Silencing zu induzieren.

Wie erwartet wurden in der Kontrolle keine Genome gemessen. Die EmGFP-Expression wurde mittels RT-PCR und Western Blot analysiert. Die meisten Biopsien zeigten eine mRNA-Expression von EmGFP und eine Proteinexpression von EmGFP.

Das Immunostanding der Kryosektionen zeigte, dass überall dort, wo das Modell erfolgreich rezellularisiert wurde, auch die EmGFP-Expression zu sehen war. Dies ist ein Hinweis auf eine gute AAV-Genexpression. Anschließend wurde der AAV-vermittelte Knockdown von humanem Cyclophilin B mittels quantitativer RT-PCR analysiert.

Der durchschnittliche Knockdown von humanem Cyclophilin B lag zwischen 70 und 90% über alle Lappen der beiden transduzierten Lebern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Verteilung von Viren und viralen Vektoren im vaskularisierten, dreidimensionalen Organsystem zu untersuchen. Solche Studien werden dazu beitragen, die derzeitigen Techniken für den Gentransfer zu verbessern und neue antivirale Strategien zu entwickeln.