Name: Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines dreidimensionalen Lebermodells mit HepG2-Zellen zur Untersuchung viraler Vektoren. Diese Methode ermöglicht humane Genübertragungsstudien und reduziert Tierversuche erheblich.

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Die Autoren danken Bernd Krostitz für die technische Unterstützung, Radoslaw Kedzierski für die ersten Beiträge zum Projekt, Erik Wade für das Korrekturlesen und hilfreiche Kommentare und Prof. Heike Walles für die Bereitstellung des Bioreaktors und das Teilen ihrer wertvollen Erfahrungen mit der Organdezellularisierung. Wir danken auch für die Finanzierung des Projekts und die Veröffentlichung durch die Technische Universität Berlin.

HINWEIS: RL erhalten ethische Genehmigung für die Explantation von Organen aus dem Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Die Lebern wurden von Wistar-Ratten explantiert. Die untere Hohlvene und die Pfortader der Leber wurden mit einer 22 G Kanüle kanüliert. Verfahren zur Dezellularisierung von explantierten Lebern wurden zuvor beschrieben. 4,5 die extrazellulären Matrizes hier verwendet wurden mit 1% Natriumdesoxycholat durch übermäßige Perfusion eines Rattenleber erhalten. 1. Rezellularisierung der extrazellulären Matrix (ECM) von einer Rattenleber <ol><li> Erweiterung der Leberzelllinie HepG2 <ol><li> Kultur der hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2 in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 2 mM Penicillin und Streptomycin, jede. </li><li> Samen 1,5 x 10 7 Zellen in T175 - Flaschen und wachsen , um die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 </sub&gt;. Ernte Zellen nach 4 Tagen durch Trypsinisierung für 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Drehen Sie die Zellen bei 300 g nach unten und resuspendieren sie in 4 ml PBS und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop. Eine T175 Flasche wird etwa 4,5 x 10 7 Zellen ergeben. HINWEIS: Sicherstellen , dass die Kultur für Rezellularisierung der Rattenleber ECM ausreichende Zellzahlen enthält mit 6 x 10 8 HepG2 Zellen pro ECM (10 x 175 cm 2 Kulturflaschen mit 4-5 x 10 8 Zellen pro Stück). </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bioreactor - System. A) Das Bioreaktorsystem war maßgeschneidert. Es erhält die Organmodelle bei 37 ° C und 5% CO 2. Die Strömungsraten der peristaltischen Pumpen können einzeln geregelt werden. B) Die Leber ist in einer Wachstumskammer angeordnet und verbindened zur Perfusionskreislaufes, die aus einer Schlauchpumpe besteht, ein Mittelreservoir, eine Blasenfalle und einem Drucksensor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Rezellularisierung des ECM <ol><li> Stellen Sie den Bioreaktor-System, eine Leber-Perfusionskammer, eine Perfusions-System, ein Reservoir von Medium und eine Blasenfalle enthält. Sterilisieren des Bioreaktors System (121 ° C, 15 min). </li><li> Schließen Sie das Bioreaktorsystem mit einer Schlauchpumpe und legen Sie sie in einen Inkubator geeigneten Bedingungen die Bereitstellung (37 ° C, 5% CO 2). Platzieren dezellularisiert Rattenleber Gerüste 8 in der Leber Perfusionskammer des Bioreaktorsystems (Abbildung 1). </li><li> Schließen Sie den kanülierten Pfortader und Hohlvene mit Schlauchschellen mit dem Perfusionssystem. Äquilibrieren Gerüst mit 150 ml RPMI-Medium (wie in 1.1 beschrieben)über 5 d mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,25 ml / min. </li><li> Trennen Sie das Lebergerüstes aus der Medien Schaltung und impfen das Gerüst mit 3 x 10 8 HepG2 - Zellen (in 5 ml) über die Pfortader eine 5 ml - Spritze, Luftblasenbildung vermieden werden und die Zellen das ECM neu zu besiedeln , indem sie Inkubation 1 Stunde in das Gerüst mit der Pumpe abgeschaltet. </li><li> Erhöhen Sie die Durchflussrate durch die Pumpe eingestellt wird, beginnend mit 1,25 ml / min für 10 min; 2,5 ml / min für 20 min und schließlich 3,75 ml / min für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4-1.2.5 eine Gesamtzellzahl von 6 x 10 8 zu erreichen. </li><li> Führen Sie die Bioreaktorsystem bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,75 ml / min. Kultur der rezellularisiertes Rattenleber für 2 Wochen. HINWEIS: Ersetzen Sie ein Drittel des Mediums mit frischem Medium (50 ml) jeden zweiten Tag. Probe des Kulturmediums physiologische Parameter, wie Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, der pH-Wert von Mediumproben und der Konzentration von Glukose und Laktat zu messen. </li></ol></li></ol> 2. Transduktion der rezellularisiertes Rat Liver <ol start="1"><li> Die Großproduktion von AAV-Vektoren <ol><li> Produzieren, zu reinigen und zu quantifizieren , AAV - Vektoren , wie zuvor beschrieben: 11 <ol><li> AAV-Vektoren in Rollflaschen Kurz gesagt, produzieren und reinigen sie von Iodixanol-Zentrifugation. Entfernen Rest Iodixanol durch Filtration über PD10 Gelfiltrationssäulen. Bestimmung der AAV-Vektor-Konzentration durch qPCR unter Verwendung von genomischer DNA AAV als Standard. HINWEIS: Die selbstkomplementären, pseudotypisierten AAV 2 /6 Vektor in der vorliegenden Studie verwendeten codierten EmGFP als Reporter Transduktionseffizienz und eine shRNA - Expressionskassette für die Zuschlags eines endogen exprimierten Gens (human Cyclophilin B (hCycB), Abbildung 2) zu zeigen , . Achten Sie darauf , eine ausreichende Menge an pseudotypisiertem scAAV Vektoren des Serotyps 6 (2,7 x 10 13 AAV - Vektoren pro Leber - Modell). </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> Abbildung 2. Karte des selbstkomplementären, pseudotypisierten AAV2 / 6 - Vektor in der vorliegenden Studie verwendet. Das Genom besteht aus den Inverted Terminal Repeats (ITR) von AAV2 und codiert EmGFP unter der Kontrolle des CMV - Promotors sowie eine shRNA unter der Kontrolle eines U6 - Promotors. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Transduction von Lebermodell <ol><li> Stellen Sie die AAV - Vektor - Lösung auf eine Endkonzentration von 2,7 x 10 13 Vektorgenomen in 5 ml durch das jeweilige Volumen PBS hinzugefügt wird . </li><li> Trennen Sie die Leber aus der Medienkreislauf durch den Schlauch aus der Kanüle entfernen. Schließen Sie eine 5-ml-Spritze mit der Kanüle der Pfortader und injizieren die vollständige AAV-Vektor-Lösung (5 ml). HINWEIS: Optionally, Phenolrot (5 ug / ml) hinzufügen, um die Verteilung des AAV-Vektor-Lösung in der gesamten Leber zu folgen. </li><li> Inkubieren für 1 Stunde, ohne zu pumpen. Nach und nach Strömungsgeschwindigkeit zu erhöhen, mit 1,25 ml Start / min für 10 min; 2,5 ml / min für 20 min und 3,75 ml / min für 30 min. Kultur der rezellularisiertes Rattenleber über 6 Tage. HINWEIS: Ein Drittel des Mediums ersetzen, wie in Anmerkung unter 1.2.7 gegeben </li></ol></li></ol> 3. Bewertung des rezellularisiertes transduzierten Rattenleber <ol start="1"><li> Hematoxylin und Eosin (HE) Färbung und immunhistochemische Analyse <ol><li> Nehmen Sie Proben (0,5 x 0,5 x 1,5 bis 2 cm) aus jeder Leberlappen mit einem Skalpell. </li><li> Inkubieren Proben (aus 3.1.1) in 4% Paraformaldehyd (PFA) + 4% Saccharose-Lösung für 1,5 h bei 4 ° C. (Achtung: PFA ist giftig und krebserregend immer PFA halten innerhalb einer Abzugshaube und entsprechende Schutzkleidung tragen..) Waschen dreimal mit PBS (1 min pro Waschschritt) und Inkubation in 8%Saccharose über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Gießen Medium in Kunststoff cryomolds Fixierung, legen Sie die Proben in Befestigungsmedium frei von Luftblasen. In Befestigungsmedium, bis Probe wird gut abgedeckt. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 ° C eingebettet. </li><li> Bereiten cryo Schnitte (10 um) mit einem Kryotom 12. Beurteilen Sie Rezellularisierung von Hämatoxylin + Eosin - Färbung 8. Beurteilen Sie Transduktionseffizienz durch immunhistochemische Färbung für das Gen von Interesse (hier: EmGFP). </li></ol></li><li> Molekularbiologische Probenahme <ol><li> Probe jedes Leberlappen mit einem Biopsiestanze (4 mm im Durchmesser). Isolieren der Gesamt - RNA, DNA und Proteine gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Beurteilung der transgenen Expression von EmGFP und hCycB knock down 8. </li></ol></li></ol>

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<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die rekonstituierten 3D-Lebern hier beschrieben liefern ein Modell virale Vektoren in einem humanisierten System zu studieren. Wiederaufforstung der ECM einer Rattenleber mit einem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie erzeugt ein gefäß System, das die Untersuchung großer Biologika ermöglicht. Diese Ergebnisse liefern einen Proof-of-Concept, die das aufgelöste Lebermodell effizient mit einem viralen Vektor transduziert werden. Für die Experimente hier gezeigten jeder Lappen der Leber wurde durch den AAV-Vektor transduziert. Jedoch in einigen Vorversuchen wurden einzelne Lappen nicht mit Zellen neu besiedelt. Es ist daher wichtig, die Zelltrümmer und andere Bestandteile aus Verschließen des Gefäßsystems zu verhindern. Um zu testen, ob alle Lappen perfundiert werden kann, einem nicht-toxischen Farbstoff, wie Phenolrot kann durch das Lebermodell gespült werden. Ein weiterer entscheidender Angelegenheit hält die Leber Gerüst steril. Während der Behandlung mit Ethanol oder Antibiotika disadvantageous für das Gefäßsystem, Bestrahlen der extrazellulären Matrix mit γ-Strahlung bewahrt die Gefäße und sterilisiert die Probe. Darüber hinaus unterscheiden sich die Größe der explantierten Lebern, so dass die Anzahl der Zellen für die Rezellularisierung Verfahrens und der Repopulation Zeit verwendet wird, kann eingestellt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die Rattenlebern in der vorliegenden Studie verwendet werden , sind vergleichsweise groß und erfordern große Mengen an Zellen und Testreagenzien (zB AAV - Vektoren). Darüber hinaus nahm die Neubesiedlung Verfahren mehr als zwei Wochen. Dies begrenzt die Anzahl der Wiederholungen, die mit vertretbarem Aufwand durchgeführt werden kann. Wir schaffen derzeit das Modell für Mäuselebern, die nur etwa ein Fünftel des Volumens des Rattenlebern werden, was die Verwendung von weniger Zellen und weniger Testreagenzien. Obwohl proportional Verkleinerungs der Zellzahl sinnvoll erscheint, müssen die genauen Beträge in furt bestimmt werdenihre Experimente. Ein weiterer Nachteil des vorliegenden Modells ist die Verwendung des hepatozellulären HepG2-Zelllinie. Die Experimente sind noch nicht abgeschlossen, die Verwendung von Hepatozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert zu entwickeln, die ein physiologisch relevanter Modell bieten. Darüber hinaus besteht die Leber von mehreren Zelltypen zusätzlich zu den Hepatozyten, beispielsweise Kupffer - Zellen und sinosoids. Wir gehen davon aus, dass die verschiedenen Zelltypen werden ihre natürlichen Umgebungen neu zu besiedeln, wenn ein ECM mit mehreren Zelltypen rezellularisiertes wird. Das 3D-Lebermodell vereint mehrere Vorteile. Ein wesentlicher Nachteil der herkömmlichen in vivo Modellen ist , dass Tierphysiologie wesentlich von menschlichen Physiologie unterscheidet. Toxische Nebenwirkungen der Behandlung eines menschlichen Patienten kann somit unerkannt bleiben. Dieser Mangel kann durch Rekonstitution des 3D-Lebermodell mit menschlichen Zellen überwunden werden, die eng reflektieren mehr die Biologie von huMann Patienten. Der zweite Vorteil des Lebermodell ist ihr Beitrag zum Tierschutz. Obwohl tierische Bestandteile für die Rekonstitutionsexperimenten erforderlich sind, folgt der Ansatz noch die Ziele des 3R - Prinzips (Replacement, Reduction, Refinement), als überzähligen Tieren verwendet werden können , die für andere Tierversuche geopfert wurden, also keine zusätzlichen Tiere benötigt werden und der Ansatz vollständig vermeidet Leiden der Tiere , die häufig mit in vivo - Experimenten zugeordnet ist. Sphäroide sind ein alternatives Werkzeug zelluläre Prozesse in einem 3D-System zu untersuchen. Jedoch sind Sphäroide nicht vaskularisiert, so daß große Stoffe und Biologika nicht tief in die inneren Teile der Struktur eindringen. Diese Probleme wurden mit dem gefäß 3D Lebermodell überwinden. In den hier beschriebenen Experimenten wurden die AAV-Vektoren untersucht, da sie zu den vielversprechendsten Kandidaten für gentherapeutische sindAnwendungen. Zahlreiche gentherapeutische Ansätze zielen die Leber bei Targeting, beispielsweise zur Behandlung von Infektionen mit Hepatitisviren oder von alpha-1-Antitrypsin - Mangel, die 3D - Leber kann in dem Verfahren dieser AAV Vektorentwicklung verwendet werden. Es ist natürlich auch geeignet für die Untersuchung von anderen hepatotropen virale Vektoren, beispielsweise adenovirale Vektoren. infektiöse Hepatitis-Viren zu studieren, wie Hepatitis B oder C Virus Zusätzlich kann es verwendet werden. Es kann zum Beispiel verwendet werden, neue antivirale Strategien zu entwickeln. Darüber hinaus repräsentieren 3D Organmodelle viel versprechende Werkzeuge neue Zytostatika-Therapeutika zu entwickeln, um Krebs zu behandeln und toxikologische Untersuchungen durchzuführen. Auf lange Sicht, künstliche Leber kann in der regenerativen Medizin als Transplantate verwendet werden. Zusammengefasst bietet das 3D-Lebermodell eine breite Palette von Anwendungen in der Infektionsbiologie und anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung.

Die meisten aktuellen biomedizinischen Forschungen stützen sich auf einen von zwei Ansätzen, entweder zweidimensionale (2D) Zellkulturexperimente oder Tiermodelle, die von Natur aus dreidimensional (3D) sind. Diese Ansätze haben jedoch einige schwerwiegende Nachteile. Es hat sich gezeigt, dass sich Zellen, die in 2D-Kulturen gezüchtet wurden, in Genexpressionsmustern und Zellphysiologie von denen unterscheiden, die unter 3D-Bedingungen gezüchtet wurden. 1 Tiermodelle sind nicht nur mit ethischen Bedenken verbunden, sondern modellieren auch oft nicht gut die menschliche Physiologie. Obwohl das Fehlen offensichtlicher toxischer Wirkungen einer Verbindung vor der ersten Verabreichung beim Menschen in Tiermodellen bestätigt werden muss, wurden in klinischen Studien mehrere Fälle dokumentiert, in denen schwere, manchmal tödliche Nebenwirkungen aufgetreten sind. arabische Ziffer
Um diese Unzulänglichkeiten zu überwinden, sind humanisierte 3D-Ex-vivo-Organmodelle zu wichtigen Forschungswerkzeugen geworden. Wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, ordnen sich Zellen selbst zu 3D-Strukturen an, die als Sphäroide bekannt sind. Diesen Sphäroiden fehlt jedoch ein Gefäßsystem, was die Verteilung von kleinen molekularen Verbindungen, großen Biologika und viralen Vektoren gleichermaßen einschränkt. Zum Beispiel transduzierten adenovirale Vektoren nur die äußeren Zellschichten von Sphäroiden, die aus menschlichen Glioblastomen hergestellt wurden. 3 Eine Lösung für dieses Problem ist die Verwendung eines Organmodells, das ein Gefäßsystem enthält. Zu diesem Zweck kann das interessierende Organ aus einem Tier explantiert werden, und die tierischen Zellen können durch menschliche Zellen ersetzt werden. Es wurden verschiedene Verfahren zur Dezellularisierung von Tierlebern durch Behandlung mit Detergenzien oder Natriumcholat beschrieben. 4-6 Die resultierende extrazelluläre Matrix (ECM) beherbergt Zytokine und Wachstumsfaktoren, die verschiedene zelluläre Prozesse regulieren. 7 Es kann als Gerüst für die Rezellularisierung mit menschlichen Zellen verwendet werden, um ein funktionsfähiges Organmodell zu erhalten.
In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir ein humanisiertes 3D-Lebermodell verwendet, um die Verteilung und Transgenexpression eines Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektors zu untersuchen. 8 AAV-Vektoren gehören zu den vielversprechendsten viralen Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. 9 Die erste und bisher einzige zugelassene gentherapeutische Intervention in der westlichen Welt verwendet einen AAV-Vektor für die Übertragung von Lipoproteinlipase. 10

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Flansch mit Nut</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>modifiziert durch Gaffer</td></tr><tr><td>O-Ring Transparent</td><td>Duran</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>Schnellspanner</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>Flacher Flanschdeckel</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>modifiziert von gaffer</td></tr><tr><td>Schraubgewinderohr</td><td>Duran</td><td>2483802</td><td>modifiziert von gaffer</td></tr><tr><td>Schraubgewinderohr</td><td>Duran</td><td>2483602</td><td>modifiziert von gaffer</td></tr><tr><td>Silikondichtring</td><td>Duran</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschluss</td><td>Duran</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschluss</td><td>Duran</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschluss mit Öffnung</td><td>Duran</td><td></td><td></td>2922709</tr><tr><td>Schraubverschluss mit Öffnung</td><td>Duran</td><td>2922705</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchverbinder</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>Biokompatible Schläuche</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kulturflaschen</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>fötales Kälberserum</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze 4 mm</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin miRNA</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin RNA/DNA Puffer Set</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

studie von viralen vektoren in einem dreidimensionalen modell der leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären karzinom-zelllinie hepg2

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Lebermodell und seine Anwendung auf die Erforschung und Entwicklung von viralen Vektorsystemen. Das Modell wird durch Repopulation die extrazelluläre Matrix eines dezellularisierten Rattenleber mit einem menschlichen Hepatozyten-Zelllinie erhalten. Das Modell ermöglicht Untersuchungen in einem gefäß 3D-Zellsystem zu ersetzen potenziell schädliche Experimente mit lebenden Tieren. Ein weiterer Vorteil ist der humanisierte Natur des Modells, das als Tiermodelle näher an die menschliche Physiologie ist. In dieser Studie zeigen wir die Transduktion dieser Lebermodell mit einem viralen Vektor von Adeno-assoziierten Viren (AAV-Vektor) abgeleitet. Die Perfusion Schaltung, die das 3D-Lebermodell mit Medien versorgt bietet eine einfache Möglichkeit, den Vektor anzuwenden. Das System ermöglicht die Überwachung der wichtigsten Stoffwechselparameter der Leber. Für die endgültige Analyse können Gewebeproben entnommen werden, um das Ausmaß der recellulariza zu bestimmention durch histologische Techniken. Verteilung des Virus-Vektors und die Expression des Transgen geliefert durch quantitative PCR (qPCR), Western-Blotting und Immunhistochemie analysiert werden. Zahlreiche Anwendungen des Vektormodells in der Grundlagenforschung und der Entwicklung gentherapeutischer Anwendungen kann die Entwicklung neuer antiviraler Therapeutika einschließlich in Betracht gezogen werden, die Krebsforschung und die Untersuchung von viralen Vektoren und deren mögliche Nebenwirkungen.

Für die Beurteilung des Ausmaßes der Rezellularisierung, Kryo-Schnitte wurden von jeder Keule jedes rezellularisiertes Lebermodell vorbereitet. Die Schnitte wurden dann mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung analysiert. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, jeder Lappen der Leber der drei Modelle, bezeichnet als TLM1, TLM2 (transduziert Leber Modelle 1 +2) und Ctrl (Control Lebermodell , das rezellularisiertes wurde, aber nicht transduziert) wurden mit HepG2 - Zellen neu besiedelt. Diese hepatozelluläres Karzinom-Zelllinie wurde aus dem Tumorgewebe eines 15-jährigen argentinischen Jungen etabliert. Einige Bereiche der Leber Modelle wurden intensiver rezellularisiertes als andere. Die Gründe für diese Variationen bleiben bestimmt werden. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hämatoxylin und Eosin - Färbung jeder Keule der drei Leber Modelle analysiert TLM1 + 2:. Transduzierten LeberModelle 1 und 2; Ctrl .: Kontrolle Lebermodell, das rezellularisiertes wurde aber nicht transduziert. Maßstabsbalken: 200 &amp; mgr; m. (Re-gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Im nächsten Schritt wurde die Transduktion der Leber Modellen bewertet. Zu diesem Zweck wurde DNA aus 28 Stanzbiopsien von jeder der Leber Modelle vorbereitet und der Vektor-Titer wurde durch qPCR quantifiziert. Im Durchschnitt 55 bis 90 internalisiert Vektorgenome pro Zelle (VG / Zelle) wurden für die zwei transduziert Leber Modelle gemessen. Experimente in der 2D-Zellkultur haben 30 VG / Zelle für starke Transgen-Expression und RNAi-vermittelte Silencing ausreichend sind, gezeigt. Herstellung von EmGFP wurde durch RT-PCR und Western Blotting analysiert. In der Tat, die Expression des Reporter wurde in 80-90% der Biopsien auf der mRNA- und Proteinebene jeweils detektiert.8 Um ein umfassendes Bild der Transduktionseffizienz, Kryo-Schnitte wurden immunhistochemisch analysiert erhalten. Wie in Abbildung 4, Bereiche des Lebermodell gesehen werden , die erfolgreich rezellularisiertes wurden, wie es durch DAPI - Färbung sichtbar gemacht , gab auch eine starke Fluoreszenzsignale in der immunhistochemischen Analyse von EmGFP Expression. Wie erwartet, ist die Kontrolle Lebermodell nicht mit AAV-Vektoren behandelt, zeigten keine EmGFP Ausdruck. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> Abbildung 4. Immunhistochemische Analyse von EmGFP Expressionszellen, die die Leber - Modelle neu besiedelt wurden durch DAPI - Färbung sichtbar gemacht (blau). EmGFP Expression wurde durch immunochemische Färbung (rot) sichtbar gemacht. TLM1 + 2: transduziert Leber Modelle 1 und 2; Ctrl .: Kontrolle Lebermodell, das rezellularisiertes wurde aber nicht transduziert. Maßstabsbalken: 200 &amp; mgr; m. (Neu gedruckt mit Erlaubnisvon Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> In einem abschließenden Test, AAV-vermittelte Knockdown von hCycB wurde durch qRT-PCR analysiert. Der Zuschlag von hCycB wurde zwischen 70 und 90% festgestellt, gemittelt über alle Ausbuchtungen der beiden transduziert Lebermodelle (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> Abbildung 5. RNAi-vermittelten Knockdown von hCycB in AAV-transduzierten 3D - Leber - Modelle. Silencing von hCycB wurde durch qRT-PCR bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) wurden für alle Proben jeder transduziert 3D Lebermodell berechnet (TLM1 bzw. 2) und normalisiert auf den Mittelwert der nicht-transduzierten Steuerung (Ctrl.). (Re-gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die rezellularisierte extrazelluläre Matrix einer dezellularisierten Rattenleber kann als humanisiertes, dreidimensionales ex vivo-Modell verwendet werden, um die Verteilung und Transgenexpression eines Virus oder viralen Vektors zu untersuchen.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein dreidimensionales Lebermodell zur Untersuchung von Viren und viralen Vektoren zu entwickeln. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse in einem vaskularisierten dreidimensionalen System mit menschlichen Zellen, deren Physiologie sich von der von Nagetierzellen in Maus- oder Rattenmodellen unterscheidet. Darüber hinaus stellt sie einen Schritt zur Verbesserung des Tierschutzes dar, da sie Experimente an lebenden Tieren vermeidet und langfristig darauf abzielt, tierische Komponenten vollständig zu ersetzen.Obwohl wir diese Methode zur Untersuchung viraler Vektoren für die Genübertragung entwickelt haben, kann sie auch bei der Erforschung infektiöser Viren und in anderen Forschungsbereichen wie der Krebsforschung angewendet werden. Die Durchführung des Verfahrens wird Viola Rohrs, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Im Sinne des Tierschutzes wurden für die vorliegende Studie nur Überschuss-Tiere verwendet, die im Rahmen anderer Tierversuche getötet wurden, d. h.Es waren keine zusätzlichen Tiere erforderlich, um die Leberscaffolds zu erhalten. Zunächst expandieren Sie die hepatische Zelllinie Hep G2. Impfen Sie 15 Millionen Zellen in T175-Flaschen mit 30 Milliliter Medium, das 10 % Fötales Kälberserum und zwei Millimol Glutamin, Penicillin und Streptomycin enthält. Nach vier Tagen Kultivierung lösen Sie die Zellen durch fünfminütige Einwirkung einer Trypsinlösung unter Kultivierungsbedingungen und ernten sie anschließend.Danach die Zellen bei 300 Gs drei Minuten lang abzentrifugieren. Anschließend resuspendieren Sie sie in vier Milliliter PBS und bestimmen die Zellanzahl. Jede Flasche sollte etwa 45 Millionen Zellen liefern.Für die Rezellularisierung einer Ratten-Leber-ECM werden 600 Millionen Zellen benötigt. Um die ECM zu rezellularisieren, richten Sie zunächst das Bioreaktorsystem ein, das eine Leberperfusionskammer, ein Perfusionssystem, ein Mediumreservoir und einen Blasentrap enthält. Die Rezellularisierung umfasst zwei kritische Schritte.Erstens müssen Luftblasen im Perfusionsystem vermieden werden. Zweitens muss das gesamte System steril gehalten werden. Sterilisieren Sie zunächst diese Komponenten des Bioreaktorsystems bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten.Zweitens füllen Sie die Schläuche und die sterilisierte Perfusionskammer mit Medium. Anschließend platzieren Sie das entzelligte Rattenlebergewebegerüst in die Leberperfusionskammer. Im nächsten Schritt verbinden Sie die kanierte Vena portae mithilfe von Schlauchklemmen mit dem Perfusionsystem.Stellen Sie nun das Bioreaktorsystem in den Inkubator und schließen Sie es an eine peristaltische Pumpe an. Anschließend equilibrieren Sie das Scaffold mit 150 Milliliter supplementiertem Medium über fünf Tage. Stellen Sie den Durchfluss auf 1,25 Milliliter pro Minute ein.Nach fünf Tagen trennen Sie das Bioreaktorsystem von der Pumpe und überführen es in eine sterile Haube. Trennen Sie das Lebergewebegerüst vom Mediumkreislauf. Laden Sie dann eine Spritze mit fünf Milliliter Medium, das 300 Millionen Hep-G2-Zellen enthält, und injizieren Sie die Zellen über die Pfortader, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte.Anschießend die Zellen eine Stunde lang ohne Betrieb der Pumpe die ECM neu besiedeln lassen. Nach einer Stunde die Pumpe mit 1,25 Milliliter pro Minute starten. Nach 10 Minuten den Druck auf 2,5 Milliliter pro Minute erhöhen.Nach weiteren 20 Minuten stellen Sie die Pumpe auf die Betriebsgeschwindigkeit von 3,75 Milliliter pro Minute ein. Nach 30 Minuten bei voller Pumpgeschwindigkeit schalten Sie die Pumpe aus, geben weitere 300 Millionen Zellen hinzu und lassen die Zellen eine Stunde lang die ECM besiedeln. Nach einer Stunde erhöhen Sie die Zirkulation schrittweise durch inkrementelle Anpassungen der Pumpgeschwindigkeit wie zuvor.Lassen Sie nun die Kultur die Leber über einen Zeitraum von zwei Wochen rekolonisieren. Ersetzen Sie alle zwei Tage 50 Milliliter des Mediums und messen Sie die physiologischen Parameter an einer Probe des verwendeten Mediums. Die Herstellung von AAV-Vektoren ist ein komplizierter Prozess, der viele Schritte umfasst, die im Textprotokoll zusammengefasst sind.In diesem Abschnitt des Videos werden einige der entscheidenden Schritte gezeigt. Zunächst stellen Sie die AAV-Vektoren her, reinigen und quantifizieren Sie diese. Kurz gesagt, produzieren Sie die AAV-Vektoren in Rollflaschen und reinigen sie mittels Zentrifugation über einen Iodixanol-Gradienten.Entfernen Sie das restliche Iodixanol durch Filtration über PD10-Gelfiltrationssäulen. Bestimmen Sie anschließend die AAV-Vektor-Konzentration mittels QPCR unter Verwendung genomischer AAV-DNA als Standard. Pro Modell werden insgesamt 27 Billionen AAV-Vektoren benötigt.Transduzieren Sie nun das Lebermodell. Zunächst werden 27 Billionen Vektoren in fünf Millilitern PBS in eine Spritze gefüllt. Phenolrot kann mit 5 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt werden.Trennen Sie dann die Leber vom Mediumkreislauf und injizieren Sie die Vektoren in das System. Nach der Injektion wird das System eine Stunde lang ohne Pumpbetrieb inkubiert. Anschließend erhöhen Sie den Fluss schrittweise, wie zuvor beschrieben.Später, während die transduzierte Leber über sechs Tage inkubiert wird, wechseln Sie alle zwei Tage 50 Milliliter des Mediums. Schneiden Sie mit einem Skalpell Proben aus jedem Leberlappen, die etwa einen halben Zentimeter dick und 1,5 bis zwei Zentimeter lang sind. Inkubieren Sie die Schnitte 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius in 4 % Paraformaldehyd mit 4 % Saccharose.Anschließend die Probe dreimal mit PBS waschen, wobei jede Waschung eine Minute dauert. Im Anschluss daran die Proben über Nacht in 8 % Saccharose bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Proben in Kryokassetten laden, die etwas Fixiermedium enthalten.Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Nach dem Befüllen vollständig die Proben mit Fixiermedium bedecken und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Nach dem Einfrieren bereiten Sie 10 µm dicke Kryoschnitte der Proben mit einem Kryotom vor.Färben Sie die Proben nach Bedarf, um die Rezellularisierung zu bestätigen. Für die Genexpressionanalyse entnehmen Sie Proben mithilfe einer vier Millimeter großen Biopsie-Stanze. Zur Beurteilung der Rezellularisierung wurden Kryoschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.Lappen von zwei transduzierten Lebern und einer Kontrollleber, die rekolonisiert, aber nicht transduziert wurde, wurden alle mit Hep-G2-Zellen besiedelt. Die RNA-Expression und die Vektor-Titer wurden aus 28 Stanzbiopsien aus jedem Lebermodell quantifiziert. In den beiden transduzierten Lebermodellen wurden 55 bzw. 90 Vektorgenome pro Zelle gemessen, was eine ausreichende Vektorlast zur Induktion der Genstilllegung darstellt.Wie erwartet wurden im Kontrollversuch keine Genome gemessen. Die EmGFP-Expression wurde mittels RT-PCR und Western Blot analysiert. Die meisten Biopsien zeigten eine mRNA-Expression von EmGFP sowie eine Proteinausprägung von EmGFP.Die Immunfärbung der Kryoschnitte zeigte, dass überall dort, wo das Modell erfolgreich rekolonisiert wurde, auch die EmGFP-Expression nachweisbar war. Dies deutet auf eine gute AAV-Genexpression hin. Anschließend wurde die durch AAV vermittelte Herunterregulation des menschlichen Cyclophilin B mittels quantitativer RT-PCR analysiert.Die durchschnittliche Herunterregulierung von menschlichem Cyclophilin B lag über alle Lappen der beiden transduzierten Lebern hinweg zwischen 70 und 90 %. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher die Verteilung von Viren und viralen Vektoren im vaskularisierten, dreidimensionalen Organsystem untersuchen konnten. Solche Studien werden dazu beitragen, bestehende Methoden der Genübertragung zu verbessern und neue antivirale Strategien zu entwickeln.

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Forschung

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Krebsforschung

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Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2 (Video) | JoVE Journal

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

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