Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Unser Protokoll untersucht Pilzinfektionen sowohl aus der Wirts- als auch aus der Erregerperspektive, um Wechselwirkungen zwischen den biologischen Systemen zu identifizieren, die für eine Krankheit entscheidend sind. Wir können sowohl Pilz- als auch Wirtsproteine in einem einzigen Experiment nachweisen und Pilzproteine identifizieren, die nur während der Infektion produziert werden und neuartige infektionsassoziierte Proteine darstellen. Obwohl wir uns auf die Behandlung von Pilzinfektionen konzentrieren, indem wir neuartige antivirulente Behandlungsstrategien aufdecken, ist unsere Proteomik- und Bioinformatik-Pipeline universell und könnte auf viele biologische Systeme angewendet werden.

Unser Ansatz legt den Grundstein für Studien zu verschiedenen Krankheitserregern und zahlreichen Immunantworten und kann genutzt werden, um neue Einblicke in die Beziehung zwischen Kryptokokken und dem angeborenen Immunsystem zu gewinnen. Die Reaktion der Makrophagen auf Krankheitserreger und der Nachweis von genügend Pilzproteinen sind wichtig. Daher wird empfohlen, MOIs und Zeitpunkte für jede Art zu testen und zu optimieren.

Da Makrophagen- und Pilzzellkulturen eine Herausforderung darstellen können, ist es wichtig zu wissen, was nach der Kokultur zu erwarten ist. Die Visualisierung gibt dem Forscher Sicherheit bei der Umsetzung des Verfahrens. Um Pilzzellen auf eine Makrophageninfektion vorzubereiten, werden C-Neoformans-Zellen aus einer Kultur in der mittleren Langphase entnommen und zentrifugiert, gefolgt von drei sanften Wäschen mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur unter denselben Zentrifugenbedingungen.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Pilzzellen in einer 1,2-mal 10 bis acht Zellen pro Milliliter antibiotikafreier Zellkultur, mittlerer Konzentration und geben Sie jeweils einen Milliliter Pilzzellsuspension in eine der vier Vertiefungen einer 70 % bis 80 % konfluenten Sechs-Well-Makrophagen-Kulturplatte. Legen Sie die Platte dann für drei Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Kippen Sie die Platte vorsichtig, damit jede Vertiefung dreimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung und Waschgang gewaschen werden kann.

Um die Infektionsfähigkeit nach dem letzten Waschen zu messen, geben Sie einen Milliliter antibiotikafreies Medium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Zu den geeigneten experimentellen Zeitpunkten ist der Überstand aus jeder Vertiefung zu entnehmen und die LDH-Menge in jeder Vertiefung gemäß den Standardprotokollen zu messen. Zu gleichen Zeitpunkten werden die nicht infizierten Makrophagenzellen lysiert, um den Wert für die maximale Zytotoxizität zu bestimmen.

Die Zytotoxizität kann dann mit der angegebenen Formel berechnet werden. Für die Entnahme und Co-Kultur von nicht infizierten Makrophagen geben Sie einen Milliliter kaltes PBS in jede Vertiefung der nicht infizierten Makrophagen. Klopfen Sie nach einer Minute vorsichtig auf die Platte, um die Zellen vom Boden der Wells zu lösen und die Zellsuspensionen in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen zu bündeln.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand vollständig, um ein sofortiges Schockgefrieren des Pellets in flüssigem Stickstoff für eine Lagerung bei minus 80 Grad zu ermöglichen. Die Hauptkomponentenanalyse des Prozesses zur Verarbeitung von Datensätzen zeigt, dass erwartungsgemäß die größte Komponente der Trennung zwischen den Daten infizierte und nicht infizierte Proben sind. Das zweite Unterscheidungsmerkmal der Proben ist ihre biologische Variabilität.

Die Kombination einer Pearson-Korrelation mit einer hierarchischen Clusterbildung nach euklidischer Distanz zeigt ein deutliches Clustering von infizierten und nicht-infizierten Proben mit einer Replikatreproduzierbarkeit von 95 % bis 96 %. Students'T-Test korrigiert für mehrere Hypothesen Tests mit einer Benjamini-Hochberg False Discovery Rate können durchgeführt werden, um Proteine mit signifikanten Unterschieden in der Häufigkeit während der Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen zu identifizieren. In dieser Analyse wurden 117 Wirtsproteine identifiziert, die eine signifikante Veränderung der Expression nach der Infektion zeigten. Bemerkenswert ist auch, dass ein signifikanter Anstieg der Abundanz von Pilzproteinen, wie während der Infektion zu erwarten war, beobachtet wurde.

Es ist wichtig, die Makrophagen während der Kokultivierung, des Waschens und der Probenentnahme schonend zu behandeln. Durch die Definition, wie sich der Erreger an den Wirt anpasst und wie sich dieser gegen eine Infektion wehrt, werden neue Erkenntnisse in den Bereichen Mikrobiologie und Immunologie gewonnen.