Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, optisches Trapping in Kombination mit konfokaler Spinning-Disc-Mikroskopie zu verwenden, um die Interaktionen zwischen Wirtserregern in Echtzeit zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Krankheitserreger auf ein Kammer-Deckglas gegeben werden. Als nächstes wird ein Partikel ausgewählt und mit der optischen Falle eingefangen.

Schließlich wird das Teilchen auf die interessierende Zelle gerichtet. Wie hier zu sehen. Optisches Trapping kann eine effektive Methode zur Kontrolle von zwei Partikeln zur Beobachtung dynamischer intrazellulärer Wechselwirkungen sein.

Diese Methode kann wichtige Fragen zu Wirtserreger-Interaktionen in den Bereichen Infektionskrankheiten und Immunologie beantworten, einschließlich der Frage, welche Auswirkungen es auf die Phagozytose hat, wenn eine vollständige Kontrolle der räumlichen Beziehungen zwischen Wirtszellen und Krankheitserregern erreicht wird, sowie ob die Reihenfolge der Erreger, die von einer phagozytären Zelle aufgenommen werden, die phasomale Reifung beeinflusst. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Fangbedingungen für verschiedene Zell- und Kügelchentypen optimiert werden müssen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist ebenso wichtig wie der Prozess zum Einrichten und Integrieren einer rotierenden Scheibe.

Konfokal zu einer optischen Falle ist aufgrund der präzisen Ausrichtung, die für alle optischen Komponenten erforderlich ist, schwer zu konzentrieren. Ernte den Erreger von Interesse. Hier werden zum Beispiel 300 Mikroliter Canada albicans, die über Nacht in Brühe gezüchtet wurden, aus der Kultur genommen und die Erreger in ein 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen überführt.

Dann waschen Sie die Erreger dreimal bei etwa 1300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, wobei der Überstand aspiriert und das Pellet ungestört bleibt, jedes Mal resuspendiert und beschallt. Nach der dritten Wäsche wird das Pellet in 500 Mikrolitern PBS durch eine Wiederbelebung suspendiert. Als nächstes lösen Sie ein Milligramm des Farbstoffs Entrust in 100 Mikrolitern Dimethylformamid für eine Endkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter.

Geben Sie dann drei Mikroliter des Farbstoffgemisches in das Reaktionsgefäß mit den gewaschenen Erregern. Legen Sie eine Folie um die Röhrchen, da die Farbstoffe lichtempfindlich sind, und schütteln Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, dann pelletieren und waschen Sie die Probe wie zuvor in PB S3 mal. Suspendieren Sie das Pellet nach der letzten Wäsche in 300 Mikrolitern PBS.

Das Medium Tryin und PVS im Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmen. Eine 10 Zentimeter große Gewebekulturplatte, die zweimal mit rohen 2, 6, 4, 0,7 Makrophagen beschichtet ist, wobei PBS das PBS zwischen jedem Waschgang aspiriert. Bedecken Sie anschließend die Plattenoberfläche mit fünf Millilitern Trypsin und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Zellen von der Plattenoberfläche zu lösen. Achten Sie darauf, das Trypsin nicht außerhalb der Platte zu spritzen. Geben Sie nun fünf Milliliter Medium auf die Platte und geben Sie das Gemisch in ein Reaktionsgefäß.

Nach dem Pelletieren saugen die Zellen das Medium an, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird, und resuspendieren das Pellet in 10 Millilitern Medien. Geben Sie 400 Mikroliter Medium in jede Kammer eines Kammerobjektträgers und fügen Sie dann fünf Mikroliter der Zellsuspension in jede Kammer hinzu. Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 wachsen.

Entnehmen Sie den Kammerobjektträger aus dem Inkubator: Pipette und geben Sie fünf bis 10 Mikroliter der zuvor vorbereiteten, fluoreszenzmarkierten Krankheitserreger in jede Kammer mit Makrophagen. Mischen Sie die Makrophagen und Krankheitserreger gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, wobei Sie darauf achten sollten, den Boden der Kammer nicht zu berühren und die anhaftenden Makrophagen zu stören. Schalten Sie alle Komponenten des konfokalen Spinning-Disc-Mikroskops ein.

Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie Öl in die Öl-Immersionsobjektivlinse geben. Setzen Sie den Objektträger in den Spezialtisch ein und entfernen Sie dann die Oberseite des Kammer-Objektträger-Ausrichtungsmikroskops für die DIC-Bildgebung. Schalten Sie den Verschluss für die optische Falle und den IR-Laser ein.

Öffnen Sie dann den Verschluss am Laser zur optischen Falle. Vergewissern Sie sich, dass der Verschluss vor dem IR-Laser geschlossen ist, indem Sie dies mit der IR-Karte überprüfen. Fokussieren Sie sich nun auf die Makrophagen auf dem verklebten Objektträger.

Suchen Sie dann die Erreger frei in der Lösung neben Makrophagen schwimmend. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, aufgrund der Adhäsionskräfte zwischen dem Objekt und dem Deckglas in der Probenkammer das richtige Objekt für die Verfolgung in der Probenkammer zu finden. Um dieses Objekt zu bewegen, musst du die Bühne bewegen, während das Objekt vom Verkehrslaser gehalten wird, und es ist auch wichtig zu beachten, dass du die Bühne langsam genug bewegen musst, so dass die Widerstandskraft der Bühne die maximale Einklemmkraft der Falle nicht überschreitet.

Bewegen Sie die Bühne so, dass sich der Erreger in der Nähe der Falle befindet. Öffnen Sie dann den Verschluss und rasten Sie die Falle ein. Bewegen Sie die Probe, um die Makrophagen mit einem stationären Bild des gefangenen Erregers in Kontakt zu bringen.

Die Erreger mit einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop entweder in DIC-Fluoreszenz oder einer Kombination aus beiden separaten Populationen von Canada albicans, die typischerweise etwa fünf Mikrometer groß sind, wurden grün, blau und rot markiert. Zur Veranschaulichung der Bildgebung wurde ein einzelner C albicans gefangen und in einem quadratischen Muster durch eine Gruppe anderer Hefen bewegt, wie durch die grauen Pfeile angezeigt, was die Fähigkeit demonstriert, den spezifischen Ort eines einzelnen vom Bediener gewählten Erregers auch in einer überfüllten Umgebung zu erfassen und zu manipulieren. Um die Flexibilität dieses Systems zur Erfassung der unterschiedlichen Formmorphologien, die pathogene Organismen in dieser Abbildung aufweisen, weiter zu veranschaulichen, wurde die optische Pinzette verwendet, um ein C albicans-Partikel mit einer Pseudohyphy zu halten und zu positionieren.

Das C albicans wird mit rotem Farbstoff markiert und entlang einer Bahn, die durch den weißen Pfeil umrandet ist, bewegt und neben fluoreszierenden GFPL C3-Rohzellen platziert. In Grün. Der Hefeanteil der Albianer wurde eingeschlossen, als die Pseudohyphy mitzog.

Aspergillus fum goddess wurde auch neben einer rohen Maus-Makrophagenzelle positioniert, um den absoluten Zeitrahmen der Phagozytose mit dieser speziellen Zelllinie und diesem Erreger zu analysieren. In dieser Abbildung zeigen Hellfeldbilder, wie der gefangene Aspergillus, wie durch den weißen Pfeil angezeigt, bewegt und entlang des Pfades positioniert wurde, wie durch den roten Pfeil angezeigt. Der eingeschlossene Erreger ist leicht unscharf, da die Falle den Organismus leicht über die Brennebene schiebt.

Aspergillus wurde so lange bewegt, bis es neben der gewünschten Rohzelle platziert wurde. Sobald der Erreger Kontakt mit der Zelle aufnahm, wurde die Falle ausgeschaltet. Der Phagozytoseprozess wurde aktiviert und die Zeitrafferbildgebung wurde eingesetzt, um die nachfolgenden zellulären Ereignisse zu beobachten.

Nach 30 Sekunden begann sich die Membran der Rohzelle zu verändern und einen Becher um das Partikel zu bilden. Nach 60 Sekunden war der Becher vollständig geformt. Von 90 Sekunden bis 150 Sekunden wurde der Afu Gotti verschlungen und nach 180 Sekunden war das Teilchen vollständig verinnerlicht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine optische Spinning-Disc-Fallenvorrichtung erstellt und wie ein solches Instrument es ermöglichen kann, Krankheitserreger für die Bildgebung lebender Zellen nach seiner Entwicklung nicht-invasiv zu kontrollieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Wirt-Erreger-Interaktionen den Weg, um die Rolle der räumlichen Beziehungen zwischen Wirtszellen und Krankheitserregern und ihre Rolle bei der daraus resultierenden Immunantwort zu untersuchen.