Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu untersuchen, ob flüchtige Anästhetika eine bestimmte Synopse stärker stören als andere, um zu bestimmen, ob ihre Wirkungen zelltyp- oder signalwegspezifisch sind, und um zu bestimmen, welche Effekte auf Populationsebene auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Spezifität, mit der wir die Wirkung von flüchtigen Anästhetika beurteilen können. Wir können bestimmte Signalwege und Zelltypen gezielt untersuchen und gleichzeitig die Aktivität der Population testen.

Beginnen Sie damit, den Gewebeblock für den Schnitt vorzubereiten. Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus der Schädelhöhle und legen Sie es auf das Filterpapier. Machen Sie einen Schnitt entlang der Sagittalebene des Gehirns parallel zur Mittellinie und platzieren Sie den Gewebeblock auf dieser Sagittalebene.

Führen Sie das Filterpapier über die blockierende Vorlage und richten Sie das Gehirn an der zugrunde liegenden Vorlagenkontur aus. Machen Sie einen parallelen Schnitt in der koronalen Ebene, wie durch die Linien auf der Schablone angezeigt, und fügen Sie bei Bedarf einen kleinen Tropfen Scheiben-aCSF hinzu, um das Filterpapier feucht zu halten. Legen Sie den Gewebeblock in ein vier Grad Celsius heißes aCSF und tragen Sie eine kleine Menge Kleber auf den eiskalten Probentisch auf.

Heben Sie den Gewebeblock vom aCSF ab und leiten Sie die überschüssige Lösung mit einer Ecke eines saugfähigen Handtuchs ab. Kleben Sie die hintere koronale Ebene des Gewebeblocks mit der dorsalen Oberfläche des Gehirns zur Saphirklinge auf das Probenstadium. Sammeln Sie 500 Mikrometer dicke koronale Hirnschnitte und legen Sie sie auf ein Nylonnetz in 34 Grad Celsius Schnitt aCSF.

Lassen Sie den Behälter Raumtemperatur erreichen. Zur Herstellung von experimentellen aCSF-Beuteln mit gelöstem Isofluran werden 600 Milliliter experimentelles aCSF und 600 Milliliter eines 95%igen Sauerstoff- und 5%Kohlendioxid-Gasgemisches in einen leeren Polytetrafluorethylen-Gasbeutel gegeben. Beschriften Sie dieses Beutelsteuerelement.

Geben Sie 300 Milliliter experimentelles aCSF in einen anderen Polytetrafluorethylen-Gasbeutel und beschriften Sie diesen Beutel mit Isofluran. Fahren Sie mit der Vorbereitung des Isofluranbeutels gemäß den Anweisungen des Manuskripts fort. Konfigurieren Sie die Lichtsimulationsprotokolle, indem Sie jedem Profil nach dem Zufallsprinzip Wellenformen zuweisen.

Jedes Profil mit der ihm zugewiesenen Wellenform entspricht einem Triggerimpuls von einem digitalen TTL-Eingang oder einem Versuch. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Profilsequenz. Um die Mehrkanalsonde in den ex vivo Hirngewebe-Objektträger zu platzieren, perfundieren Sie blasenförmiges experimentelles aCSF mit drei bis sechs Millilitern pro Minute und übertragen Sie die Hirnscheibe mit dem interessierenden Bereich auf das Netzgitter in der Perfusionskammer des Mikroskops.

Verankern Sie die Gehirnscheibe mit einer Platinharfe. Drehen Sie das Maschengitter so, dass die Linie der Elektrodenkontakte am distalen Ende der Mehrkanalsonde ungefähr senkrecht zur Schäloberfläche verläuft. Senken Sie die Mehrkanalsonde unter Breitfeldbeleuchtung und Feinsteuerung des Mikromanipulators in Richtung der Oberfläche der Scheibe ab.

Den entsprechenden Filterwürfel zur Visualisierung des fluoreszierenden Reporterproteins aktivieren, das in den Axonendigungen kortikaler Afferenzen exprimiert wird. Drehen Sie bei Bedarf die Scheibe, um die Sonde genauer auf die Schäloberfläche auszurichten. Positionieren Sie die Sonde knapp über der Ebene der Schnitte, die 200 Mikrometer von der endgültigen Zielposition entlang der x-Achse entfernt ist, und lassen Sie mindestens einen Kanal außerhalb des zu erfassenden Gewebebereichs.

Führen Sie die Sonde langsam entlang ihrer Längsachse in die Scheibe ein. Um eine Schädigung des Gewebes zu minimieren, schieben Sie die Sonde nur so weit vor, dass die scharfen Spitzen gerade noch unter der Gewebeoberfläche sichtbar sind. Schalten Sie die experimentelle aCSF-Quelle auf die Kontrolllösung in Beuteln um und identifizieren Sie die fluoreszenzmarkierte Zelle für die gezielte Patch-Clamp-Aufnahme.

Beschränken Sie die Blende auf den kleinsten Durchmesser und schalten Sie das Hochleistungs-Wasserimmersionsobjektiv ein, wobei Sie darauf achten, dass kein Kontakt zwischen der Mehrkanalsonde und der Objektivlinse entsteht. Bringen Sie das Gewebe in den Fokus. Zentrieren Sie das Licht auf einen Gewebebereich, der an die Mehrkanalsonde angrenzt, diese aber nicht überlappt.

Aktivieren Sie das entsprechende Filterset, um die Bildgebung von Zellen zu ermöglichen, die den Cre-abhängigen Fluoreszenzmarker exprimieren. Heben Sie die Objektivlinse an, um ausreichend Platz zum Absenken einer Patch-Pipette zu schaffen. Laden Sie eine Patch-Pipette mit interner Lösung und montieren Sie sie auf den Elektrodenhalter.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um einen Überdruck auszuüben, der etwa 0,1 Milliliter Luft entspricht. Senken Sie die Patch-Pipette in die Lösung, bringen Sie die Spitze unter visueller Führung in den Fokus und machen Sie eine Ganzzellaufzeichnung von der Zielzelle. Die in diesem Protokoll verwendeten Tiere exprimierten das fluoreszierende Reporterprotein tdTomato entweder in Somatostatin- oder Parvalbumin-positiven Interneuronen.

Diese Interneurone wurden unter visueller Kontrolle mit dem entsprechenden Filterwürfel für die Patch-Klemmung ins Visier genommen. Postsynaptische Potentiale wurden in Interneuronen als Reaktion auf eine Folge von vier Zwei-Millisekunden-Lichtpulsen beobachtet. Auch lokale Feldpotentiale wurden erfasst.

Die Dichte der Stromquelle und die Aktivität mehrerer Einheiten wurden aus lokalen Feldpotentialen extrahiert. Die Amplitude der Stromsenken, die aus der Dichte der Stromquelle extrahiert wurden, nahm in Abhängigkeit von der Lichtintensität zu. Eine nichtlineare logistische Gleichung mit drei Parametern wurde an die Daten angepasst, um Vergleiche zwischen den Pfaden zu ermöglichen.

Die postsynaptische Potentialamplitude nahm ebenfalls mit der Amplitude der Stromsenke zu. Synaptische Reaktionen auf die thalamokortikalen und kortiko-kortikalen Inputs wurden unter Kontroll-, Isofluran- und Erholungsbedingungen gemessen. Postsynaptische Reaktionen von Somatostatin- und kortiko-kortikalen Stimuli und die evozierten Stromsenken wurden unter Isofluranbedingungen unterdrückt.

Bei der Aufbereitung der Hirnschnitte steht die Gesunderhaltung des Gewebes im Vordergrund. Es ist wichtig, das Gewebe während des gesamten Schneidevorgangs kühl zu halten und schnell zu arbeiten, ohne das Gewebe zu beschädigen. Extrazelluläre Mehrkanalaufzeichnungen können auf verschiedene Weise nachbearbeitet werden.

Zum Beispiel isoliert die Hochpassfilterung des Breitbandsignals die Populations-Spiking-Aktivität, während die Berechnung der aktuellen Quellendichte die synaptische Aktivität hervorhebt. Zusammen haben diese Techniken es uns ermöglicht, die anästhetische Wirkung auf bestimmte isolierte Komponenten kortikaler Schaltkreise zu untersuchen und Einblicke in die Mechanismen zu geben, die dem Bewusstseinsverlust in vivo zugrunde liegen.