Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

Nur ein kleiner Bruchteil der therapeutischen Antikörper wird vom Gehirn aufgenommen. Bei unserer Methode werden Antikörper in das Gehirn abgegeben, indem die Blut-Hirn-Schranke vorübergehend geöffnet wird. Diese Technik ermöglicht es uns, Antikörper auf nicht-invasive Weise in das Gehirn von Mäusen zu bringen.

Um die Qualitätskontrolle der Mikroblasen mit einem Zellzähler durchzuführen, entfernen Sie die Mikroblasenlösung aus dem Amalgamator und stechen Sie mit einer 19-Gauge-Nadel in das Septum des Fläschchens mit Mikroblasenlösung. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 100 Mikroliter der Mikroblasen in fünf Millilitern gefilterter Fließlösung zu verdünnen, und pipettieren Sie 100 Mikroliter der verdünnten Mikroblasenlösung in 10 Milliliter gefilterter Fließlösung in einer Küvette. Verriegeln Sie die Küvette auf der Zellzählerplattform und stellen Sie sicher, dass eine 30-Mikrometer-Apertur für die Probenentnahme verwendet wird.

Laden Sie in der Software die Standardbetriebsmethode und wählen Sie Standardarbeitsmethode und Konzentration bearbeiten. Geben Sie 5.000 Mal für die Verdünnung ein und klicken Sie auf Anwenden und OK. Klicken Sie auf Info bearbeiten, um einen geeigneten Dateinamen auszuwählen. Wählen Sie Vorschau und stellen Sie sicher, dass die Probenkonzentration der Mikroblase weniger als 10 % beträgt. Wählen Sie Start und OK, um die Probenaufnahme zu starten.

Spülen Sie nach der Messung die Öffnung des Küvettenzählers mit gefilterter Strömungslösung. Die Küvette mit verdünnter Mikroblasenlösung 30 Sekunden lang in einem Wasserbad beschallen. Messen Sie die beschallte Mikroblasenlösung wie gezeigt und klicken Sie auf Info bearbeiten, um die Daten als leer zu kennzeichnen.

Subtrahieren Sie nach der Messung des Rohlings die endgültige Anzeige von der ursprünglichen Anzeige, um alle Partikel auszuschließen, bei denen es sich nicht um Mikroblasen handelt. Um die Schnitte mit fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörpern zu markieren, markieren Sie ein Milligramm Maus-IgG-Antikörper mit Alexa Flour 647 in 0,1 molaren Natriumbicarbonatpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation wird die fluoreszenzmarkierte Antikörperlösung auf eine Spin-Säule geladen und der Antikörper durch Zentrifugation aufgereinigt.

Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die Proteinkonzentration zu messen. Um das fokussierte Scanning-Ultraschallsystem einzurichten, fügen Sie dem Wasserbolus einen Abstand von fünf Millimetern hinzu, um den Ultraschallfokus neun Millimeter unter dem Boden des Wasserbolus zu positionieren. Füllen Sie den Wasserbolus mit ca. 300 Millilitern entgastem deionisiertem Wasser und setzen Sie das ringförmige Array in den gefüllten Wasserbolus ein.

Überprüfen Sie mit einem Zahnspiegel, ob sich keine Luftblasen auf der Oberfläche befinden, und starten Sie die Anwendungssoftware. Wählen Sie im Wellenformmenü die Option "Wellenform-Tastverhältnis einstellen" und stellen Sie die Impulswiederholfrequenz auf 10 Hertz, die Einschaltdauer auf 10 %, den Fokus auf 80 Millimeter, die Mittenfrequenz auf ein Megahertz, die Amplitude auf 0,65 Megapascal und den mechanischen Index auf 0,65 ein. Drücken Sie Set, um die Wellenform zu definieren und die Wellenform im Speicher zu speichern.

Nachdem Sie den Behandlungsplan ausgewählt haben, öffnen Sie die Registerkarte "Scan" im Motion-Controller-Fenster und geben Sie die Start-, Stopp- und Inkrementwerte für die Bewegung in der X-Dimension und die Start-, Stopp- und Inkrementwerte für die Bewegung in Y-Richtung ein. Um die Aktionen für die Behandlungsstellen zu definieren, klicken Sie auf Ereignis und öffnen Sie das Skriptbearbeitungsfenster. Wählen Sie eine Liste von Aktionen aus, die in der Reihenfolge ausgeführt werden, die an jedem Behandlungsort ausgewählt wurde, und legen Sie den Bewegungstyp auf Raster-Raster fest.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Ereignisse" die Option "Aktionen hinzufügen" aus und verschieben Sie die ARB-Aktionen "Synchron starten"-Trigger "Warten und Stoppen" in den Skriptbereich. Klicken Sie dann auf Warteaktion und wählen Sie eine Wartezeit von 6.000 Millisekunden aus. Um ein Tier auf die Analyse vorzubereiten, verwenden Sie nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf das Einklemmen der Zehen bei einer anästhesierten Maus einen Permanentmarker, um die Mitte des Kopfes zu beschriften, kleben Sie dann Plastikfolie mit dem unteren Ausschnitt auf den Boden eines kleinen Wägeschiffchens und füllen Sie das Wägeschiffchen mit Ultraschallgel.

Für eine fokussierte Ultraschallbehandlung drehen Sie das Fläschchen mit den Mikroblasen um und füllen Sie vorsichtig einen Mikroliter der Lösung pro Gramm Körpergewicht der Maus in eine 29-Gauge-Insulinspritze. Geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzmarkierten Antikörper in die Spritze und drehen Sie die Spritze vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger, um den Antikörper und die Mikroblasen in der Spritze zu mischen. Injizieren Sie vorsichtig und langsam retroorbital 150 Mikroliter der Mikroblasen- und Antikörperlösung in die Maus und stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.

Tragen Sie eine Augensalbe auf, setzen Sie die Maus in die Kopfhalterung und fixieren Sie ihre Nase in der Halterung. Platzieren Sie das kleine, mit Ultraschallgel gefüllte Wägeschiffchen auf dem Kopf und senken Sie den Wasserbolus ab, bis es auf dem Ultraschallgel in der Waage sitzt. Verwenden Sie dann den Joystick, um den Wandlerfokus visuell in der Mitte des Kopfes auszurichten.

Wenn der Timer abgelaufen ist, wählen Sie auf der Registerkarte "Bewegung" der Software die Option "Ursprung zurücksetzen" und wählen Sie einen vollständigen Scan aus. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie die Maus in eine erwärmte Aufwachkammer. Hier werden repräsentative Ergebnisse aus den Kulturgegenmessungen der Größe und Konzentration gezeigt, die bei korrekter Herstellung der Mikrobläschen erhalten werden können.

Die Antikörperaufnahme durch das Gehirn kann mit einem Infrarotscanner oder einer Fluoreszenzmikroskopie der Schnitte im gesamten Gehirn oder im Gewebe leicht sichtbar gemacht werden. Wie in diesen Bildern gezeigt, kann die repräsentative Färbung auf Mikroglia-Marker verwendet werden, um zu bestimmen, ob Mikroglia nach der Verabreichung des Antikörpers phagozytärer werden. Es ist wichtig, das Wohlergehen und die Sicherheit der Tiere zu gewährleisten, insbesondere wenn die retroorbitalen Injektionen durchgeführt und der Schallkopf über den Köpfen der Mäuse angebracht wird.

Diese Methode ermöglicht die Anwendung verschiedener Scanmuster, um verschiedene Regionen des Gehirns zu treffen, wie z. B. den Hippocampus, den Kortex oder einzelne Gehirnhälften. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Therapien und Medikamente zu entwickeln, die die Blut-Hirn-Schranke durchdringen, und um den Mechanismus der Bildung und Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen.