Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall
18. Juli 2020
Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.
Nur ein kleiner Bruchteil der therapeutischen Antikörper wird vom Gehirn aufgenommen. Bei unserer Methode werden Antikörper in das Gehirn abgegeben, indem die Blut-Hirn-Schranke vorübergehend geöffnet wird. Diese Technik ermöglicht es uns, Antikörper auf nicht-invasive Weise in das Gehirn von Mäusen zu bringen.
Um die Qualitätskontrolle der Mikroblasen mit einem Zellzähler durchzuführen, entfernen Sie die Mikroblasenlösung aus dem Amalgamator und stechen Sie mit einer 19-Gauge-Nadel in das Septum des Fläschchens mit Mikroblasenlösung. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 100 Mikroliter der Mikroblasen in fünf Millilitern gefilterter Fließlösung zu verdünnen, und pipettieren Sie 100 Mikroliter der verdünnten Mikroblasenlösung in 10 Milliliter gefilterter Fließlösung in einer Küvette. Verriegeln Sie die Küvette auf der Zellzählerplattform und stellen Sie sicher, dass eine 30-Mikrometer-Apertur für die Probenentnahme verwendet wird.
Laden Sie in der Software die Standardbetriebsmethode und wählen Sie Standardarbeitsmethode und Konzentration bearbeiten. Geben Sie 5.000 Mal für die Verdünnung ein und klicken Sie auf Anwenden und OK. Klicken Sie auf Info bearbeiten, um einen geeigneten Dateinamen auszuwählen. Wählen Sie Vorschau und stellen Sie sicher, dass die Probenkonzentration der Mikroblase weniger als 10 % beträgt. Wählen Sie Start und OK, um die Probenaufnahme zu starten.
Spülen Sie nach der Messung die Öffnung des Küvettenzählers mit gefilterter Strömungslösung. Die Küvette mit verdünnter Mikroblasenlösung 30 Sekunden lang in einem Wasserbad beschallen. Messen Sie die beschallte Mikroblasenlösung wie gezeigt und klicken Sie auf Info bearbeiten, um die Daten als leer zu kennzeichnen.
Subtrahieren Sie nach der Messung des Rohlings die endgültige Anzeige von der ursprünglichen Anzeige, um alle Partikel auszuschließen, bei denen es sich nicht um Mikroblasen handelt. Um die Schnitte mit fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörpern zu markieren, markieren Sie ein Milligramm Maus-IgG-Antikörper mit Alexa Flour 647 in 0,1 molaren Natriumbicarbonatpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation wird die fluoreszenzmarkierte Antikörperlösung auf eine Spin-Säule geladen und der Antikörper durch Zentrifugation aufgereinigt.
Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die Proteinkonzentration zu messen. Um das fokussierte Scanning-Ultraschallsystem einzurichten, fügen Sie dem Wasserbolus einen Abstand von fünf Millimetern hinzu, um den Ultraschallfokus neun Millimeter unter dem Boden des Wasserbolus zu positionieren. Füllen Sie den Wasserbolus mit ca. 300 Millilitern entgastem deionisiertem Wasser und setzen Sie das ringförmige Array in den gefüllten Wasserbolus ein.
Überprüfen Sie mit einem Zahnspiegel, ob sich keine Luftblasen auf der Oberfläche befinden, und starten Sie die Anwendungssoftware. Wählen Sie im Wellenformmenü die Option "Wellenform-Tastverhältnis einstellen" und stellen Sie die Impulswiederholfrequenz auf 10 Hertz, die Einschaltdauer auf 10 %, den Fokus auf 80 Millimeter, die Mittenfrequenz auf ein Megahertz, die Amplitude auf 0,65 Megapascal und den mechanischen Index auf 0,65 ein. Drücken Sie Set, um die Wellenform zu definieren und die Wellenform im Speicher zu speichern.
Nachdem Sie den Behandlungsplan ausgewählt haben, öffnen Sie die Registerkarte "Scan" im Motion-Controller-Fenster und geben Sie die Start-, Stopp- und Inkrementwerte für die Bewegung in der X-Dimension und die Start-, Stopp- und Inkrementwerte für die Bewegung in Y-Richtung ein. Um die Aktionen für die Behandlungsstellen zu definieren, klicken Sie auf Ereignis und öffnen Sie das Skriptbearbeitungsfenster. Wählen Sie eine Liste von Aktionen aus, die in der Reihenfolge ausgeführt werden, die an jedem Behandlungsort ausgewählt wurde, und legen Sie den Bewegungstyp auf Raster-Raster fest.
Wählen Sie auf der Registerkarte "Ereignisse" die Option "Aktionen hinzufügen" aus und verschieben Sie die ARB-Aktionen "Synchron starten"-Trigger "Warten und Stoppen" in den Skriptbereich. Klicken Sie dann auf Warteaktion und wählen Sie eine Wartezeit von 6.000 Millisekunden aus. Um ein Tier auf die Analyse vorzubereiten, verwenden Sie nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf das Einklemmen der Zehen bei einer anästhesierten Maus einen Permanentmarker, um die Mitte des Kopfes zu beschriften, kleben Sie dann Plastikfolie mit dem unteren Ausschnitt auf den Boden eines kleinen Wägeschiffchens und füllen Sie das Wägeschiffchen mit Ultraschallgel.
Für eine fokussierte Ultraschallbehandlung drehen Sie das Fläschchen mit den Mikroblasen um und füllen Sie vorsichtig einen Mikroliter der Lösung pro Gramm Körpergewicht der Maus in eine 29-Gauge-Insulinspritze. Geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzmarkierten Antikörper in die Spritze und drehen Sie die Spritze vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger, um den Antikörper und die Mikroblasen in der Spritze zu mischen. Injizieren Sie vorsichtig und langsam retroorbital 150 Mikroliter der Mikroblasen- und Antikörperlösung in die Maus und stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.
Tragen Sie eine Augensalbe auf, setzen Sie die Maus in die Kopfhalterung und fixieren Sie ihre Nase in der Halterung. Platzieren Sie das kleine, mit Ultraschallgel gefüllte Wägeschiffchen auf dem Kopf und senken Sie den Wasserbolus ab, bis es auf dem Ultraschallgel in der Waage sitzt. Verwenden Sie dann den Joystick, um den Wandlerfokus visuell in der Mitte des Kopfes auszurichten.
Wenn der Timer abgelaufen ist, wählen Sie auf der Registerkarte "Bewegung" der Software die Option "Ursprung zurücksetzen" und wählen Sie einen vollständigen Scan aus. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie die Maus in eine erwärmte Aufwachkammer. Hier werden repräsentative Ergebnisse aus den Kulturgegenmessungen der Größe und Konzentration gezeigt, die bei korrekter Herstellung der Mikrobläschen erhalten werden können.
Die Antikörperaufnahme durch das Gehirn kann mit einem Infrarotscanner oder einer Fluoreszenzmikroskopie der Schnitte im gesamten Gehirn oder im Gewebe leicht sichtbar gemacht werden. Wie in diesen Bildern gezeigt, kann die repräsentative Färbung auf Mikroglia-Marker verwendet werden, um zu bestimmen, ob Mikroglia nach der Verabreichung des Antikörpers phagozytärer werden. Es ist wichtig, das Wohlergehen und die Sicherheit der Tiere zu gewährleisten, insbesondere wenn die retroorbitalen Injektionen durchgeführt und der Schallkopf über den Köpfen der Mäuse angebracht wird.
Diese Methode ermöglicht die Anwendung verschiedener Scanmuster, um verschiedene Regionen des Gehirns zu treffen, wie z. B. den Hippocampus, den Kortex oder einzelne Gehirnhälften. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Therapien und Medikamente zu entwickeln, die die Blut-Hirn-Schranke durchdringen, und um den Mechanismus der Bildung und Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine Methode zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) in Mausmodellen, um die Verabreichung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zu erleichtern und Mikroglia zu aktivieren. Die Methode ermöglicht eine nichtinvasive Verabreichung und Überwachung der Antikörperaufnahme im Gehirn durch histologische Techniken.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaft
- Immunologie
- Therapeutische Verabreichung
Hintergrund
- Die Blut-Hirn-Schranke begrenzt die Aufnahme von therapeutischen Antikörpern im Gehirn.
- Mikroglia spielt eine kritische Rolle bei der Immunantwort des Gehirns.
- Aktuelle Methoden zur Öffnung der BHS und Antikörperabgabe sind begrenzt.
- Fluoreszente Markierung unterstützt die Visualisierung der Antikörperaufnahme und Mikroglia-Aktivierung.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der BHS für die Antikörperabgabe zu entwickeln.
- Mikroglia in einer kontrollierten experimentellen Umgebung zu aktivieren.
- Die Wirksamkeit dieser Verabreichungsmethode durch Histologie zu evaluieren.
Verwendete Methoden
- Die Methodik beinhaltet fokussierten Ultraschall und Mikroblaseninjektion in das Mausgehirn.
- Das verwendete biologische Modell sind narkotisierte Mäuse.
- Schlüsselschritte umfassen die Herstellung von Mikroblasen und Antikörpern sowie sorgfältige Ultraschallzielsetzung.
- Fluoreszente Antikörper werden gereinigt und visualisiert, um die Interaktion mit Mikrogliazellen zu messen.
Hauptergebnisse
- Die Technik zeigte erfolgreich die Antikörperabgabe in das Gehirn.
- Mikroglia zeigte nach Antikörpergabe erhöhte phagozytische Aktivität.
- Visualisierungstechniken bestätigten eine effektive Lokalisierung und Aufnahme von Antikörpern.
- Scan-Muster ermöglichten die Zielsetzung auf spezifische Hirnregionen und erweiterten potenzielle therapeutische Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet eine zuverlässige Methode zur Verbesserung der therapeutischen Antikörperabgabe über die BHS.
- Sie eröffnet Wege für zukünftige Forschung in der Arzneimittelentwicklung und dem Verständnis von Hirnmechanismen.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial dieser Methode zur Untersuchung neuroimmunologischer Interaktionen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Focused scanning ultrasound (SUS) with microbubbles enables transient blood-brain barrier opening to enhance antibody delivery into the brain, addressing a key limitation in neurodegenerative disease therapeutics. This noninvasive approach improves target engagement and supports mechanistic de-risking by allowing quantitative assessment of antibody biodistribution and cellular uptake. The method provides predictive confidence in early discovery by validating brain penetration of antibody candidates before costly preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic antibody access to brain targets, supporting target validation in neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess antibody biodistribution and target engagement in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of antibody-delivered brain tissue for downstream histological and imaging assays.
- Operational Value: Standardizes delivery parameters to ensure consistent antibody exposure across experimental groups.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant antibody delivery to evaluate target modulation and pathway engagement in preclinical models.
- Operational Value: Enables region-specific delivery (e.g., hippocampus, cortex) to align with disease pathology and biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum by enabling early validation of antibody brain penetration, informing lead identification decisions, and supporting preclinical continuity through region-specific delivery and microglial activity readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody access to brain targets and pathway clarification via enhanced delivery.
- Screening: Delivers antibodies consistently to brain tissue, enabling reliable compound or target evaluation in vivo.
- Analytics: Provides quantitative readouts of antibody concentration in brain and microglial phagocytosis as a functional biomarker of engagement.
- Translational Research: Connects delivery efficiency to preclinical validation by enabling antibody access to disease-relevant brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing BBB permeability of diverse antibody formats across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibody brain uptake, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible antibody exposure across studies through controlled ultrasound and microbubble parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early brain exposure data, reducing late-stage failure risk due to poor CNS penetration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibody candidates based on validated brain delivery efficiency.
Implementation Considerations
- Expertise in ultrasound physics, microbubble handling, and in vivo imaging is required for accurate setup and execution.
- Instrumentation includes a focused ultrasound transducer, water bolus, microbubble preparation system, and fluorescence detection tools.
- Cross-team standardization is needed for ultrasound parameters (frequency, amplitude, duty cycle) and injection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation across models requires adjustment of scanning patterns and ultrasound targeting to match brain anatomy and disease-relevant regions.
- Practical limitations include variability in BBB opening efficiency and the need for careful animal welfare monitoring during retro-orbital injection and transducer application.
