Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Fokussierter Ultraschall mit Mikroblasenmitteln kann die Blut-Hirn-Schranke fokal und vorübergehend öffnen. Diese Technik wurde verwendet, um eine breite Palette von Agenten über die Blut-Hirn-Schranke zu liefern. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die lokalisierte Lieferung an das Nagetierhirn mit oder ohne MRT-Führung.

Fokussierter Ultraschall in Kombination mit zirkulierenden Mikrobläschen kann verwendet werden, um temporäre millimetergroße Öffnungen in der Blut-Hirn-Schranke zu schaffen. Dies ermöglicht die nicht-invasive Verabreichung von systemisch zirkulierenden Wirkstoffen an Zielregionen des Gehirns. Füllen Sie zunächst den Katheterstopfen mit Kochsalzlösung und erwärmen Sie den Schwanz der Ratte mit einer Lampe, wobei Sie darauf achten, das Tier nicht zu überhitzen.

Führen Sie einen 24-Gauge-Schwanzvenenkatheter ein, der zur Abgabe von Mikroblasen, Evans-Blau-Farbstoff, Gadobutrol-MRT-Kontrast bei Verwendung von MRT und dem experimentellen Mittel von Interesse verwendet wird. Blut füllt die Hülle, wenn die Vene getroffen wird. Entfernen Sie langsam die innere Nadel, während Sie die Hülle weiter in die Vene schieben.

Schrauben Sie den Katheterstopfen in das Ende des Katheteranschlusses, sobald sich der Port mit Blut gefüllt hat. Wickeln Sie vorsichtig Laborband um den Katheter und den Schwanz, um es an Ort und Stelle zu halten, beginnend mit einem kleinen Stück oben und in kaudaler Richtung. Lassen Sie das Ende des Katheterstopfens frei.

Stecken Sie die Anästhesieleitung in den Anästhesieanschluss am stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie dann den Kopf des Tieres im Rahmen, indem Sie das Maul auf die Beißstange legen, die Ohrstangen in beide Gehörgänge führen und die Stellschrauben festziehen. Bringen Sie das Tier auf das MRT-Bett.

Unter Verwendung der im Textmanuskript beschriebenen Parameter werden koronale und axiale T2-gewichtete Bilder gesammelt, die das gesamte Gehirn sowie das MRT-Passerzeichen für Koordinatenmessungen erfassen. Suchen Sie auf den koronalen Bildern das Bild, in dem das Passerzeichen am größten ist, was das Zentrum des Passerzeichens angibt. Notieren Sie den Abstand von der Spitze des Passerohrs zur interessierenden Hirnregion in Millimetern, sowohl in medial-lateraler Richtung als auch in dorsal-ventraler Richtung.

Suchen Sie auf den axialen Bildern das Bild, das die Spitze des Referenzbildes zeigt, und notieren Sie die X- und Y-Koordinaten für das Zentrum des Referenzbildes sowie die X- und Y-Koordinaten der interessierenden Gehirnregion. Berechnen Sie den Abstand vom Zentrum des Passerzeichens zur Zielhirnregion sowohl in rostral-kaudaler als auch in medial-lateraler Richtung. Nachdem Sie die Koordinaten erfasst haben, sammeln Sie die Pre-Scan-Bilder.

Halten Sie das Tier in diesem stereotaktischen Rahmen und transportieren Sie es schnell vom MRT-Bett zum FUS-Aufbau. Stellen Sie sicher, dass das Tier unter der Wirkung der Narkose schläft. Schieben Sie den Rahmen in den Rahmenhalter und rasten Sie ihn fest ein.

Verwenden Sie eine Schermaschine, um den Kopf des Tieres zu rasieren, bürsten Sie dann überschüssige Haare ab und tragen Sie Haarentfernercreme auf die Kopfhaut auf. Lassen Sie es drei Minuten einwirken und wischen Sie es mit Wasser und Gaze ab. Wenn Sie eine MRT-Anleitung verwenden, befestigen Sie den Zeiger und bewegen Sie den Zeiger an die Stelle des MRT-Zeigers.

Positionieren Sie den Zeiger ganz oben und in der Mitte des MRT-Passerzeichens, also an dem Punkt, von dem aus alle Entfernungen im MRT-Bild berechnet wurden. Entfernen Sie den Mauszeiger und verschieben Sie den Positionierer auf die medial-lateralen Koordinaten und die rostral-kaudalen Koordinaten. Lecken Sie an der Nullpositionstaste und heben Sie den Positionierer an, indem Sie die Taste nach oben 50 drücken, um die Platzierung des Wasserbads und des Ultraschallgels zu ermöglichen.

Tragen Sie das Ultraschallgel auf die Kopfhaut des Tieres auf und legen Sie das Wasserbad über das Tier, wobei Sie das Polyimid-Klebebandfenster auf das Gel drücken, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Luftblasen im Gel befinden. Füllen Sie das Wasserbad mit entgastem Wasser. Wenn Sie den Hochleistungswandler verwenden, senken Sie den Positionierer so ab, dass sich der Magnet knapp über dem Wasser befindet.

Befestigen Sie den Geber am Positionierer, indem Sie den Geber vorsichtig schräg ins Wasser senken und die Magnete anschließen. Senken Sie den Positionierer auf die dorsal-ventrale Koordinate ab und schalten Sie die HF-Endstufe ein. Injizieren Sie einen Milliliter pro Kilogramm 3%Evans blue Farbstoff, indem Sie eine Nadelspitze in den Katheterstopfen stecken und injizieren.

Das ganze Tier sollte innerhalb von Sekunden blau werden, was darauf hinweist, dass der Katheter richtig in der Schwanzvene positioniert ist. Lassen Sie den Farbstoff fünf Minuten lang zirkulieren und aktivieren Sie dann die Mikrobläschen, indem Sie sie mit dem Blasenschüttler heftig schütteln. Drehen Sie diese Spritze mehrmals um, um eine gleichmäßige Verteilung der Mikroblasen zu erhalten, befestigen Sie dann das geflügelte Infusionsset und füllen Sie es.

Positionieren Sie die Spritze auf der Infusionspumpe und stellen Sie die Infusionspumpe so ein, dass sie 0,2 Milliliter mit einer Geschwindigkeit von sechs Millilitern pro Stunde abgibt, um eine langsame Infusion der Mikroblasen über die zweiminütige FUS-Exposition zu gewährleisten. Führen Sie die geflügelte Nadel in den Katheterstopfen ein. Lassen Sie zuerst die Infusionspumpe laufen, warten Sie drei Sekunden und starten Sie dann die FUS-Behandlung durch Drücken der Ein-Taste und am Funktionsgenerator.

Wiederholen Sie dies zweimal pro Region mit einem Abstand von fünf Minuten, damit sich die Mikroblasen lösen können. Drücken Sie die Ein-Taste am Funktionsgenerator erneut, um die FUS-Behandlung zu stoppen, wenn die Infusionspumpe nach zwei Minuten stoppt. Warten Sie fünf Minuten, bis sich die Mikrobläschen aufgelöst haben, und beginnen Sie dann mit der Infusion und der zweiten FUS-Behandlung.

Unmittelbar nach der zweiten FUS-Behandlung injizieren Sie Gadobutrol Kontrastmittel und das gewünschte Mittel. Das gesamte abgegebene Volumen aller Mittel sollte fünf Milliliter pro Kilogramm nicht überschreiten. Um die Öffnung der BHS zu bestätigen, legen Sie das Tier an genau der gleichen Stelle wieder auf das MRT-Bett und schließen Sie den Anästhesieschlauch an.

Sammeln Sie MRT-Nachuntersuchungen mit den gleichen Bildgebungsparametern wie die Bilder vor dem Scan, um die Gadobutrol-MRT-Verbesserung im Bereich der BHS-Öffnung zu bestätigen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine lokalisierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke sowohl mit dem Immersionswandler mit geringer Leistung als auch mit dem fokussierten Ultraschallwandler mit hoher Leistung zu induzieren. Zunächst wurde der Immersionswandler mit geringer Leistung entweder auf die vordere oder die mediale Gehirnhälfte gerichtet.

Die Tiere wurden mit oder ohne Perfusion getötet, und die BHS-Öffnung wurde mittels Evans-Blaufarbstoff-Autofluoreszenz sichtbar gemacht. In späteren Experimenten wurde der FUS-Schallkopf entweder auf den Hippocampus oder den anterioren cingulären Kortex gerichtet. Neben dem Farbstoff Evans-Blau wurde das MRT-Kontrastmittel Gadobutrol verwendet, um die gezielte Öffnung der BHS in VIVO zu verifizieren.

Nachdem die Tiere getötet worden waren, bestätigte die Autofluoreszenz des Evans-Blaufarbstoffs den Öffnungsort. Um zu beurteilen, ob diese Technik für eine gezielte Genabgabe verwendet werden kann, wurden AAV neun, das grün fluoreszierendes Protein exprimiert, und Gadobutrol-Kontrastmittel unmittelbar nach der Öffnung der Blut-Hirn-Schranke im Hippocampus injiziert. Das Tier wurde abgebildet, um die Öffnung mit Gadobutrol-Kontrastmittel zu verifizieren.

Dann wurde die Genverabreichung durch GFP-Expression bestätigt. Dieses Protokoll bietet einen Laboransatz für die MRT-gesteuerte Focus Ultraschall-vermittelte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke, der von anderen Laboren leicht angepasst werden kann, um eine nicht-invasive translationale Alternative zur stereotaktischen Chirurgie zu bieten.