Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie, um die extrazelluläre MHC-Klasse-1-Expression an primären Neuronen aus Mäusen quantitativ zu bewerten. Eine NC2-Immunfärbung für die MHC1-Expression kann auch durchgeführt werden, um einen Signalverlust aufgrund von Protein-, Tertiär-, Strukturveränderungen, Permeabilisierung oder Denaturierungsbedingungen zu vermeiden. MHC-Klasse 1 steuert nicht nur Immunantworten auf Infektionen, sondern moduliert auch neuronale synaptische Verbindungen.

Die Faktoren, die die Expression der MHC-Klasse 1 regulieren, sind jedoch noch unbekannt. Die Schritte der embryonalen Hirndissektion erfordern Übung, um sie zu beherrschen. Achten Sie beim Erlernen der Technik darauf, das Sezieren zu üben, ohne sich Gedanken über die Zeit oder den anschließenden Kultivierungsprozess

Für die Isolierung des embryonalen Hippocampus legen Sie das erste entnommene embryonale Gehirn der Maus unter ein Stereo-Dissektionsmikroskop. Und verwenden Sie zwei Paar sterile Dumont Pinzetten Nummer 5, um die Riechkolben abzukneifen und die Hirnhäute gründlich wegzuziehen. Sobald die Hirnhäute vollständig entfernt wurden, öffnet sich die obere Seite der Rinde seitlich, um den Hippocampus freizulegen.

Verwenden Sie die Pinzette, um den Hippocampus vom angeschlossenen Kortex wegzuklemmen, und übertragen Sie den isolierten Hippocampus vorsichtig in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Hibernate-E Medium auf Eis. Wenn alle Hippocampi in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt wurden, sedimentieren Sie das Hirngewebe durch Zentrifugation. Ersetzen Sie den Überstand durch 0,5 Milliliter frisch zubereitete Papain-Dissoziation pro Embryo und mischen Sie das Röhrchen mehrmals durch Inversion.

Legen Sie das Gewebe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und mischen Sie die Proben alle 10 Minuten durch Inversion, bevor Sie das Gewebe durch Zentrifugation wieder sammeln. Ersetzen Sie den Überstand durch ein gleiches Volumen frisches Hibernate-E Medium und verwenden Sie eine vollständig geöffnete, feuerpolierte Pasteurpipette aus Glas, um das Gewebe 10 Mal zu verreiben. Nachdem sich das Gewebe zwei Minuten lang abgesetzt hat, wird der Überstand in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Geben Sie das gleiche Volumen Hibernate-E Medium zurück in das Gewebe und verwenden Sie eine halboffene, feuerpolierte Pasteur-Pipette aus Glas, um das Gewebe 10 Mal zu verreiben. Nachdem Sie das Gewebe weitere zwei Minuten ruhen gelassen haben, poolen Sie den Überstand in dem 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen Hibernate-E Medium in das Gewebe und zerkleinern Sie das Gewebe 10 Mal mit einer viertel offenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette aus Glas.

Nachdem Sie das Gewebe zwei Minuten lang abgesetzt haben, sammeln Sie den Überstand in dem 50-Milliliter-Röhrchen. Die dissoziierten Zellen werden durch Zentrifugation im Überstand gesammelt. Und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Neuronenwachstumsmedium zum Zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine endgültige Plattierungsdichte von fünfmal 10 bis zum fünften lebensfähigen Zellen pro Milliliter Neuronenwachstumsmedium und fügen Sie einen Milliliter Zellen zu jeder Vertiefung einer 12-Well-Poly-D-Lysin-beschichteten Platte hinzu.

Stellen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie die Hälfte des Mediums zweimal pro Woche durch die gleiche Menge frisches Medium, um die Lebensdauer der Kultur zu gewährleisten. Um die Fähigkeit der kultivierten Neuronen zur Expression von MHC1 zu beurteilen, ersetzen Sie am geeigneten Kulturtag 0,5 Milliliter Überstand in jeder Vertiefung durch 0,5 Milliliter frisches Neuronenwachstumsmedium, ergänzt mit 200 Einheiten pro Milliliter Interferon beta für eine sechs- bis 72-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation waschen Sie jede Vertiefung einmal mit kaltem Neurobasalmedium ohne Zusätze, bevor Sie 0,5 Milliliter nicht ergänztes kaltes Neurobasalmedium, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter FC-Block und einem Mikrogramm pro Milliliter fluoreszenzkonjugiertem Anti-MHC1-Antikörper, in jede Vertiefung geben.

Schützen Sie es nach einer 45-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht. Jede Portion einmal gut mit kaltem Dulbeccos PBS waschen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter enzymfreien Zelldissoziationspuffer bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und rühren Sie, um die Zellen zu entfernen.

Bestätigen Sie die Dissoziation unter einem inversen Gewebekulturmikroskop und fügen Sie 0,5 Milliliter FACS-Puffer zu jeder Vertiefung hinzu. Zerreiben Sie die Zellen, um Klumpen zu dispergieren, und übertragen Sie das gesamte Volumen aus jeder Vertiefung in einzelne 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern frischem FACS-Puffer pro Röhrchen.

Übertragen Sie jede Suspension in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte und geben Sie 100 Mikroliter Fixierreagenz in jede Well. Trituieren Sie mehrmals, um ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden, und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie, um die Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln, und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern frischem FACS-Puffer pro Vertiefung.

Nach dem Zentrifugieren resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern Permeabilisierungsreagenz, das mit einem fluoreszenzkonjugierten Antikörper gegen neuronale Kerne pro Vertiefung ergänzt wird. Nach dem Mischen die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, wobei das Schaukeln vor Licht geschützt ist. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen dreimal durch Zentrifugation und resuspendieren die Pellets zwischen den Zentrifugen in 100 Mikrolitern frischem FACS-Puffer.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern 2%-Paar Formaldehyd in FACS-Puffer unter gründlichem Mischen. Neuronen können durch das sequentielle Gating von Gesamtereignissen identifiziert werden, um zelluläre Trümmer und Dubletten auszuschließen, und durch ihre neuronale Kernpositivität. Neuronale Zellkerne, die positiv sind, können dann weiter auf ihre MHC1-Positivität analysiert werden.

Aus diesen Daten können der Prozentsatz der Neuronen, die für die MHC1-Färbung positiv sind, und die mediane Fluoreszenzintensität berechnet werden, was zeigt, dass z.B. die Behandlung mit Interferon-beta den Prozentsatz und die Intensität der MHC1-Neuronenexpression signifikant hochreguliert. Mit leichten Modifikationen können diese Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen wie kortikale Neuronen zu kultivieren oder um verschiedene zelluläre Marker, stimulierende Moleküle oder genetische Modifikationen zu testen.