Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die phagozytische Funktion retinaler Mikroglia in vivo zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Augenheilkunde zu beantworten, beispielsweise, ob bestimmte Substanzen die phagozytische Funktion der Mikroglia unter physiologischen Bedingungen verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Durchflusszytometrie nutzt, wodurch eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Mikroglia-Phagozytose ermöglicht wird.

Bei der Demonstration des Verfahrens wird mir Susumu Sakimoto, ein Postdoktorand aus meinem Labor, helfen. Beginnen Sie damit, eine 33-Gauge-Nadel und eine Spritze mit 0,5 Mikrolitern einer fluoreszenzmarkierten Partikellösung zu befüllen. Anschließend legen Sie eine anästhetisierte Maus seitlich auf weiches Material unter ein Operationsmikroskop und überprüfen die angemessene Sedierungstiefe durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenquetschreiz.

Als Nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig Druck um ein Augenlid auszuüben, sodass der Augapfel leicht aus der Augenhöhle hervortritt. Fassen Sie dann den Kopf mit zwei Fingern direkt oberhalb des Ohres und am Kiefer des Tieres an und dehnen Sie die Haut parallel zu den Augenlidern, um das Auge leicht aus der Augenhöhle hervorstehen zu lassen. Intravitreale Injektionen sind schwierig, und wenn sie nicht korrekt durchgeführt werden, führen sie zu verzerrten und variablen Ergebnissen.

Um das Trauma am Auge zu minimieren, halten Sie das Tier in einer stabilen Position mit möglichst geringer Kopfbewegung. Um den Augapfel zu durchstechen, greifen Sie die Maus vorsichtig mit einer Hand. Suchen Sie dann die Hornhautlimbus, die Verbindungsstelle zwischen Hornhaut und Lederhaut, die bei pigmentierten Mäusen als grauer Kreis sichtbar ist.

Halten Sie die Spritze in der anderen Hand und führen Sie die Nadel in die Limbusregion ein. Ziehen Sie die Nadel anschließend leicht zurück, um eine kleine Menge Glaskörperflüssigkeit abzulassen, und drücken Sie dann langsam den Kolben, um die Partikel zu injizieren. Sobald alle Kügelchen verabreicht wurden, ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um einen Rückfluss des injizierten Materials zu vermeiden, und geben Sie feuchtigkeitsspendende Augentropfen, um das Auge nach dem Zurückfallen in seine Position hydratisiert zu halten.

Legen Sie das Tier dann auf eine Heizplatte in seinen eigenen Käfig und überwachen Sie es, bis es sich vollständig erholt hat. Drei Stunden nach der intravitrealen Injektion verwenden Sie eine Pinzette im 45-Grad-Winkel, um vorsichtig gegen das Augenlid zu drücken, um den Augapfel vorzuschieben. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Augapfel und ziehen Sie daran.

Überführen Sie dann den Augapfel in den trockenen Bereich einer Petrischale, der eine kleine Menge PBS mit Calcium und Magnesium unter einem Stereomikroskop enthält. Perforieren Sie mit einer Spitze einer feinen Pinzette das Auge am kornealen Limbus. Halten Sie anschließend den Augapfel mit einer feinen, in einem 45-Grad-Winkel gebogenen Pinzette und schneiden Sie mit einer Feder-Schere entlang des kornealen Limbus, bis etwa die Hälfte des Umfangs durchtrennt ist.

Überführen Sie den Augapfel in PBS und verwenden Sie ein zweites Paar feiner Pinzette mit 45-Grad-Winkel, um Hornhaut und Sklera voneinander zu trennen. Linse und Netzhaut lösen sich dabei intakt heraus. Stellen Sie sicher, dass Linse und Netzhaut getrennt sind, und überführen Sie die Netzhaut in ein 5,4-Milliliter-Polystyrol-Reagenzglas, das zwei Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium enthält.

Um eine Einzelzell-Suspension der Netzhautzellen zu erhalten, verwenden Sie ein Neuronen-Gewebe-Dissociationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren Sie die Zellen in 200 µL Markierungspuffer. Überführen Sie dann die Probe in eine Vertiefung einer 96-Well-U-Boden-Platte. Nach der Zentrifugation stülpen Sie die Platte um, um den Überstand zu entfernen, und blockieren die FC-Rezeptoren mit 25 µL Markierungspuffer, der pro Vertiefung CD16- und CD32-Antikörper enthält, für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Als Nächstes die Zellen mit den Antikörpern der Wahl für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln markieren. Anschließend die Zellen pelletieren und mit 200 µL frischem Färbepuffer pro Mulde waschen. Die Pellets anschließend in 200 µL Färbepuffer und Vitalitätsfarbstoff resuspendieren und die Proben in 1,2-mL-Mikrotiterplatten umsetzen.

Anschließend die Vertiefungen mit weiteren 100 Mikrolitern Färbe-Puffer und Vitalitätsfarbstoff waschen und die Waschproben mit den entsprechenden Proben für die Analyse per Durchflusszytometrie vereinen. Diese Methode kann bei 10 bis 20 Tage alten postnatalen oder adulten Mäusen angewendet werden und lässt sich anpassen, um den Einfluss von Substanzen und/oder genetischen Modifikationen der mikroglialen Phagozytose zu untersuchen. Beispielsweise wurde in diesem Experiment nach intraperitonealer Gabe unterschiedlicher Dosen von LPS eine Dosis von 1,42 Milligramm pro Kilogramm LPS ermittelt, die im Vergleich zu den mit Fahrzeug behandelten Kontrollen eine statistisch signifikante Zunahme des Prozentsatzes phagozytierender Mikroglia hervorruft.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden. Nach dieser Methode können weitere Verfahren wie die Zellsortierung gefolgt von qPCR oder proteomische Analysen genutzt werden, um weitere Fragen zu den Unterschieden zwischen phagozytierenden und nicht-phagozytierenden Mikrogliazellen in der Retina zu beantworten. Bei der Entwicklung dieser Technik hoffen wir, dass es nun möglich ist, Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Sehforschung und der Neurowissenschaften zu ermöglichen, die phagozytische Funktion von Mikroglia in situ und in einem physiologisch relevanten Kontext weiter zu untersuchen.