Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion In Vivo Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die phagozytäre Funktion der retinalen Mikroglia in vivo zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Augenheilkunde zu beantworten, z. B. ob bestimmte Verbindungen die phagozytische Funktion der Mikroglia in einem physiologischen Umfeld verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Durchflusszytometrie verwendet, die eine schnelle und präzise quantitative Analyse der mikroglialen Phagozytose ermöglicht.

Bei der Demonstration des Verfahrens wird mir Susumu Sakimoto, ein Postdoc aus meinem Labor, helfen. Beginnen Sie damit, eine 33-Gauge-Nadel und eine Spritze mit 0,5 Mikrolitern fluoreszenzmarkierter Partikellösung zu befüllen. Platzieren Sie dann eine anästhesierte Maus seitlich auf weichem Material unter einem Operationsmikroskop und bestätigen Sie den angemessenen Sedierungsgrad durch eine fehlende Reaktion auf das Einklemmen der Zehen.

Als nächstes übst du mit einer Pinzette vorsichtig Druck auf ein Augenlid aus, so dass der Augapfel leicht aus der Augenhöhle herausspringt. Fassen Sie dann den Kopf mit zwei Fingern direkt über dem Ohr und am Kiefer des Tieres und dehnen Sie die Haut sanft parallel zu den Augenlidern, um das Auge leicht aus der Augenhöhle heraus zu halten. Intravitreale Injektionen sind eine Herausforderung und führen, wenn sie nicht korrekt durchgeführt werden, zu verzerrten und variablen Ergebnissen.

Um das Trauma des Auges zu reduzieren, halten Sie das Tier in einer stabilen Position mit minimaler Kopfbewegung. Um den Augapfel zu punktieren, fassen Sie die Maus vorsichtig mit einer Hand. Lokalisieren Sie dann den Hornhautlimbus, an dem sich Hornhaut und Sklera verbinden, der bei pigmentierten Mäusen als grauer Kreis sichtbar ist.

Halten Sie die Spritze in der anderen Hand und führen Sie die Nadel in den Limbus ein. Ziehen Sie dann die Nadel leicht zurück, um ein kleines Volumen Glasflüssigkeit auszustoßen, und drücken Sie langsam auf den Kolben, um die Partikel zu injizieren. Wenn alle Kügelchen abgegeben wurden, ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um einen Rückfluss des injizierten Materials zu vermeiden, und tragen Sie feuchtigkeitsspendende Tropfen auf, um das Auge mit Feuchtigkeit zu versorgen, sobald das Auge wieder an seinen Platz zurückgezogen ist.

Setzen Sie das Tier dann auf ein Heizkissen in seinem eigenen Käfig mit Überwachung, bis es sich vollständig erholt hat. Drei Stunden nach der intravitrealen Injektion drücken Sie mit einer Pinzette im 45-Grad-Winkel sanft gegen das Augenlid, um den Augapfel zu stützen. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Augapfel und ziehen Sie.

Übertragen Sie dann den Augapfel unter einem Präpariermikroskop in den trockenen Bereich einer Petrischale, die ein kleines Volumen PBS mit Kalzium und Magnesium enthält. Und verwenden Sie eine Spitze einer superfeinen Pinzette, um das Auge im Hornhautlimbus zu perforieren. Halten Sie dann den Augapfel mit einer feinen 45-Grad-Winkelzange fest und schneiden Sie mit einer Federschere um den Hornhautlimbus herum, bis etwa die Hälfte des Umfangs geschnitten ist.

Übertragen Sie den Augapfel in PBS und verwenden Sie eine zweite feine 45-Grad-Pinzette, um die Hornhaut und die Sklera auseinander zu reißen. Die Linse und die Netzhaut kommen intakt heraus. Stellen Sie sicher, dass die Linse und die Netzhaut getrennt sind, und übertragen Sie die Netzhaut in ein 5,4-Milliliter-Reagenzglas aus Polystyrol, das zwei Milliliter PBS mit Kalzium und Magnesium enthält.

Um eine Einzelzellsuspension der Netzhautzellen zu erhalten, verwenden Sie ein Dissoziationskit für neuronales Gewebe gemäß den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Färbepuffer. Übertragen Sie dann die Probe in eine Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte. Nach der Zentrifugation die Platte umdrehen, um den Überstand zu verwerfen, und die FC-Rezeptoren mit 25 Mikrolitern Färbepuffer mit CD16, CD32-Antikörper pro Vertiefung für fünf Minuten bei Raumtemperatur blockieren.

Markieren Sie anschließend die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit den Antikörpern von Interesse. Pelletieren Sie dann die Zellen und waschen Sie anschließend 200 Mikroliter frischen Färbepuffer pro Vertiefung. Nun werden die Pellets in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer und Viability Dye resuspendiert und die Proben in 1,2 Milliliter Mikrotiterröhrchen überführt.

Waschen Sie dann die Vertiefungen mit zusätzlichen 100 Mikrolitern Färbepuffer und Viabilitätsfarbstoff und poolen Sie die Waschungen mit den entsprechenden Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode kann bei 10 bis 20 Tage alten postnatalen oder adulten Mäusen angewendet werden und kann angepasst werden, um die Wirkung von Verbindungen und/oder die genetische Manipulation der mikroglialen Phagozytose zu testen. Zum Beispiel wurde in diesem Experiment nach intraperitonealer Provokation mit unterschiedlichen LPS-Dosen eine Dosis von 1,42 Milligramm pro Kilogramm LPS bestimmt, um einen statistisch signifikanten Anstieg des Prozentsatzes der phagozytären Mikroglia im Vergleich zu Vehikel-herausgeforderten Kontrollen zu induzieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Zellsortierung mit anschließender qPCR oder die proteomische Analyse verwendet werden, um weitere Fragen zu den Unterschieden zwischen phagozytären und nicht-phagozytären Mikroglia in der Netzhaut zu beantworten. Wir gehen davon aus, dass wir mit der Entwicklung dieser Technik es Seh- und Neurowissenschaftlern nun ermöglichen können, die phagozytäre Funktion der Mikroglia in situ und in einem physiologisch relevanten Kontext weiter zu erforschen.