Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biologisch basierte vaskuläre Transplantate mithilfe eines pulsierenden Bioreaktorsystems herzustellen. Dies wird erreicht, indem ein biologisch abbaubares Gerüst aus PGA-Netz hergestellt wird, auf dem die Zellen wachsen können, und dieses in einer Bioreaktorkammer montiert wird. Die Gerüste werden anschließend mit glatten Muskelzellen besiedelt, und ein Deckel mit Luft- und Nährstoffzufuhr verschließt die Bioreaktorkammer.

Der Bioreaktor wird anschließend mit einem Flusssystem verbunden, um pulsierenden Fluss für die Gefäße im Bioreaktor bereitzustellen. In dem Reaktor wachsen die Zellen in die Gefäße hinein, die immunchemische, biochemische und mechanische Tests bestehen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie der koronaren Herzkrankheit, da dieses Verfahren ein aussichtsreicher Ansatz zur Regenerierung implantierbarer Gefäßprothesen mit kleinem Durchmesser für arterielle Bypass-Operationen ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die vaskuläre Gewebeengineering ermöglicht, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, die zyklischen physiologischen Kräften ausgesetzt sind. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben. Es ist viel Übung erforderlich, um die Fähigkeiten vollständig zu beherrschen.

Die Idee für diesen Ansatz entstand ursprünglich aus der Erkenntnis heraus, wie wichtig die Anwendung physiologischer mechanischer Reize für die Regeneration von gewebetechnischen Konstrukten ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Prozess der Bioreaktorbenutzung schwer zu erlernen ist, da er aus vielen Einzelschritten besteht und nur durch eine detaillierte Demonstration erworben werden kann. Beginnen Sie damit, 30 Zentimeter lange Abschnitte von Silikonschläuchen mit einem Innendurchmesser von drei Millimetern mit destilliertem Wasser zu reinigen und an der Luft trocknen zu lassen.

Verwenden Sie eine Schere, um mit Hilfe einer Klemme für jedes Tubingstück einen 1,1 cm mal acht cm großen Abschnitt des PGA-Netzes auszuschneiden, befestigen Sie das PGA-Netz mit Dexon 6.0 Nahtmaterial am Tubing, knoten Sie drei chirurgische Knoten und führen Sie anschließend einzelne Stiche mit der Klemme durch; das befestigte Netz bildet ein PGA-Gerüst. Waschen Sie die Gerüste, indem Sie sie zunächst ein bis zwei Minuten lang in einmolarer Natriumhydroxidlösung eintauchen und danach dreimal je zwei Minuten in destilliertem Wasser. Tupfen Sie sie zwischen den Waschschritten trocken und lassen Sie sie nach dem dritten Waschgang 15 Minuten lang in einer Abzugshaube an der Luft trocknen.

Nach dem Trocknen einen ein Zentimeter langen Dacron-Schlauch an jedem Ende des Meshes mit drei Stichen annähen. Einen Überlapp von zwei bis drei Millimetern am Schlauch belassen und den Schlauch nicht durchstechen. Unbedingt etwa 15 Zentimeter freies Nahtmaterial für die spätere Verwendung in diesem Protokoll belassen.

Alle Bioreaktorbestandteile und Werkzeuge werden zuvor autoklaviert. Am Tag vor dem Start der Bioreaktorkultur muss der Bioreaktor teilweise zusammengebaut werden, wobei die Bioreaktorbestandteile, die Scaffolds, die Silikonmehrschlauchleitung, die chirurgischen Instrumente und ein dünner Draht, der länger ist als die Länge des Bioreaktors, mindestens 30 Minuten lang in einer 70 %igen Ethanol-Lösung untergetaucht werden. Verwenden Sie den Draht, um die Silikonleitung durch die Seitenarme des Reaktors zu ziehen.

Jetzt den Bioreaktor hervorholen und die PGA-Gerüste durch Befestigen der Dacron-Kappen über die aufgeweiteten Glasränder im Inneren anbringen. Das überschüssige Nahtmaterial verwenden, um jede Kappe festzuziehen. Anschließend mithilfe von Verbindungsstücken die Silikon-Schläuche an einer Seite des Gerüsts mit einem Paar Bioreaktorarme verbinden und die Schläuche auf der anderen Seite des Gerüsts mit den beiden anderen Armen verbinden.

Wenn die Anschlüsse installiert sind, ziehen Sie sie aus den Seitenarmen heraus und spülen Sie den Bioreaktor mit Ethanol durch. Lassen Sie den Reaktor auf jeder Seite 10 Minuten lang einweichen. Stellen Sie den Bioreaktor auf einige Petrischalen und spülen Sie ihn mit Gewebekulturmedium durch.

Bewerten Sie das Wasser. Spülen Sie mit einer Pipette auch das Netz und die Schläuche gründlich durch. Geben Sie nun einen sterilen Rührstab in den Reaktor für die spätere Verwendung und trocknen Sie die Apparatur ab diesem Zeitpunkt über Nacht im Abzug bei eingeschaltetem Gebläse und ausgeschalteter UV-Lampe.

Lehnen Sie sich nicht über den Reaktor, da dies zu Kontaminationen führen könnte. Während der Einrichtung müssen alle Anschlüsse mit Alkohol sauber abgewischt werden. Vor dem Anbringen vieler Verbindungsstellen werden die Gelenke dann mit Paraform verstärkt, das vor der Anwendung in 70 %igem Ethanol getränkt werden muss. Halten Sie daher von beidem ausreichend bereit.

Als Vorsichtsmaßnahme bereitstellen: einen sterilen Petrischale über jede Bioreaktoröffnung legen, um das PGA-Gerüst im Inneren vor Kontaminationen zu schützen. Beginnen Sie nun mit dem Aufbau, indem Sie die Injektionsöffnung mit dem dritten unbenutzten Arm des Bioreaktors verbinden. Schließen Sie als Nächstes die Infusionsflasche an das Flusssystem an.

Verwenden Sie bei dem Walrusschlauch-Set das blaue Ende so nah wie möglich an der Y-Verzweigung abzubinden und den Schlauch abzuklemmen. Das rote Rohr an das entfernte Ende des Infusionsbeutels anschließen. Anschließend das weiße Rohr an eine Seite des Durchflusssystems anschließen.

Fügen Sie einen Dreifach-Hahn in das Flusssystem ein. Verbinden Sie ein Ende des Druckmesssonden-Schlauchs mit dem Hahn und das andere Ende mit der mittleren Öffnung der Infusionsflasche. Um das Flusssystem teilweise zu füllen und auf Leckagen zu überprüfen, geben Sie nun 350 Milliliter PBS und 1 % Fungi Zone in die Infusionsflasche.

Unter Verwendung einer 60-Milliliter-Spritze vor oder nach dem Anschließen an das Flusssystem das Hahnventil justieren, um die Flussrichtung von PBS zu steuern, und die Tasche zusammendrücken, um das System zu spülen. Dieser Schritt kann entweder vor oder nach dem Zellansiedeln durchgeführt werden. Nun können die Zellen im Bioreaktor angesiedelt werden.

In diesem Beispiel resuspendieren Sie 8 Millionen SM-Zellen, was etwa einer konfluenten T-75-Flasche entspricht, in 1,25 Milliliter Medium und geben sie gleichmäßig auf das PGA-Gerüst von Dacron-Verbindung zu Dacron-Verbindung tropfenweise auf. Nach dem Zugabe der Zellen wischen Sie den Rand des Bioreaktors mit Alkohol sauber. Vermeiden Sie es, sich über den Reaktor zu beugen.

Als Nächstes montieren Sie vorsichtig den Silikonstopfendeckel. Achten Sie darauf, die Unterseite des Deckels nicht freizulegen, wenn er aus der Autoklavierbeutel entnommen wird oder während der folgenden Befestigungsschritte. Befestigen Sie zunächst den Injektionshafen am Zufuhrschlauch am männlichen Verbinder.

Zweitens befestigen Sie PTFE-0,20-Mikron-Filter an jedem der drei Anschlüsse. Drittens filmen Sie die Einspritzstelle. Setzen Sie den zusammengesetzten Silikongummistopfen in den Glasbioreaktor ein.

Stellen Sie sicher, dass die Fütterungssonde die sitzenden PGA-Gerüste nicht berührt. Versiegeln Sie anschließend mit Parafilm. Schließen Sie nun den Bioreaktor an das Flusssystem an und stellen Sie den Bioreaktor sowie das Flusssystem in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator.

Der Reaktor muss 25 bis 30 Minuten lang seitlich liegend positioniert werden und alle fünf Minuten gedreht werden. Danach füllen Sie die Bioreaktorkammer unter weiterer Inkubation mit 400 Milliliter Kulturmedium mit einem Gehalt von vier bis 10 über eine Zuführleitung mithilfe einer Pumpe. Inkubieren Sie nun die besiedelten Scaffolds ohne pulsatile Pumpung sechs bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Während dieser Zeit vor dem Einschalten der Pumpe besteht keine Notwendigkeit für einen Mediumwechsel oder die Zugabe von Vitamin C. Überprüfen Sie die Schläuche auf Lecks oder Knicke. Stellen Sie anschließend die Drehzahl der Pumpe so ein, dass ein Druckbereich zwischen minus 30 und 270 Millimeter Quecksilbersäule eingehalten wird. Überwachen und halten Sie diesen Druck während der gesamten Kultivierung täglich aufrecht.

Mediumwechsel und die Zugabe von Ascorbinsäure sollten zweimal wöchentlich durchgeführt werden, während das Gerüst mit pulsierender Pumpe wächst, um frisches Medium zuzuführen. Zuerst befestigen Sie den Injektionshafen und den PTFE-Filter an den Zufuhrdeckeln sowohl für den Mediumwechsel als auch für die Entsorgung des verbrauchten Mediums. Danach führen Sie den Zufuhrschlauch fest in die bidirektionale Pumpe ein und verbinden ein Ende mit dem Zufuhrhafen des Bioreaktors und das andere Ende mit dem Zufuhrdeckel. Pumpen Sie nun langsam 200 Milliliter Medium aus.

Allmählich kann die Pumpgeschwindigkeit erhöht werden. Anschließend einen neuen Zufuhrschlauch anschließen und langsam mit dem Einpumpen von 200 Milliliter frischem Medium beginnen. Um Ascorbinsäure in den Reaktor zuzugeben, 25 Milliliter Medium mit einer sterilen 30-Milliliter-Spritze entnehmen.

Geben Sie fünf Milliliter sterile Ascorbinsäurelösung hinzu und füllen Sie anschließend auf 25 Milliliter auf. Die hergestellten Gefäße erscheinen undurchsichtig und erreichen nach einer achtwöchigen Kultur eine Wanddicke von etwa 250 Mikrometern. Unter pulsierenden Bedingungen zeigen Hämatoxylin-Eosin-Färbungen der hergestellten Gefäße zeitabhängige und pulsationsbedingte Veränderungen der Gewebemorphologie.

Die luminalen Seite der Gefäße ist mit einer Masson-Trichrom-Färbung angegeben. Die Kollagenfärbung zeigt, dass das vier Wochen gepulste Gefäß mehr Kollagen aufweist als sein nicht gepulstes Gegenstück. Weiße Pfeile zeigen auf verbliebene PGA-Fragmente in den Gefäßen nach 12 Wochen. Die immunchemische Analyse zeigt die Expression des frühen glattmuskulären Markers Alpha-Aktin, des intermediären glattmuskulären Markers Calponin-1 und des späten glattmuskulären Markers Myosin-Schwerketten. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in sieben bis acht Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets so sauber und steril wie möglich vorzugehen, indem man dieser Anleitung folgt. Andere Methoden, wie beispielsweise die Modifikation des Lumens der konstruierten Gefäße, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, etwa die Bedeutung der Modifikation der luminalen Oberfläche für die Erhaltung der konstruierten Gefäße während in-vivo-Studien. Nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des Gewebeengineerings, insbesondere des vaskulären Engineerings, potenzielle Ansätze zur Behandlung von koronaren Herzkrankheiten in Tiermodellen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie implantierbare, engineerierte vaskuläre Transplantate durch eine dynamische Postalkultur hergestellt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumhydroxid gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Augenschutz und Laborkittel stets getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.