Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biologisch basierte Gefäßtransplantate unter Verwendung eines pulsierenden Bioreaktorsystems zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem ein biologisch abbaubares Gerüst aus PGA-Netz vorbereitet wird, in dem die Zellen reihenweise wachsen, und sie in einer Bioreaktorkammer zusammengebaut werden. Die Gerüste werden dann mit glatten Muskelzellen bestückt und ein Deckel mit Luft und Ernährungssonde dichtet die Bioreaktorkammer ab.

Der Bioreaktor wird dann mit einem Strömungssystem verbunden, um die Gefäße im Bioreaktor mit einer pulsierenden Strömung zu versorgen. Im Reaktor wachsen die Zellen zu Gefäßen heran, die immunchemische, biochemische und mechanische Tests bestehen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der koronaren Herzkrankheit, da diese Technik ein vielversprechender Ansatz zur Regeneration implantierbarer Gefäßtransplantate mit kleinem Durchmesser für den arteriellen Bypass ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Gefäßtechnik geben kann, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, die unter zyklischen physiologischen Kräften stehen. Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben. Sie werden viel Übung benötigen, um die Fähigkeiten vollständig zu beherrschen.

Die Idee zu diesem Ansatz kam uns, als wir erkannten, wie wichtig es ist, physiologisch-mechanische Stimulation zur Regeneration technischer Konstrukte anzuwenden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Bioreaktor-Sing-Prozess schwer zu erlernen ist, da er viele Schritte umfasst und nur durch eine detaillierte Demonstration erworben werden kann. Reinigen Sie zunächst 30 Zentimeter lange Abschnitte von Silikonschläuchen mit einem Innendurchmesser von drei Millimetern mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen.

Schneiden Sie mit einer Schere für jedes Schlauchstück mit einem Hämostaten einen 1,1 x acht Zentimeter großen Abschnitt PGA-Netz aus, so dass das PGA-Netz mit Dexon 6.0 Naht an den Schlauch bindet, drei chirurgische Knoten bindet und mit einzelnen Nähten mit dem Hämostaten folgt, das gesicherte Netz bildet ein PGA-Gerüst. Waschen Sie die Gerüste, indem Sie sie zuerst ein bis zwei Minuten lang in ein molares Natriumhydroxid tauchen und dann drei Mal pro Tauchgang zwei Minuten lang in destilliertes Wasser tauchen. Tupfen Sie sie zwischen den Wäschen trocken und lassen Sie sie nach der dritten Wäsche 15 Minuten lang in einer Kapuze an der Luft trocknen.

Nach dem Trocknen nähen Sie mit drei Stichen einen Zentimeter Dacron-Bündchen an jedes Ende des Netzes. Lassen Sie einen Schlauchüberlappungswinkel von zwei bis drei Millimetern und stechen Sie den Schlauch nicht durch. Achten Sie darauf, etwa 15 Zentimeter freie Naht für die spätere Verwendung in diesem Protokoll zu lassen.

Alle Komponenten und Werkzeuge des Bioreaktors werden zuvor autoklaviert. Am Tag vor dem Start der Bioreaktorkultur muss der Bioreaktor teilweise zusammengebaut werden. Tauchen Sie die Bioreaktorkomponenten in die Gerüste, also den Silikonschlauch, die chirurgischen Instrumente und einen dünnen Draht, der länger als die Länge des Bioreaktors ist, mindestens 30 Minuten lang in ein 70%iges Ethanolbad, während Sie untergetaucht sind. Ziehen Sie den Silikonschlauch mit dem Draht durch die Seitenarme des Reaktors.

Kommen Sie nun aus dem Bioreaktor und befestigen Sie die PGA-Gerüste im Inneren, indem Sie die Dacron-Manschetten über den ausgestellten Glaslippen befestigen. Verwenden Sie die überschüssige Naht, um jede Manschette festzubinden. Befestigen Sie anschließend mit Verbindungsstücken den Silikonschlauch auf einer Seite des Gerüsts mit einem Paar Bioreaktorarmen und befestigen Sie den Schlauch auf der anderen Seite des Gerüsts an den anderen beiden Armen.

Wenn die Anschlüsse installiert sind, ziehen Sie sie aus den Seitenarmen und spülen Sie den Bioreaktor mit Ethanol aus. Lassen Sie den Reaktor auf jeder Seite 10 Minuten einweichen. Stellen Sie den Bioreaktor auf einige Petrischalen und spülen Sie ihn mit Gewebekultur aus.

Wasser einstufen. Achten Sie darauf, mit einer Pipette auch das Netz und den Schlauch auszuspülen. Legen Sie nun einen sterilen Rührstab für den späteren Gebrauch in den Reaktor und trocknen Sie das Gerät über Nacht in der Haube mit eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem UV-Antrieb.

Lehnen Sie sich nicht über den Reaktor, da dies zu Kontaminationen führen kann. Während der Einrichtung müssen alle Anschlüsse mit Alkohol abgewischt werden. Bevor Befestigungen vorgenommen werden, werden dann viele der Verbindungen mit Paraform verstärkt, das vor dem Auftragen in 70%igem Ethanol eingeweicht werden muss. Also haben Sie viel von beidem.

Legen Sie vorsichtshalber eine sterile Petrischale über jede Bioreaktoröffnung, um das PGA-Gerüst im Inneren vor Verunreinigungen zu schützen. Beginnen Sie nun mit der Einrichtung, indem Sie die Injektionsöffnung am dritten unbenutzten Arm des Bioreaktors anbringen. Verbinden Sie als Nächstes den Infusionsbeutel mit dem Durchflusssystem.

Mit dem Walross-Schlauchset binden Sie das blaue Ende so nah wie möglich an der Y-Verbindung ab und klemmen Sie den Schlauch fest. Befestigen Sie den roten Schlauch am anderen Ende des Infusionsbeutels. Befestigen Sie dann den weißen Schlauch an einer Seite des Durchflusssystems.

Setzen Sie einen Dreiwege-Absperrhahn in das Durchflusssystem ein. Befestigen Sie ein Ende des Druckmessrohrs am Absperrhahn und befestigen Sie das andere Ende an der mittleren Öffnung des Infusionsbeutels. Um nun das Durchflusssystem teilweise zu füllen und auf Undichtigkeiten zu prüfen, geben Sie 350 Milliliter PBS und 1% Pilzzone in den Infusionsbeutel.

Stellen Sie mit einer 60-Milliliter-Spritze vor oder nach dem Anschließen an das Durchflusssystem den Absperrhahn ein, um die Durchflussrichtung von PBS zu steuern, und drücken Sie den Beutel zusammen, um das System zu spülen. Dieser Schritt kann entweder vor oder nach dem Sitzen in der Zelle durchgeführt werden. Nun können Zellen in einen Bioreaktor gesetzt werden.

In diesem Beispiel werden bei der Reanimation 8 Millionen SM-Zellen suspendiert, was etwa einem konfluenten T 75 in 1,25 Millilitern Medium entspricht, und sie gleichmäßig von Dacron-Verbindung zu Dacron-Verbindung auf das PGA-Gerüst tropfen. Nachdem Sie die Zellen hinzugefügt haben, wischen Sie den Rand des Bioreaktors mit Alkohol sauber. Vermeiden Sie es, mit der Maus über den Reaktor zu fahren.

Montieren Sie anschließend vorsichtig den Silikon-Stopfendeckel. Achten Sie darauf, dass die Unterseite des Deckels nicht freigelegt wird, wenn er aus dem Autoklavenbeutel genommen wird oder während eines der folgenden Befestigungsschritte. Befestigen Sie zunächst den Injektionsanschluss an der Ernährungssonde am Stecker.

Zweitens: Bringen Sie PTFE-Filter mit 0,20 Mikron an jedem der drei Flughäfen an. Dritter Absatz, filmen Sie die Injektionsöffnung. Setzen Sie den zusammengebauten Silikonstopfendeckel in den Glasbioreaktor ein.

Achten Sie darauf, dass die Ernährungssonde die sitzenden PGA-Gerüste nicht berührt. Anschließend mit Paraform versiegeln. Verbinden Sie nun den Bioreaktor mit dem Durchflusssystem und platzieren Sie den Bioreaktor und das Durchflusssystem in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Für 25 bis 30 Minuten muss der Reaktor auf die Seite gestellt und alle fünf Minuten gedreht werden. Füllen Sie dann, während Sie sich noch im Inkubator befinden, die Bioreaktorkammer mit 400 Millilitern von vier bis 10 Nährmedien mit einer Pumpe durch eine Ernährungssonde. Inkubieren Sie nun die gesäten Gerüste ohne pulsierendes Pumpen für sechs bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Während dieser Zeit ist kein Mediumwechsel oder eine Vitamin-C-Supplementierung erforderlich, bevor Sie die Pumpe einschalten, überprüfen Sie die Schläuche auf Undichtigkeiten oder Knicke. Passen Sie dann die Drehzahl der Pumpe so an, dass ein Druckbereich zwischen minus 30 und 270 Millimetern Quecksilbersäule eingehalten wird. Überwachen und halten Sie diesen Druck täglich in der gesamten Kultur aufrecht.

Der Mediumwechsel und die Supplementierung von Ascorbinsäure sollten zweimal pro Woche durchgeführt werden, während das Gerüst mit pulsierendem Pumpen wächst, um zuerst frisches Medium zuzuführen, die Injektionsöffnung und den PTFE-Filter an den Futterdeckeln anzubringen, sowohl für den Mediumwechsel als auch für die Entsorgung des Mediumabfalls. Setzen Sie dann den Ernährungsschlauch fest in die Pumpe mit zwei Richtungen ein und führen Sie ein Ende in die Zuführöffnung des Bioreaktors und das andere Ende in den Einfülldeckel ein. Beginnen Sie nun langsam mit dem Abpumpen von 200 Millilitern Medium.

Nach und nach kann die Pumpendrehzahl erhöht werden. Setzen Sie dann eine neue Ernährungssonde ein und beginnen Sie langsam, 200 Milliliter frisches Medium zu pumpen. Um dem Reaktor Ascorbinsäure zuzuführen, entfernen Sie 25 Milliliter des Mediums mit einer sterilen 30-Milliliter-Spritze.

Fügen Sie fünf Milliliter sterile Ascorbinsäurelösung hinzu und geben Sie dann die 25 Milliliter zurück. Mittelgroße Gefäße erscheinen undurchsichtig und erreichen nach achtwöchiger Kultur eine Wandstärke von etwa 250 Mikrometern. Unter pulsierenden Bedingungen zeigt die Hämat-, Toin- und Eosin-Färbung von manipulierten Gefäßen Veränderungen der Gewebemorphologie mit der Zeit und mit dem Pulsieren.

Die luminale Seite der Gefäße ist mit einer Tri-CHRO-Beize von L Masson gekennzeichnet. Für Kollagen zeigt, dass das vierwöchige gepulste Gefäß mehr Kollagen enthält als sein Gegenstück ohne Impulse, weiße Pfeile zeigen auf die verbleibenden PGA-Fragmente in den Gefäßen nach 12 Wochen. Die immunchemische Analyse zeigt die Expression des frühen Markers der glatten Muskulatur, Alpha-Aktin, des intermediären Markers für die glatte Muskulatur cal poin one und des späten Markers für die glatte Muskulatur, myosin, schwere Kette. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben bis acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alles so sauber und sauber wie möglich durchzuführen, indem Sie dieses Verfahren befolgen. Andere Methoden, wie z.B. die Modifikation des Lumens der konstruierten Gefäße, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bedeutung der luminalen Oberflächenmodifikation bei der Wartung von technischen Gefäßen während in vivo Studien. Nach seiner Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering, insbesondere des Gefäß-Engineerings, um potenzielle Mittel zur Behandlung von Erkrankungen der Herzkranzgefäße in Tiermodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie implantierbare technische Gefäßtransplantate durch eine dynamische Postkultur erhalten können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumhydroxid gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Augenschutz und Laborkittel sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.