Name: Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung biologischer Gefäßprothesen mit einem pulsatilen Bioreaktor. Diese Methode nutzt biologisch abbaubare PGA-Gitter und glatte Muskelzellen für die Geweberegeneration.

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Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health Grants R01 EB-008836 und R01 HL083895 finanziert (beide LEN). Wir könnten gerne Daryl Smith, der Universität Glasbläser, für die Herstellung der Bioreaktoren für unsere Forschung zu danken.

Autoclave Montieren und Autoklaven den Schlauch für die Flow-System und Bioreaktor Komponenten (Bioreaktor selbst und die Silikonstopfen Deckel), wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 angewiesen. Einfüllöffnung hat einen Stecker an einem Ende und einem offenen Ende auf der anderen Seite. Drei kurze Schläuche Segmente sind durch eine Silikonkappe für den Gasaustausch eingefügt. 1. Sewing PGA Mesh- <ol><li> Cut PGA Mesh 1.1cm x ~ 8cm Blatt (abhängig von Bioreaktor-Größe). </li><li> Saubere Silikonschlauch (3mm Innendurchmesser) mit destilliertem Wasser (20 Dh) und an der Luft trocknen, bevor Gebrauch. </li><li> Verwenden Sie Dexon 6,0 Naht zu PGA Mesh um den sauberen Silikonschlauch beginnend mit drei chirurgische Knoten durch einzelne Stiche folgten nähen. </li></ol> 2. PGA Gerüste Oberflächentechnik <ol><li> Dip PGA Gerüste in 1M NaOH für 1-2min und notieren Sie die Behandlungszeit und die gleichzeitig für alle PGA Gerüsten. </li><li> Spülen PGA Gerüste in dH2O Bäder für 2 Minuten 3 mal. </li><li> Pat PGA Gerüste trocken mit Kimwipes zwischen jedem Eintauchen in dH 2 O Bäder. </li><li> Dry PGA Gerüste unter Gewebekultur Haube an der Luft für 15 Minuten mit Gebläse auf dem Trockenen. </li></ol> 3. Sewing Dacron Arme <ol><li> Verwenden Sie Prolene 4,0 Naht in kleine Stücke von Dacron Manschetten (1cm) an jedes Ende der PGA Mesh mit einer Überlappung von 2-3mm zu nähen. Hinweis: Achten Sie darauf, Punktion Silikonschlauch (Abbildung 3). </li><li> Verwenden Sie die gleiche Naht zu drei Stiche rund um das freie Ende des Dacron Manschetten nähen. Achten Sie darauf, genug Nähte an den freien Enden der Prolene Naht für Schritt 5,1 (Abbildung 3) zu verlassen. </li></ol> 4. Versammlung der Bioreaktor (Tag vor Beginn des Bioreaktors Kultur) <ol><li> Soak genäht Mesh und Silikonschlauch, chirurgische Instrumente und einen dünnen Draht in einer 70% igen Ethanol-Bad für 20-30 Minuten. </li><li> Öffnen des Autoklaven Beutel mit dem Bioreaktor und tauchen Sie es in 70% Ethanol-Bad für mindestens 30 Minuten vor der Montage. Achten Sie darauf, in den Bioreaktor gründlich mit Ethanol. Exposure aller Bioreaktor Komponenten zu 70% Ethanol ist eine Ergänzung der Sterilisation Schritt. Dieser Schritt entfernt auch Endotoxin, die nicht durch Autoklavieren entfernt und ist schädlich für den Gefäßzellen. </li><li> Pull Silikonschlauch durch Seitenarme mit dünnen Draht, um es durchzuziehen. </li><li> Nehmen Bioreaktor von Ethanol-Bad (keep Mesh in Ethanol getaucht). Fix der PGA Gerüst im Inneren des Bioreaktors durch Befestigung Dacron Manschetten über die ausgestellten Glas die Lippen durch das Anziehen und Verzurren der Prolene Naht (Abb. 3). </li><li> Schließen Sie eine Seite des Bioreaktors Seitenarme zu Anschlüssen via Silikonschlauch. </li><li> Ziehen Sie anderen Seite der Silikonschlauch mit genug Spannung und legen Sie die verbleibenden zwei Anschlüsse in Silikonschlauch. Halten Sie Silikonschlauch dicht beim Einlegen Anschlüsse! </li><li> Setzen Sie Bioreaktor in Ethanol-Bad und bündig mit Ethanol durch vorsichtiges Ziehen Stecker aus der Seitenarme. </li><li> Flip-Bioreaktor über und ermöglichen eine für 10 Minuten einweichen. </li><li> Flip-Bioreaktor rechten Seite nach oben und genießen für weitere 10 Minuten. </li><li> Lassen Sie alle Ethanol. </li><li> Richten Sie drei große Petrischalen (10 cm) in Serie und Platz Bioreaktor in der Mitte Gericht zu halten das überschüssige Ethanol tropfte von den Enden der Röhren. </li><li> Flush Bioreaktor und PGA Mesh mit Gewebekulturen Wasser mit einem 5ml oder 10ml Pipette. Auch bündig Gewebekultur Wasser in Silikonschlauch. </li><li> Gut abtropfen lassen alles überschüssige Wasser in Petrischalen auf beiden Seiten des Bioreaktors. </li><li> Dry Bioreaktor über Nacht in Kapuze mit Gebläse-und UV-OFF. </li><li> Zusätzliche Hinweise: Achten Sie darauf sterile Rührstab wird im Bioreaktor. Achten Sie darauf, nicht zu "schweben" über den Bioreaktor von diesem Punkt an, um Verunreinigungen zu vermeiden. Cut up viel Parafilm-Streifen und genießen sie in einem kleinen 70% Ethanol-Bad (große Petrischale gut funktioniert). </li></ol> 5. Tag 1: Bioreaktor-Setup <ol><li> Legen Sie eine sterile Petrischale über die Öffnung der einzelnen Bioreaktor zur PGA Gerüst im Inneren von Verunreinigungen zu schützen. </li><li> Montieren Sie Flow-System zum Bioreaktor, wie in Abbildung 4 und Parafilm alle Anschlussfugen angegeben. <ol><li> Wipe-Anschlüsse zunächst mit Alkohol wischt. </li><li> Bringen Sie Injektionsport an Dritte, unbenutzt Arm des Bioreaktors. </li><li> Entfernen Walross Schläuche und binden Sie das blaue Ende des Kochsalzlösung verdünnt so nah an Y-Kreuzung wie möglich einzustellen. Pull Schlauchklemme in Ort, um keine Flüssigkeit zu übertragen, um diesen Teil des Rohres gewährleistet </li><li> Entfernen IV Tasche, und legen Walross-Schlauch (rot) bis weit Ende der IV-Beutel. Vergewissern Sie sich, um das Einführen Port mit Alkoholtupfer abwischen zuerst. </li><li> Bringen Sie Walross auf einer Seite des Flow-System (via weißen Ende Rohr). </li><li> Legen Sie 3-Wege-Hahn in Flow-System. </li><li> Entfernen Druckaufnehmer &amp; connect zum Dreiwegehahn. </li><li> Bringen Sie anderen Ende der Druckaufnehmer mittlere Öffnung in der Tasche. </li></ol></li><li> VerbindenBioreaktor, um den Fluss über das Y-Kreuzung. Verwenden Sie eine 60ml Spritze mit 350ml von 1% Fungizone (mix 5ml Fungizone mit 495ml PBS) bis IV Tasche hinzuzufügen. </li><li> Squeeze IV Tasche, um die fließenden System durch Anpassung der Hähne zu fließen von PBS ermöglichen Flush. Hinweis: Prüfen Sie im Bioreaktor zu gewährleisten, gibt es keine undicht. </li><li> Re-suspend 8 x10 6 SMCs (etwa ein konfluenten T75) in 1,25 ml des Mediums und Samen auf jedes PGA scafffold. Stellen Sie sicher, Zellsuspension wurde gleichmäßig tropfte auf den PGA Mesh-Dacron Kreuzung als auch auf der unteren Seite der PGA Mesh. </li><li> Wischen Rand des Bioreaktors mit Alkohol über rotierende Bioreaktor seitwärts vermeiden schweben zu wischen. </li><li> Silikon-Stopfen Deckel Montage (Abbildung 2) <ol><li> Peel Autoklavierbeutel wieder sorgfältig, um sicher nicht nach unten Deckel freizulegen. </li><li> Bringen Sie Injektionsport zu Magensonde am Stecker. </li><li> Bringen Sie PTFE 0,20 um Filter zu jedem der drei Luft-Anschlüsse. </li><li> Achten Sie darauf, nicht zu entlarven / touch unteren Deckel während dieses Prozesses. </li><li> Parafilm der Einspritzöffnung. </li></ol></li><li> Legen Sie die Silikonstopfen Deckel in Glas-Bioreaktor und stellen Sie sicher, dass die Magensonde im Inneren des Bioreaktors nicht berührt ausgesät PGA Gerüsten. Parafilm um den Deckel. </li><li> Legen Sie Bioreaktor mit dem Flow-System innerhalb des Inkubators (auf der Seite), und drehen Sie den Bioreaktor alle 5 Minuten für 25-30 Minuten. </li><li> Füllen Sie den Bioreaktor Kammer mit 400ml unserer 4-10 Kulturmedien wie beschrieben (Tabelle 1). Das Kulturmedium wird "optimiert" für Schweine entwickelt Arterien. </li></ol> 6. Tag 6-7: Einschalten der Pumpe, und die ersten Fütterung <ol><li> Wachsen die Samen Gerüste statisch ohne pulsatile Pumpen durch den Silikonschlauch für 6-7 Tage. Es besteht keine Notwendigkeit für mittlere ändern oder Vitamin-C-Supplementation während dieser Zeit. </li><li> Achten Sie darauf, keine Lecks vorhanden sind von PBS oder Knicken der Flow-System Schlauch vor dem Einschalten der Pumpe. </li><li> Schalten Sie die Pumpe des Flow-System und stellen Sie sicher, Einstellung der Pumpe so einstellen, dass der Druck etwa 270/-30mmHg liest. </li><li> Rekord Druck täglich während der Kultur und halten den Druck auf 270/-30mmHg. Druckmessumformer kann mit einem Computer zu lesen und zu überwachen den Druck angeschlossen werden. </li></ol> Erste Fütterung <ol start="5"><li> Montieren Injektionsport &amp; PTFE-Filter auf Futterdeckel sowohl für mittlere Veränderung und mittlere Abfall Absetzung Zwecke. </li><li> Legen Sie die Magensonde fest auf die Pumpe und stecken Sie das eine Ende der Fütterung Port des Bioreaktors und das andere Ende an die Fütterung Deckel. Achten Sie darauf, die Einspritzöffnungen mit Ethanol Tücher zu wischen. </li><li> Verwenden Sie einen bidirektionalen Masterflex-Pumpe zu Pumpe aus 200 ml Medium. Dann verwenden Sie eine neue Magensonde zu 200 ml frischem Medium zurück Pumpe in den Bioreaktor. Immer mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit zu starten, besonders wenn Fördermedium zurück in den Bioreaktor. </li><li> Ändern Sie mittel-und Ergänzung Ascorbinsäure 2x/Woche. Um Ascorbinsäure, verwenden Sie eine 30ml Spritze nehmen Sie 25ml des Mediums und legen Sie es beiseite in das Gewebe Kapuze. Lösen Sie 25 mg Ascorbinsäure in 5 ml PBS und filtern es durch ein 0,22 um-Filter. Zunächst injizieren die sterile Ascorbinsäure in die Magensonde und fügen wieder die 25ml Medium aus früheren übernommen. Das Medium Rezept ist in Tabelle 1 angegeben. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Schläuche und Anschlüsse für die Flow-System Montage ist oben abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Silikon-Stopfen Deckel Montage ist oben abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Schematische Darstellung Bioreaktor Montage sind oben gezeigt. Im Bioreaktor Dacron Manschetten auf das Glas Arme mit dem blauen Faden Knoten befestigt sind. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Flow-System angeschlossenen Schläuchen und Bioreaktor ist oben gezeigt. L/S18 Schlauch durch eine Masterflex Pumpe gepumpt werden und damit Motor für die Strömung. Der Drucksensor wird der Druck vor dem Eintritt in den Bioreaktor am oberen Strom zu messen. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Image of geerntet entwickelt Schiff. Engineered Schiffe erscheinen undurchsichtig sein und erreichen eine Wandstärke von ca. 250μm nach 8-Wochen-Kultur unter pulsatilen Bedingungen. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Hämatoxylin und Eosin gefärbten Querschnitten konstruiert Gefäßen. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße.C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. L zeigt der luminalen Seite der Gefäße. Die Skalen bar ist 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Masson Flecken für Kollagen (blau) für Querschnitte von technischen Schiffe. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. Beachten Sie, dass der 4-wöchigen gepulsten Schiff mehr Kollagen als die nicht-gepulsten Gegenstück zeigt. Weiße Pfeile zeigen auf verbleibende PGA-Fragmente in den Gefäßen. Die Skalen bar ist 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Abbildung 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Immunochemistry Färbung von SMC Markern bei Rindern entwickelt Arterien. Glatte Muskelzellen α-Aktin, Calponin-1 und der glatten Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) sind frühe, mittlere und späte SMC kontraktilen Marker jeweils. Bis zum Ende des 12-Wochen-Kultur, die Zellen in der Gefäßwand ausdrücken SM α-Aktin und moderate Mengen an Calponin-1 und SMMHC. Die Waage-Bar ist 20 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Betrag </td></tr><tr><td> DMEM (DME / low modifiziert) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (fötales Rinderserum) hitzeinaktiviertem </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamin C (gelöst in PBS oder DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (gelöst in 5 ml PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1,5 pg (gelöst in1 ml PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penicillin G auf 10.000 Einheiten / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) bei 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) bei 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Komponenten von "4-10" Medium sind in der obigen Tabelle dargestellt. Mit Ausnahme von PDGF-BB und bFGF, sind alle anderen Komponenten durch eine 0,2 um-Filter vor dem Gebrauch gefiltert werden.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
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</ol>

Die Qualität der entwickelten Schiffe ist zu einem großen Teil von der Qualität der SMCs in Gewebekultur verwendet diktiert. Die kritischen Aspekte der SMC Phänotyp gehören kontraktilen Morphologie, niedrigen Durchgang Nummer, und die Fähigkeit, im Inneren des Bioreaktors vermehren. Wir empfehlen, dass die Passage Zahl nicht größer als P3 werden zum Zeitpunkt der Zellaussaat auf die Polymer-Gerüst. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, um zu bestätigen, dass die SMC Quellen Mykoplasmen frei vor dem Gebrauc...

<table><tbody><tr><td>FBS (fetalem Rinderserum) hitzeinaktiviert</td><td>Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF-basic</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>234-FSE</td><td></td></tr><tr><td>rrPDGF-BB</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>520-BB</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PENNA</td><td></td></tr><tr><td>Kupfersulfat(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8790</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7469-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Silikonstopfen</td><td>Cole-Parmer</td><td>06298-24</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex-Schläuche L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-16, 06508-18</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex-Pumpe</td><td>Cole-Parmer</td><td>7553-80</td><td></td></tr><tr><td>Dacron-Hülse</td><td>Maquet</td><td>174406</td><td></td></tr><tr><td>PGA-Vlies</td><td>Concordia</td><td>MO000877-01</td><td></td></tr><tr><td>4-0 1,5 metrische Surgipro-II-Naht</td><td>Syneture</td><td>VP-557-X</td><td></td></tr><tr><td>6-0 0,7 metrische Dexon-Naht</td><td>Syneture</td><td>7538-11</td><td></td></tr><tr><td>0,22&amp;mu;m PTFE-Filter</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwegehahn</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>593WSC</td><td></td></tr><tr><td>Druckaufnehmer</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX212</td><td></td></tr><tr><td>IV-Beutel</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>R4R2110</td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungsset für Infusionen</td><td>Arrow International</td><td>W20030</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Schlauch</td><td>Saint-Gobain</td><td>F05027</td><td></td></tr></tbody></table>

engineering biological-based gefäßprothesen mit einem pulsatile bioreaktor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Viel Aufwand wurde dabei auf die Entwicklung und Fortschritt der Methodik zu regenerieren funktionale kleinem Durchmesser arterielle Bypässe. In der physiologischen Umgebung, sind sowohl mechanische als auch chemische Stimulation erforderlich, um die richtige Entwicklung und Funktionalität der arteriellen Gefäße 1,2 zu halten. Bioreaktor Kultur-Systeme von unserer Gruppe entwickelt wurden entwickelt, um Schiff Regeneration innerhalb einer genau kontrollierten chemo-mechanischen Umgebung nachahmen, die von einheimischen Schiffen zu unterstützen. Unsere Bioreaktor Montage-und Wartungsarbeiten sind recht einfach und hoch reproduzierbare 3,4. Glatte Muskelzellen (SMC) sind auf einem röhrenförmigen Polyglykolsäure (PGA) Netz, das über kompatible Silikonschlauch threaded ist und kultiviert in den Bioreaktor mit oder ohne pulsatile Stimulation für bis zu 12 Wochen geimpft. Es gibt vier Attribute, die unsere Bioreaktor von einigen Vorgängern unterscheiden. 1) Im Gegensatz zu anderen Kultur-Systemen, die nur simulieren die biochemische Umgebung von nativen Blutgefäßen, unsere Bioreaktor erzeugt auch eine physiologische pulsatile Umwelt durch die Anwendung zyklische radiale Belastung der Gefäße in der Kultur. 2) Mehrere technisch Schiffe können gleichzeitig unter verschiedenen mechanischen Bedingungen innerhalb einer kontrollierten chemischen Umgebung kultiviert werden. 3) Der Bioreaktor ermöglicht eine Mono-Schicht von Endothelzellen (EC), um einfach auf der luminalen Seite von Engineered Schiffe für die Tier-Implantation Modelle beschichtet werden. 4) Unsere Bioreaktor können auch Kultur entwickelt Schiffen mit unterschiedlichem Durchmesser Größe reichte von 1 mm bis 3 mm, wodurch der Aufwand für maßgeschneiderte einzelnen Bioreaktor zu einem bestimmten Durchmesser passen. Das konstruierte Schiffe in unserem Bioreaktor kultiviert ähneln nativen Blutgefäßen histologisch zu einem gewissen Grad. Zellen in der Gefäßwand ausdrücken reifen SMC kontraktilen Marker wie glatte Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) 3. Eine erhebliche Menge an Kollagen in der extrazellulären Matrix, die für ultimative mechanische Festigkeit des konstruierten Schiffen 5 ist hinterlegt. Die biochemische Analyse zeigt auch, dass Kollagen-Gehalt von technischen Schiffe ist vergleichbar mit dem nativen Arterien 6. Wichtig ist, dass die pulsatile Bioreaktor konsequent Schiffe, die mechanischen Eigenschaften, die erfolgreiche Implantation Experimente erlauben in Tiermodellen 3,7 aufweisen regeneriert. Darüber hinaus kann dieses Bioreaktors weiter modifiziert werden, um Echtzeit-Beurteilung und Verfolgung von Kollagen Remodeling im Laufe der Zeit, nicht-invasiv mit Hilfe eines nicht-linearen optischen Mikroskopie (NLOM) 8 zu ermöglichen. Zum Abschluss sollte diese Bioreaktor als eine hervorragende Plattform, um die grundlegenden Mechanismen, die die Regeneration von funktionellen kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regulieren Studie dienen.

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Methodik zur Regeneration funktioneller kleindurchmessriger arterieller Bypässe zu entwickeln und zu verbessern. In der physiologischen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biologisch basierte vaskuläre Transplantate mithilfe eines pulsierenden Bioreaktorsystems herzustellen. Dies wird erreicht, indem ein biologisch abbaubarer Scaffhold aus PGA-Netz hergestellt wird, auf dem die Zellen wachsen können, und dieser in einer Bioreaktorkammer montiert wird. Die Scaffolds werden anschließend mit glatten Muskelzellen besiedelt, und ein Deckel mit Luft- und Nährstoffzufuhr verschließt die Bioreaktorkammer. Der Bioreaktor wird anschließend mit einem Flusssystem verbunden, um pulsierenden Fluss an die Gefäße im Bioreaktor bereitzustellen. In dem Reaktor wachsen die Zellen in die Gefäße hinein, die immunchemische, biochemische und mechanische Tests bestehen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie der koronaren Herzkrankheit, da dieses Verfahren ein aussichtsreicher Ansatz zur Regenerierung implantierbarer Gefäßprothesen mit kleinem Durchmesser für arterielle Bypass-Operationen ist.Obwohl diese Methode Einblicke in die vaskuläre Gewebeengineering ermöglicht, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, die zyklischen physiologischen Kräften ausgesetzt sind. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben. Sie benötigen viel Übung, um die Fähigkeiten vollständig zu beherrschen.Die Idee für diesen Ansatz entstand zunächst, als wir die Bedeutung der Anwendung physiologischer mechanischer Reize zur Regeneration von gewebetechnischen Konstrukten erkannten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bioreaktor-Sing-Prozesse schwer zu erlernen sind, da sie aus vielen Einzelschritten bestehen und nur durch eine detaillierte Demonstration erworben werden können. Beginnen Sie damit, 30 cm lange Abschnitte von Silikonrohr mit einem Innendurchmesser von drei Millimetern mit destilliertem Wasser zu reinigen und an der Luft trocknen zu lassen.Verwenden Sie eine Schere, um mit einer Klemme einen Abschnitt der PGA-Netzstruktur von 1,1 Zentimeter mal acht Zentimeter für jedes Tubing-Stück auszuschneiden, befestigen Sie das PGA-Netz mit Dexon 6.0 Nahtmaterial am Tubing, knoten Sie drei chirurgische Knoten und führen Sie anschließend einzelne Stiche mit der Klemme durch; das befestigte Netz bildet ein PGA-Gerüst. Spülen Sie die Gerüste, indem Sie sie zunächst ein bis zwei Minuten lang in eine einmolare Natriumhydroxidlösung eintauchen und danach dreimal je zwei Minuten lang in destilliertem Wasser. Tupfen Sie sie zwischen den Spülgängen trocken und lassen Sie sie nach dem dritten Spülvorgang 15 Minuten lang in einer Abzugshaube an der Luft trocknen.Nach dem Trocknen jeweils eine Dacron-Hülse von einem Zentimeter Länge mit drei Stichen an jedes Ende des Netzes annähen. Dabei einen Überlappungsbereich von zwei bis drei Millimetern am Schlauch belassen und den Schlauch nicht durchstechen. Unbedingt etwa 15 Zentimeter freies Nahtmaterial für die spätere Verwendung in diesem Protokoll stehen lassen.Alle Bioreaktorbestandteile und Werkzeuge werden zuvor autoklaviert. Am Tag vor dem Start der Bioreaktorkultur muss der Bioreaktor teilweise zusammengebaut werden, wobei die Bioreaktorbestandteile, die Scaffolds, die Silikon-Schlauchleitung, die chirurgischen Instrumente und ein dünner Draht, der länger ist als die Länge des Bioreaktors, mindestens 30 Minuten lang in einer 70 %igen Ethanol-Lösung untergetaucht werden. Verwenden Sie den Draht, um die Silikonleitung durch die Seitenarme des Reaktors zu ziehen.Jetzt den Bioreaktor hervorholen und die PGA-Gerüste durch Befestigen der Dacron-Manschetten über die aufgeweiteten Glasränder im Inneren anbringen. Das überschüssige Nahtmaterial verwenden, um jede Manschette festzuziehen. Anschließend mithilfe von Verbindungsstücken die Silikon-Schläuche an einer Seite des Gerüsts mit einem Paar Bioreaktorarme verbinden und die Schläuche auf der anderen Seite des Gerüsts mit den beiden anderen Armen verbinden.Wenn die Anschlüsse installiert sind, ziehen Sie sie aus den Seitenarmen heraus und spülen Sie den Bioreaktor mit Ethanol aus. Lassen Sie den Reaktor auf jeder Seite 10 Minuten lang einweichen. Stellen Sie den Bioreaktor auf einige Petrischalen und spülen Sie ihn mit Gewebekulturmedium aus.Spülen Sie das Wasser. Achten Sie darauf, das Sieb und die Schläuche ebenfalls mit einer Pipette ausspülen. Geben Sie nun einen sterilen Rührstab in den Reaktor für die spätere Verwendung und trocknen Sie die Apparatur ab diesem Zeitpunkt über Nacht im Abzug bei eingeschaltetem Gebläse und ausgeschalteter UV-Lampe. Lehnen Sie sich nicht über den Reaktor, da dies zu Kontaminationen führen könnte. Während der Einrichtung müssen alle Anschlüsse mit Alkohol sauber abgewischt werden. Vor dem Anbringen vieler Verbindungsstellen werden die Gelenke anschließend mit Paraform verstärkt, das vor der Anwendung in 70 %igem Ethanol getränkt werden muss. Halten Sie daher von beidem ausreichend bereit.Platzieren Sie als Vorsichtsmaßnahme eine sterile Petrischale über jeder Bioreaktoröffnung, um das PGA-Gerüst im Inneren vor Kontaminationen zu schützen. Beginnen Sie nun mit der Einrichtung, indem Sie die Injektionsöffnung an dem dritten unbenutzten Arm des Bioreaktors befestigen. Schließen Sie als Nächstes die Infusionsflasche an das Flusssystem an.Verwenden Sie bei dem Walrusschlauchset das blaue Ende so nahe wie möglich an der Y-Verbindung abzubinden und den Schlauch abzuklemmen. Befestigen Sie den roten Schlauch am entfernten Ende der Infusionsflasche. Anschließend befestigen Sie den weißen Schlauch an einer Seite des Durchflusssystems.Fügen Sie einen Dreifach-Hahn in das Flusssystem ein. Verbinden Sie ein Ende des Druckmesssonden-Schlauchs mit dem Hahn und das andere Ende mit der mittleren Öffnung des Infusionsbeutels. Um das Flusssystem teilweise zu füllen und auf Leckagen zu überprüfen, geben Sie nun 350 Milliliter PBS und 1 % Fungi Zone in den Infusionsbeutel.Stellen Sie mithilfe einer 60-Milliliter-Spritze vor oder nach dem Anschließen an das Durchflusssystem den Hahn so ein, dass die Fließrichtung von PBS reguliert wird, und drücken Sie den Beutel, um das System zu spülen. Dieser Schritt kann entweder vor oder nach dem Einbringen der Zellen durchgeführt werden. Nun können die Zellen im Bioreaktor eingebracht werden.In diesem Beispiel resuspendieren Sie 8 Millionen SM-Zellen, was etwa einer konfluenten T-75-Flasche entspricht, in 1,25 Milliliter Medium und geben sie gleichmäßig auf das PGA-Gerüst von Dacron-Verbindung zu Dacron-Verbindung. Nach dem Zugabe der Zellen wischen Sie den Rand des Bioreaktors mit Alkohol sauber. Vermeiden Sie es, sich über den Reaktor zu beugen.Als Nächstes montieren Sie vorsichtig den Silikonstopfen-Deckel. Achten Sie darauf, die Unterseite des Deckels nicht freizulegen, wenn er aus der Autoklavierbeutel entnommen wird oder während der folgenden Befestigungsschritte. Befestigen Sie zunächst die Injektionsöffnung am Ernährungsschlauch am männlichen Verbinder.Zweitens befestigen Sie PTFE-0,20-Mikron-Filter an jedem der drei Anschlüsse. Drittens, filmen Sie die Einspritzstelle. Setzen Sie den zusammengesetzten Silikongummi-Stopfen in den Glas-Bioreaktor ein.Stellen Sie sicher, dass die Fütterungssonde die sitzenden PGA-Gerüste nicht berührt. Versiegeln Sie anschließend mit Parafilm. Schließen Sie nun den Bioreaktor an das Flusssystem an und stellen Sie den Bioreaktor sowie das Flusssystem in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator.Der Reaktor muss 25 bis 30 Minuten lang seitlich liegend positioniert werden und alle fünf Minuten gedreht werden. Als Nächstes füllen Sie die Bioreaktorkammer unter weiterer Inkubation mit 400 Milliliter Kulturmedium der Konzentration vier bis 10 über eine Pumpe und eine Zuführleitung. Inkubieren Sie die besiedelten Träger anschließend ohne pulsatile Pumpung sechs bis sieben Tage bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid.Während dieser Zeit vor dem Einschalten der Pumpe besteht keine Notwendigkeit für einen Mediumwechsel oder eine Vitamin-C-Zugabe. Überprüfen Sie die Schläuche auf Lecks oder Knicke. Stellen Sie anschließend die Drehgeschwindigkeit der Pumpe so ein, dass ein Druckbereich zwischen minus 30 und 270 Millimeter Quecksilber eingehalten wird. Überwachen und halten Sie diesen Druck während der gesamten Kulturzeit täglich konstant.Wechseln Sie das Medium und ergänzen Sie zweimal wöchentlich Ascorbinsäure, während das Gerüst mit pulsierender Pumpe wächst, um frisches Medium zuzuführen. Bringen Sie zunächst den Injektionshafen und den PTFE-Filter an den Zufuhrdeckeln sowohl für den Mediumwechsel als auch für die Entsorgung des verbrauchten Mediums an. Danach befestigen Sie den Zufuhrschlauch fest in der bidirektionalen Pumpe und führen ein Ende in den Zufuhrhafen des Bioreaktors und das andere Ende in den Zufuhrdeckel ein. Pumpen Sie nun langsam 200 Milliliter Medium aus. Allmählich kann die Pumpgeschwindigkeit erhöht werden. Anschließend einen neuen Zufuhrschlauch anschließen und langsam mit dem Einpumpen von 200 Milliliter frischem Medium beginnen. Um Ascorbinsäure in den Reaktor zuzugeben, 25 Milliliter Medium mit einer sterilen 30-Milliliter-Spritze entnehmen.Geben Sie fünf Milliliter sterile Ascorbinsäurelösung hinzu und füllen Sie anschließend auf 25 Milliliter auf. Die hergestellten Gefäße erscheinen undurchsichtig und erreichen nach einer achtwöchigen Kultur eine Wanddicke von etwa 250 Mikrometern. Unter pulsierenden Bedingungen zeigen Hämatoxylin-Eosin-Färbungen der hergestellten Gefäße zeitabhängige und pulsationsabhängige Veränderungen der Gewebemorphologie.Die luminalen Seite der Gefäße ist mit einer Masson-Dreifachfärbung angegeben. Die Kollagenfärbung zeigt, dass das vier Wochen gepulste Gefäß mehr Kollagen aufweist als sein nicht gepulstes Gegenstück. Weiße Pfeile zeigen auf verbliebene PGA-Fragmente in den Gefäßen nach 12 Wochen. Die immunchemische Analyse zeigt die Expression des frühen glattmuskulären Markers Alpha-Aktin, des intermediären glattmuskulären Markers Calponin-1 und des späten glattmuskulären Markers Myosin-Schwerketten. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in sieben bis acht Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets so sauber und steril wie möglich vorzugehen, indem man dieser Anleitung folgt. Andere Methoden, wie beispielsweise die Modifikation des Lumens der konstruierten Gefäße, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, etwa die Bedeutung der Modifikation der luminalen Oberfläche für die Erhaltung der konstruierten Gefäße während in-vivo-Studien. Nach ihrer Entwicklung.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des Gewebeengineerings, insbesondere des vaskulären Engineerings, potenzielle Ansätze zur Behandlung von koronaren Herzkrankheiten in Tiermodellen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie implantierbare, engineerierte vaskuläre Transplantate durch eine dynamische Postalkultur hergestellt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumhydroxid gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Augenschutz und Laborkittel stets getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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