Navigieren in den massenspektrometrischen Proteomdaten mit kostenlosen Berechnungswerkzeugen

Massenspektrometrie-basierte Proteomdaten sind in offenen Datenbanken verfügbar und mit kostenlosen Tools zugänglich. Angesichts der Komplexität von Datenbankrecherchen und -beschreibungen fehlt vielen Biologen das Wissen, um diese Datensätze zu nutzen. Hier finden Sie eine Anleitung zur Verwendung kostenloser Tools für die grundlegende Suche nach proteomischen Daten.

Unsere Arbeit bietet Biologen einen Leitfaden zur Analyse komplexer proteomischer Daten mit kostenlosen Werkzeugen. Unser Ziel ist es, sie in die Lage zu versetzen, Ergebnisse zu validieren und öffentliche Datensätze zu erforschen. Viele Biologen können öffentliche Proteomdaten nicht verwenden, weil es keine klaren Anhaltspunkte gibt.

Unsere Arbeit schlägt eine Brücke dazu und ermöglicht eine Validierung ohne neue Wildtierexperimente. Unsere Arbeit verwendet kostenlose, hochmoderne Software, die herstellerunabhängig ist. Diese Tools sind schneller, empfindlicher und bieten eine präzisere Proteomerkennung als viele herkömmliche Tools.

Laden Sie zunächst die FASTA-Datei des Referenzproteoms aus der UniProt-Datenbank herunter. Klicken Sie auf die Schaltfläche FASTA hinzufügen, um die Referenzproteomdatei in die DIA-NN-Software zu laden. Wählen Sie die beiden Optionen FASTA Digest für die Generierung von Bibliotheken ohne freie Suche und Deep-Learning-basierte Spektren, RTs und IMs Vorhersage im Abschnitt Precursor-Ionengenerierung aus.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen, um eine vorhergesagte Spektralbibliothek zu generieren. Deaktivieren Sie die beiden Optionen im Abschnitt Erzeugung von Vorläuferionen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Typ, die dem Dateiformat unter dem Eingabebereich entspricht, um die DIA-Daten zu laden.

Legen Sie nun sowohl die Massengenauigkeit als auch die MS1-Genauigkeit im Abschnitt algorithmus auf null parts per million fest. Passen Sie die Einstellungen für den Präcursor- und Fragmentmassenbereich im Abschnitt "Erzeugung von Vorläuferionen" entsprechend dem Versuchsaufbau an. Lassen Sie die anderen Softwareeinstellungen unverändert.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Ausführen. Warten Sie, bis Fertig auf der Bedienoberfläche angezeigt wird, um anzuzeigen, dass die Analyse abgeschlossen ist. Klicken Sie nach der Installation auf das Fragment-Pipe-Symbol, das sich im bin-Ordner befindet.

Navigieren Sie zur Registerkarte "Konfiguration", um alle abhängigen Einstellungen anzuzeigen. Überprüfen Sie, ob die Module MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN und Python auf Ihrem System verfügbar sind. Wenn Module fehlen, klicken Sie auf Update herunterladen oder herunterladen, um sie abzurufen.

Wechseln Sie nun zur Registerkarte Workflow. Wählen Sie Standard aus dem Workflow-Dropdown-Menü und klicken Sie auf Workflow laden. Klicken Sie dann auf Dateien hinzufügen, um die Dateipfade einzugeben.

Vergeben Sie den Namen des Experiments und die biologische Replikatnummer unter Dateien zuweisen oder lassen Sie das Feld leer. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Datenbank, um dorthin zu wechseln. Laden Sie eine FASTA-Datei von der Festplatte oder laden Sie eine Datei herunter, die der Beispielspezies entspricht.

Wählen Sie während des Downloads die Optionen Nur überprüfte Sequenzen aus, fügen Sie Köder hinzu und fügen Sie häufige Verunreinigungen hinzu, um einen einfachen Lauf zu ermöglichen. Klicken Sie auf die Registerkarte MSFragger, um die Ansicht zu ändern. Wählen Sie die geschlossene Suchstandardkonfiguration aus und klicken Sie auf Laden.

Behalten Sie unter den Einstellungen für den Spitzenabgleich alle Standardwerte bei. Wählen Sie sowohl für die Kalibrierung als auch für die Optimierung keine aus, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen. Passen Sie für den Proteinverdau die Parameter basierend auf den Anforderungen Ihres Experiments an, und behalten Sie die verbleibenden Standardeinstellungen bei.

Wechseln Sie nun zur Registerkarte Validierung. Deaktivieren Sie RT vorhersagen und Spektren vorhersagen, da diese Optionen für datenunabhängige Erfassungs-Workflows gedacht sind. Klicken Sie auf die Registerkarte quant MS1.

Wählen Sie Run MS1 quant (MS1-Quant ausführen) aus und klicken Sie dann auf Load Quant defaults. Wählen Sie Ionenquant und belassen Sie alle anderen Einstellungen auf den Standardwerten. Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte Ausführen, um fortzufahren.

Wählen Sie das gewünschte Ausgabeverzeichnis aus und klicken Sie auf Ausführen, um mit der Analyse der Daten zu beginnen. Bei Patienten mit duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) zeigten SERPINA5 und HPSE eine signifikant reduzierte Expression, während FGB im Vergleich zu normalen Personen eine erhöhte Expression im Serum aufwies. In hepatozellulären Karzinom-Tumorproben zeigten ENO3, PLS3, MTAP, SERPINB9 und ITPR2 eine verminderte Expression im Vergleich zu gepaarten Geweben, während ME1, CYP27A1, RPS16 und ATP5PF signifikant erhöht waren.

Die Visualisierung der Heatmap zeigte eine durchweg erhöhte Proteinexpression im Serum von PDAC-Patienten im Vergleich zu normalen Personen. Die genontologische Anreicherungsanalyse von PDAC-Serum ergab eine signifikante Hochregulation von Prozessen im Zusammenhang mit Gerinnung und Hämostase. Die GO-Analyse von hepatozellulären Karzinomtumoren ergab eine Anreicherung von Nukleotid- und Stoffwechselprozessen, einschließlich des Purinnukleotidstoffwechsels und der NAD-Stoffwechselwege.

Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs von PDAC-Serum zeigte eine signifikante Aktivierung des Komplement- und Gerinnungskaskadenwegs sowie den Abbau von Glykosaminoglykanen. Die KEG-Analyse in hepatozellulären Karzinom-Tumorproben identifizierte eine Anreicherung der PPAR-Signalgebung, des Kohlenstoffstoffwechsels und der neurodegenerativen Krankheitswege, wenn auch mit geringerer statistischer Signifikanz. Das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk für hochregulierte PDAC-Serumproteine zeigte einen zentralen Cluster, an dem Gerinnungsfaktor 11, die Fibrinogen-Beta-Kette und der Plasma-Serin-Protease-Inhibitor sowie mehrere isolierte Proteine, darunter HPSE, CD5-Antigen-like und CRISP3, beteiligt sind.