Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Wir haben eine optimierte Methode entwickelt, um das Proteom in bestimmten Regionen höherer Gewebeproben mittels Massenspektrometrie zu untersuchen. Unser Ziel ist es, die Proteomiktechnik, einschließlich der Probenvorbereitung und der Massenspektrometrie, zu verbessern, um eine hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu erreichen. Eine Herausforderung in der FFPE-basierten räumlichen Proteomik ist der unvollständige Proteinverdau, der die Gesamtproteinabdeckung verringert.

Um diese zu überwinden, sind optimierte Aufschlussprotokolle und verbesserte Massenspektrometrie-Strategien erforderlich, um die Proteomtiefe und -genauigkeit zu verbessern. Wir identifizierten unterschiedliche Proteinveränderungen bei verschiedenen Arten von Pankreaserkrankungen und gaben Aufschluss über die Unterschiede zwischen gutartigen und präkanzerösen Erkrankungen. Diese Erkenntnisse könnten bei der Früherkennung von Bauchspeicheldrüsenkrebs helfen.

Unser Ziel ist es, die Proteinase-Methode für Patienten weiterzuentwickeln, um eine hochauflösende Proteinkartierung in Geweberegionen zu erreichen. Mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik versuchen wir, regionenspezifische molekulare Signaturen zu identifizieren, die zur Entdeckung von Biomarkern beitragen. Unser Ansatz integriert diese Patienten-Trappings und -Vorbereitungen mit datenunabhängiger Anlass-Massenspektrometrie, um schnell qualitativ hochwertige Proteomdaten aus ausgewählten FFPE-Geweberegionen zu generieren.

Diese Methode ermöglicht eine sehr gute Quantifizierung des räumlichen Proteoms. Bereiten Sie zunächst einen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten oder immunhistochemisch gefärbten Gewebeträger mit dem von einem Pathologen angegebenen Bereich von Interesse vor. Platzieren Sie den ungefärbten Gewebeobjektträger und den gefärbten Gewebeobjektträger Rücken an Rücken und achten Sie dabei auf eine korrekte Ausrichtung.

Entfernen Sie mit einem Skalpell Geweberegionen, die nicht von Interesse sind, und kratzen Sie die interessierenden Geweberegionen in Richtung der Mitte des Objektträgers. Übertragen Sie das gesammelte Gewebe in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinbindung und geben Sie 180 Mikroliter SDS-Lysepuffer in jedes Röhrchen. Führen Sie die Sondenbeschallung bei 20 % Amplitude für 10 Zyklen von fünf Sekunden ein und fünf Sekunden aus durch.

Inkubieren Sie die Proben nun 3,5 Stunden lang bei 100 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 1.000 g. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Dann wird bei 16.000 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um Gewebereste vom Überstand zu trennen. Den Überstand in ein sauberes, beschriftetes Röhrchen geben und bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Für die Acetonfällung geben Sie die Proteinprobe, die 100 bis 300 Mikrogramm entspricht, in ein Aceton-kompatibles Röhrchen. Fügen Sie dann eiskaltes, auf minus 20 Grad Celsius vorgekühltes Aceton in einem Volumen hinzu, das das Fünffache des Probenvolumens beträgt. Inkubieren Sie die Mischung bei minus 20 Grad Celsius für 18 Stunden.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 16.000 g. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Proteinpellet zu stören. 500 Mikroliter bei minus 20 Grad Celsius temperiertes Aceton zugeben und zentrifugieren.

Nach dem Dekantieren des Überstands wird die Probe an der Luft getrocknet. Bereiten Sie den Suspensionspuffer in deionisiertem Wasser vor. Geben Sie dann 40 Mikroliter des vorbereiteten Puffers in das Probenröhrchen und wirbeln Sie es gründlich auf, um das luftgetrocknete Proteinpellet aufzulösen.

Die Probe wird 35 Minuten lang bei 100 Grad Celsius bei 1.000 g in einen Schüttelinkubator gegeben. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter des alkylierenden Reagenzes in die Probe und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 300 g. Geben Sie in einem chemischen Abzug fünf Mikroliter der 10%igen Trichloressigsäure in die Probe, so dass das Gesamtvolumen 55 Mikroliter beträgt.

Überprüfen Sie den pH-Wert der Probe mit pH-Papier, um sicherzustellen, dass er kleiner als eins ist. Geben Sie als Nächstes 350 Mikroliter Bindungspuffer eins in die Probe, um Proteine einzufangen. Setzen Sie die Suspensionsauffangsäule in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen ein und überführen Sie die gesamte Probe, einschließlich aller unlöslichen Materialien, in die Säule.

Die Säule wird 50 Sekunden lang bei 4.000 g zentrifugiert, um Proteine einzufangen. Fügen Sie dann 400 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu. Nach dem Zentrifugieren den Durchfluss verwerfen.

Nach dem letzten Waschen wird die Säule 1,25 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert, um sicherzustellen, dass der erste Puffer vollständig durchläuft. Geben Sie 125 Mikroliter Aufschlusspuffer in die Suspensionsauffangsäule und verschließen Sie sie, um eine Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Probe 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln.

Geben Sie nun 80 Mikroliter Elutionspuffer eins in die Suspensionsfangsäule und zentrifugieren Sie 1,25 Minuten lang bei 4.000 g. Ziehen Sie die eluierten Peptide und übertragen Sie sie in ein sauberes neues Röhrchen. Nach der Peptidquantifizierung lyophilisieren Sie 20 Mikrogramm Peptide.

Die lyophilisierten Peptide werden in 40 Mikrolitern wässrigem Puffer, der 3 % Acetonitril enthält, in 0,1 % Ameisensäurewasser erneut gelöst und 10 Minuten lang in einem Ultraschallbad beschallt. Die Probe wird 60 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert und der Überstand für die massenspektrometrische Analyse in Fläschchen überführt. Injizieren Sie zwei Mikroliter jeder Probe mit dem Autosampler des Nano-Flüssigchromatographie-Massenspektrometriesystems.

Trennen Sie die Peptide auf einer Umkehrphasensäule, die mit drei Mikrometern C18-Material gefüllt ist, unter Verwendung eines 127-minütigen Gradienten von fünf bis 35 % Acetonitril bei 100 Nanolitern pro Minute. Ionisieren Sie die Peptide über eine Nanospray-Ionenquelle und übertragen Sie sie in ein Orbitrap-basiertes Massenspektrometer. Analysieren Sie Peptide mit einer datenunabhängigen Erfassungsmethode mit engem Bereich.

Eine präzise Isolierung der Region of Interest während der FFPE-Gewebeverarbeitung wurde über verschiedene pankreaszystische Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebe erreicht. Reproduzierbare Gesamtionenchromatogramme wurden zwischen biologischen Trireplikaten für jede Art von zystischer Pankreasneoplasie erstellt. Die massenspektrometrische Analyse der Flüssigchromatographie identifizierte 9.703 Proteine.

Die Häufigkeiten aller identifizierten Proteine erstreckten sich über 6,25 Größenordnungen, was eine umfassende Proteomabdeckung zeigt, und bekannte Proteinmarker für Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden quantifiziert. Insgesamt wurden 933 differentiell exprimierte Proteine identifiziert, wobei 457 hochreguliert und 476 in intraduktalen papillären muzinösen Neoplasien herunterreguliert waren. Die bioinformatische Analyse zeigte, dass differentiell exprimierte Proteine mit mehreren Signalwegen im Zusammenhang mit Bauchspeicheldrüsenkrebs assoziiert sind.