Probenahme und Verarbeitung von Nasenbürsten mittels digitaler Hochgeschwindigkeits-Ziliar-Videomikroskopie – Anpassung an die COVID-19-Pandemie

Das Fehlen veröffentlichter formaler Arbeitsanweisungen und der Standardisierung verhindert, dass die digitale Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie als bestätigender diagnostischer Test für primäre ziliäre Dyskinesie in Betracht gezogen wird. Um während dieser COVID-19-Krise weiterhin einen diagnostischen Dienst anbieten zu können, wurde das ziliare Videomikroskopie-Protokoll so angepasst, dass es angemessene Maßnahmen zur Infektionskontrolle umfasst. Die ziliäre Funktionsbeurteilung mittels digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie ist hochsensitiv und spezifisch für die Diagnose der primären ziliären Dyskinesie.

Im Vergleich zu anderen primären diagnostischen Tests der ziliären Dyskinesie ist die digitale Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie relativ einfach durchzuführen, kostengünstig und die Ergebnisse können innerhalb eines Tages verfügbar sein. Die digitale Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie hat eine höhere Sensitivität und Spezifität für die Diagnose der primären ziliären Dyskinesie. Derzeit sind nur Elektronenmikroskopie und genetische Tests als Bestätigungstests für primäre ziliäre Dyskinesie anerkannt, aber diese Tests werden bei 15 bis 30 % der Patienten die Diagnose der primären ziliären Dyskinesie verfehlen.

Lionel Benchimol, ein HNO-Assistenzarzt aus meinem Labor, wird das Nasenputzverfahren demonstrieren. Lassen Sie den Patienten vor der Entnahme der Nasenprobe die Nase putzen. Lassen Sie den Patienten nach der Reinigung der Nasengänge bequem liegen oder sitzen, wobei der Kopf nach hinten ruht.

Schütteln Sie die Bürste in dem zugesetzten Medium 199, um sie zu befeuchten, und platzieren Sie ein Endoskop am Naseneingang, um die untere Nasenmuschel sichtbar zu machen. Führen Sie die Zytologiebürste in die Nase ein und bewegen Sie die Bürste mehrmals nach hinten und anterior über den hinteren Teil der unteren Nasenmuschel, bevor Sie sie zurückziehen. Legen Sie den Pinsel in eine Tube M199.

Schneiden Sie den Draht so ab, dass er vollständig in den Schlauch passt, und schließen Sie den Schlauch sofort. Legen Sie die Probe dann in einen luftdichten Doppelbeutel. Öffnen Sie innerhalb von neun Stunden nach der Probenentnahme die Probenröhrchen in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank und bewegen Sie die Bürste mit einer Weil-Blakesley-Nasenzange, um die gesammelten Epithelstreifen zu entfernen.

Kleben Sie einen doppelseitigen Abstandhalter auf einen Objektträger und entfernen Sie den Schutz vom Abstandhalter. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, damit sich die Zilien im gesamten Röhrchen ausbreiten können, und übertragen Sie mit einer Pipette etwa 60 Mikroliter Flimmerepithel aus der Mitte des Röhrchens in den Abstandshalter. Legen Sie einen 22 x 4 Millimeter großen rechteckigen Abdeckschirm auf den Abstandshalter, um die Kammer zu schließen, und desinfizieren Sie den Objektträger mit 70 % Ethanol, bevor Sie ihn aus der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank nehmen.

Legen Sie diese Folie nach dem Handschuhwechsel auf die Platte einer beheizten Box und schließen Sie den Deckel. Geben Sie Öl in das Öl-Immersionsobjektiv und stellen Sie die Box auf den Tisch eines aufrechten oder eines inversen Lichtmikroskops. Schalten Sie die Box und die Linsenheizung ein und passen Sie die Temperatureinstellungen an den Reglern der Box und der Linsenheizung an.

Positionieren Sie das Objektiv nach fünf Minuten, bis es mit der Spitze des Objektivs gerade noch den Deckglas berührt. Um die flimmerförmigen Ränder der Atmung der Probe zu visualisieren, öffnen Sie die Kamerasoftware und verwenden Sie dann das Mikroskopobjektiv, um die Zellen in der Probe manuell zu lokalisieren und auf den Monitor zu projizieren. Vergewissern Sie sich, dass das Bild auf dem Monitor sichtbar ist, und passen Sie den Kondensor und den Objektivfokus nach Bedarf an, um die Bildqualität zu verbessern.

Wenn die Streifen des Flimmerepithels lokalisiert wurden, wählen Sie nur intakte, ungestörte Flimmerepithelkanten aus, die mindestens 50 Mikrometer lang sind. Achten Sie darauf, für die ziliäre Funktionsanalyse nur normale Kanten oder Kanten mit kleinen Vorsprüngen zu verwenden und Flimmerkanten mit großen Vorsprüngen und isolierte Flimmerzellen oder einzelne Zellen ohne Kontakt zwischen ihnen und einem anderen Zelltyp auszuschließen. Wenn eine gute Kante ausgewählt wurde, verwenden Sie eine Kamerabildrate von 500 Bildern pro Sekunde, um die schlagende Zilienkante etwa zwei Sekunden lang aufzuzeichnen.

Nachdem Sie mindestens sechs gute Kanten in der Seitenansicht aufgenommen haben, nehmen Sie den Objektträger aus der beheizten Box und legen Sie den Objektträger, den Deckglas und den Abstandshalter in einen luftdichten Beutel. Legen Sie dann die Handschuhe und die Maske in den Beutel und legen Sie den Beutel in den entsprechenden Behälter für gefährliche medizinische Abfälle. Um die Ziliarschlagfrequenz zu analysieren, öffnen Sie die Aufzeichnung in einem geeigneten Videoanalyse-Softwareprogramm und unterteilen Sie die Flimmerkanten in etwa fünf benachbarte Bereiche von etwa 10 Mikrometern.

Identifizieren und visualisieren Sie die Zilien oder Gruppen von Zilien mit einer reduzierten Bildrate und maximal zwei Ziliarschlagfrequenzmessungen pro Bereich, um maximal 10 Ziliarschlagfrequenzmessungen pro Kante zu erhalten. Notieren Sie die Anzahl der Bilder, die eine Gruppe von Zilien benötigt, um fünf Schwebungszyklen abzuschließen, und verwenden Sie die Formel, um die Ziliarschlagfrequenz zu berechnen. Um den prozentualen Anteil jedes einzelnen Ziliarschlagmusters innerhalb einer Probe für jede Zilien oder Gruppe von Zilien zu bestimmen, vergleichen Sie den genauen Weg, den die Zilien während eines vollen Schlagzyklus zurückgelegt haben, mit dem normalen Ziliarschlagmuster, das bei der digitalen Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse beobachtet wurde.

Ordnen Sie jedem analysierten Zilien oder jeder Gruppe von Zilien ein bestimmtes Ziliarschlagmuster zu, z. B. normal, steif, unbeweglich, asynchron oder dyskinetisch und kreisförmig. Berechnen Sie dann den prozentualen Anteil jedes einzelnen Ziliarschlagmusters innerhalb jeder Stichprobe. Das der Stichprobe zugeschriebene Ziliarschlagmuster ist das vorherrschende Ziliarschlagmuster, das beobachtet wurde.

Hier sehen wir detaillierte Ergebnisse der ziliären Funktionsanalyse aus den Nasenputzproben von 14 erwachsenen Freiwilligen. Von diesen 14 Nasenputzproben wurden 242 Flimmerkanten erfasst, von denen 212 die definierten Einschlusskriterien für die Analyse erfüllten. Insgesamt wurden 807 Messungen der Ziliarschlagfrequenz und Auswertungen des Ziliarschlagmusters aus den analysierten Zilien oder Gruppen von Zilien gewonnen.

Der mittlere Imkotilitätsindex war ähnlich wie die zuvor berichteten Werte, die bei gesunden Probanden beobachtet wurden. Der Dyskinesie-Score und die Ziliarschlagfrequenz waren ähnlich wie die zuvor berichteten Werte, die erhalten wurden, wenn nur normale Kanten oder Kanten mit geringer Projektion ausgewählt wurden. Wenn minderwertige Kanten verwendet werden, werden niedrigere Ziliarschlagfrequenzen und höhere Dyskinesie-Werte berichtet.

Blutzellen und Schleim, die durch ein zu starkes Bürsten gewonnen werden, können das Schlagen der freien Zilien blockieren oder die Zilien vor dem Betrachter verbergen. Drückt der Pinsel hingegen nicht fest gegen die untere Nasenmuschel, kann es sein, dass die Probe nicht genügend hochwertige Flimmerepithelstreifen enthält. Wenn das Nasenbürsten am vorderen Teil der Nasenhöhle durchgeführt wird, werden nur vorübergehende nicht-flimmernde Epithelzellen gewonnen.

Die beiden wichtigsten Aspekte des Protokolls sind die Qualität des Nasenbürstens und die Auswahl hochwertiger Epithelfragmente, um ein vollständig positives Ergebnis oder ein Versagen der Technik zu vermeiden.