Aufnahme von nasalen und bronchialen Flüssigkeiten: Precision Sampling der menschlichen Atemwege Schleimhaut und Labor Verarbeitung von Proben

Heute werden wir die Technik der Nasosorption demonstrieren, eine Form der Präzisions-Schleimhautprobenahme, bei der eine synthetische absorbierende Matrix zur Aufnahme von Schleimhautflüssigkeit verwendet wird. Der Nasosorptionsprobennehmer besteht aus einem Griff und SAM in einem sterilen Kryoröhrchen. Die SAM bestehen aus Polymeren, entweder Fasern oder Schaumstoff, und wurden speziell ausgewählt, um weich und saugfähig zu sein, mit schnellem Feuchtigkeitstransport für die Probenentnahme.

SAMs haben auch eine minimale Proteinbindung, um eine effiziente Elution der absorbierten Sekrete zu ermöglichen. Die Nasosorption ist eine sehr schonende, nicht-invasive Technik, die bei Patienten jeden Alters, einschließlich Babys, durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ist eine serielle Bemusterung, auch alle paar Minuten, möglich.

Bei der Durchführung der Nasosorption sollten Sie sich zuerst die Hände waschen und Handschuhe anziehen, vorzugsweise vor dem Patienten. Zuerst wird die Nasenhöhle inspiziert. Wir empfehlen die Verwendung einer Stirnlampe und den Arzt, die Nase des Patienten mit dem nicht dominanten Daumen zurückzuziehen, um die Nasenhöhle sichtbar zu machen.

Ein Nasenspekulum ist in der Regel nicht erforderlich. Wenn man in die Nasenhöhle schaut, sind die Nasenlöcher oder Nasenlöcher im Querschnitt nicht rund und gehen gerade nach hinten. Im Allgemeinen sehen Sie die untere Nasenmuschel als eine Ausbuchtung, eine Vertiefung an der Seitenwand des Nasenlochs, wobei die Nasenscheidewand die glatte, flache mediale Wand bildet.

Wir wollen Proben von dieser unteren Nasenmuschel nehmen, da das darunterliegende Epithel ein einfaches Flimmerepithel der Atemwege ist. Bei der Probenahme wird das Nasosorptions-SAM sanft über das Lumen nach oben geführt, wobei es flach gegen die untere Nasenmuschel ausgerichtet wird. Drücken Sie dann mit dem Zeigefinger das SAM auf die Nasenschleimhaut.

Dies kann zu einem leichten Kitzeln mit möglichem Tränen in den Augen führen, da das MLF absorbiert wird. Wir verwenden in der Regel eine zeitgesteuerte Absorption von 60 Sekunden. Das Nasosorptionsgerät wird dann aus dem Nasenloch entfernt, wieder in das Kryoröhrchen eingesetzt und kann sofort auf Eis gelagert und anschließend tiefgefroren werden.

Alternativ können Sie sofort mit der Eluierung des MLF fortfahren. Die Nasosorption wird in einer Vielzahl von Modellen zur Herausforderung der Nasenschleimhaut und auch bei verschiedenen Atemwegserkrankungen untersucht. Diese relativ neue Methode erfordert jedoch noch eine formale Validierung im Vergleich zu anderen Methoden der Probenahme von Atemwegen.

Bei der Technik der Bronchosorption wird eine synthetische Absorptionsmatrix verwendet, um die Schleimhautschleimhautflüssigkeit des Bronchus zu beproben. Die Methode wird von Fachpersonal über ein faseroptisches Bronchoskop durchgeführt. Die Bronchosorptionsvorrichtung besteht aus einem externen Hohlkatheter mit einem zentralen Führungsdraht aus Kunststoff.

Diese hat am Ende ein SAM, das bei Aktivierung des Handstücks extrudiert werden kann. Wie die Nasosorption ist der SAM-Streifen weich und saugfähig und lässt sich schnell für die Probenentnahme ableiten. Es hat auch eine minimale Proteinbindung, um eine effiziente Elution der absorbierten Sekrete zu ermöglichen.

Bevor das Bronchosorptionsgerät in das Bronchoskop eingesetzt wird, ist es üblich zu überprüfen, ob das SAM leicht extrudiert und wieder in den Katheter zurückgezogen wird. Im Folgenden wird die Methode der Bronchosorption anhand eines Bronchoskopie-Simulators demonstriert. Zuerst wird eine Standard-Bronchoskopie durchgeführt, bei der das Bronchoskop durch die Luftröhre in den rechten Hauptbronchus und auf die Höhe des Bronchus intermedius genau in der Nähe der Teilung des rechten unteren und rechten Mittellappens eingeführt wird.

Nach dem Einfügen in diese Ebene werden fünf Schritte befolgt. Erstens, Katheter runter. Führen Sie den Bronchosorptionskatheter durch den Operationskanal des Bronchoskops ein, bis die weiße Spitze in den Atemwegen bis zu einem Abstand von maximal einem Zentimeter zum Ende des Bronchoskops sichtbar ist.

Halten Sie das Bronchoskop und die Katheterspitze in der Mitte des Lumens der Atemwege. Achten Sie darauf, den Kontakt zwischen der Katheterspitze und der Bronchialschleimhaut zu minimieren, um das Risiko einer Schleimhautschädigung zu verringern. Zwei, SAM raus.

Drücken Sie den Griff der Bronchosorptionsvorrichtung, so dass der SAM-Streifen in das Lumen des rechten mittleren oder rechten Unterlappens extrudiert wird. Biegen Sie unter direkter Sicht die Spitze des Bronchoskops, um sicherzustellen, dass das SAM mit der Schleimhautflüssigkeit an der Atemwegswand in Kontakt kommt. Lassen Sie den SAM-Streifen in den Atemwegen, flach zur Schleimhautwand für zeitlich begrenzte 30 Sekunden.

Drei, SAM rein. Ziehen Sie das SAM direkt wieder in den Katheter zurück. Vergewissern Sie sich beim Einfahren, dass die feuchte SAM-Sonde gerade ist.

Bei Bedarf können der Katheter und die Bronchoskopspitze zurückgeholt werden, um den SAM zu begradigen. Wenn es Schwierigkeiten beim Einziehen des SAM gibt, ziehen Sie das gesamte Gerät mit dem extrudierten SAM wieder aus den Atemwegen heraus. Vier, Katheter hoch.

Ziehen Sie den gesamten Katheter aus dem Operationskanal des Bronchoskops heraus. Fünftens, schneide SAM ab. Das SAM wird mit einer sterilen Schere abgeschnitten, in ein Kryoröhrchen gesteckt und sollte sofort auf Eis gelegt werden, bevor es tiefgefroren oder direkt eluiert wird.

Der folgende Videoclip zeigt die Extrusion eines SAM in die Atemwege eines Patienten, der sich einer Forschungsbronchoskopie unterzieht. Bronchosorption wird derzeit bei einer Vielzahl unterschiedlicher Lungenerkrankungen untersucht. Wir hoffen, dass sich diese Methode der präzisen Schleimhautprobenahme bei der diagnostischen Abklärung sowie bei der Stratifizierung und Überwachung von Patienten als nützlich erweisen wird.

Laborverarbeitung Nach Nasosorption und Bronchosorption. Die Elution von Schleimhautschleimhautflüssigkeit aus der synthetischen absorbierenden Matrix. Heute werden wir die allgemeinen Prinzipien der Verarbeitung von Laborproben nach den nicht-invasiven Schleimhautprobenahmetechniken der Nasosorption und Bronchosorption demonstrieren.

Insbesondere werden wir zeigen, wie wir die Probe der Schleimhautschleimhautflüssigkeit aus der synthetischen Absorptionsmatrix eluieren. Am Ort der Entnahme sollten die Proben für den Transport zum Labor auf Eis gelegt werden. Die Proben können entweder sofort verarbeitet oder direkt in ihrem Original-Probenröhrchen eingefroren werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu elutionieren.

Wenn eine sofortige Verarbeitung durchgeführt wird, kann die Probe auf Eis in ihrem Original-Probenröhrchen in das Labor überführt werden. Oder das SAM kann abgenommen und an der Entnahmestelle in einen Elutionspuffer gelegt und anschließend auf Eis ins Labor gebracht werden. Die Proben können vor der Verarbeitung mehrere Stunden lang entweder im Puffer oder in ihrem Probenröhrchen auf Eis verbleiben.

Ein Waschschritt vor der Zentrifugation und Spin-Elution des SAM zielt darauf ab, die Probenausbeute zu optimieren. Um dies zu erreichen, wird der SAM zusammen mit dem gewünschten Extraktionsbugger in ein Eppendorf-Rohr eingeführt. Die Probe wird dann 30 Sekunden lang auf einem Vortex-Mischer gemischt, um das SAM von lose anhaftenden Flüssigkeiten und Biomolekülen zu reinigen.

Um eine vollständige Probenrückgewinnung zu gewährleisten, wird dann eine Spin-Elution durchgeführt, indem das feuchte SAM zu einem Spin-Einsatz in demselben Eppendorf-Röhrchen hinzugefügt wird, das auch zum Waschen verwendet wird. Für dieses Verfahren sollte eine saubere Pinzette verwendet werden, die zwischen den Proben gewechselt werden sollte, um eine Kontamination zu vermeiden. Bei dieser Methode wird die Flüssigkeit durch Zentrifugation aus dem SAM extrahiert.

Wir zentrifugieren Proben für 20 Minuten bei 16.000 g in einer auf vier Grad Celsius gekühlten Zentrifuge. Welcher Elutionsbugger verwendet wird, hängt von der gewünschten Anwendung ab. Wir verwenden üblicherweise proteinhaltige Aminoassay-Puffer oder RNA-Lysepuffer

Es können zwei Arten von Schleuderfiltern verwendet werden. Die erste besteht nur aus einem Kunststoffnetz, das das SAM an Ort und Stelle hält und eine vollständige Elution von Flüssigkeiten ermöglicht. Alternativ können bei der Arbeit mit infektiösen Materialien Spin-Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometern verwendet werden.

Diese Filter dekontaminieren infizierte Proben und eignen sich für Proben mit Verdacht auf eine mikrobakterielle Infektion. Wenn solche Filter erforderlich sind, ist es wichtig, einen Vorinkubationsschritt einzubauen, in dem proteinhaltiger Puffer vor der Zugabe der Probe durch den Filter eingezogen wird. Dieser Schritt minimiert die Bindung von Mediatoren an den Filter durch unspezifische Proteinabsorption.

Im Folgenden finden Sie ein Beispielverfahren, das von unserem Labor für die Nasosorptions- und Bronchosorptionsaufbereitung von Proben verwendet wird, die keinen Dekontaminationsschritt erfordern, einschließlich Krankheitserregern der Klasse zwei. Im ersten Schritt wird der SAM für 30 Sekunden in einen Eppendorf gelegt, der den entsprechenden Puffer und Vortex enthält. Für die Nasosorption verwenden wir typischerweise 300 Mikroliter Puffer und für die Bronchosorption 100 Mikroliter.

Im zweiten Schritt wird der SAM mit einer Pinzette entfernt und zusammen mit dem Puffer, der zum Waschen des SAM verwendet wird, in einen Kunststoffnetzfilterbecher gelegt. Im dritten Schritt wird der Kunststoffsiebfilterbecher mit dem SAM wieder in den originalen Eppendorf eingesetzt. Im vierten Schritt wird der Eppendorf mit Filterbecher, Puffer und SAM 20 Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wird der Filterbecher mit dem SAM entfernt und entsorgt. Die Elue kann dann aliquotiert und tiefgefroren werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt analysieren zu können. Die Nasosorptionsprobenahme wurde in einer Reihe von klinischen Forschungseinrichtungen für Atemwege eingesetzt.

Dazu gehören Messungen von Entzündungsmediatoren während der nasalen Allergenprovokation wie Prostaglandin D2 und Interleukin 5. In diesen Challenge-Modell-Settings ist es wichtig, dass die Probenahme durch Nasosorption eine häufige kinetische Profilierung der Mediatorspiegel ermöglicht, bei der die Probenahme alle paar Minuten wiederholt werden kann. Die Nasosorption wurde auch während einer Rhinovirus-Infektionsprovokation bei gesunden Probanden und allergischen Asthmatikern angewendet, bei denen die Nasosorption während des Studienzeitraums täglich wiederholt wurde.

Die Verwendung von Nasosorption in der Studie ermöglichte eine empfindliche Charakterisierung der Interferonantworten auf eine Rhinovirusinfektion. Schließlich haben wir Nasosorptionsproben verwendet, um Säuglinge mit Bronchiolitis zu untersuchen. In dieser Studie war eine Infektion mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus mit höheren Konzentrationen von Entzündungsmediatoren wie Interferon-Gamma verbunden.

Wichtig ist, dass die Probenahme mit Nasosorption die Einbeziehung einer gesunden Kontrollgruppe in Studien an Säuglingen ermöglicht. Bronchosorption wurde auch in der Rhinovirus-Provokationsstudie bei gesunden Probanden und allergischen Asthmatikern eingesetzt. Diese Studie zeigte einen signifikanten Anstieg der Entzündungsmediatoren Interferon gamma, ITAC, IL-10 und IL-5 in den unteren Atemwegen während einer Rhinovirus-Infektion.

Die Einbeziehung dieser Technik in Untersuchungen der unteren Atemwege schafft die Möglichkeit, Mediatorkonzentrationen zu messen, die mit herkömmlichen Methoden wie der bronchoalveolären Lavage möglicherweise nicht nachweisbar wären. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Schleimhautschleimhautflüssigkeit nichtinvasiv gewonnen werden kann und ein spannendes Potenzial zur Messung von Entzündungsreaktionen bei Infektionen und Entzündungen hat. Die Elutionsmethoden müssen entsprechend der Art der Proben und den zu messenden Parametern angepasst werden.

Insbesondere kann MLF zur Messung von Schleimhautzytokinen und -chemokinen, Virusinfektionen, Viruslast, Bakterien- und Pilzinfektionen sowie des Mikrobioms und von Schleimhautantikörpern verwendet werden. Schließlich erfordern Schleimhautprobenahme- und Elutionsmethoden eine maßgeschneiderte Entwicklung und sorgfältige Validierung für einzelne Projekte.