Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Die MALDI Imaging Massenspektrometrie ist ein einzigartiger Fortschritt auf dem Gebiet der Metabolomik, der es uns ermöglicht, die relative Häufigkeit und Verteilung von Metaboliten zu messen und zu visualisieren, die auf Organismen, physiologische und pathologische Zustände hinweisen. Der Hauptvorteil von MALDI Imaging ist seine Fähigkeit, Metaboliten in C2 nachzuweisen, ohne dass eine Markierung erforderlich ist. Um das Verfahren zu demonstrieren, haben wir Sie Sami Sauma, einen Doktoranden aus dem Labor von Dr. Patricia Casita.

Yuki Chen und Kelly Veerasammy, studentische Forscher aus meinem Labor. Legen Sie das Gewebe sofort nach der Entnahme in ein flüssiges Stickstoff-, gekühltes Aluminiumfolienschiffchen und eine Styroporbox. Schließen Sie den Deckel der Styroporbox ein, um das Taschentuch je nach Größe des Gewebes 2 bis 10 Minuten lang einzufrieren.

Wenn das Gewebe ausreichend gefroren ist, verwenden Sie eine Pinzette, um das Schiffchen zu entfernen und das in der Folie auf Trockeneis gesicherte Gewebe zum Kryostaten zu transportieren. Achten Sie vor dem Schneiden des Gewebes darauf, nicht auf den Objektträgern zu atmen. Verwenden Sie Handschuhe und ein auf Widerstand eingestelltes Voltmeter, um die Leitfähigkeit der entsprechenden Anzahl von MALDI-kompatiblen Indiumzinnoxid-beschichteten Objektträgern für die Analyse zu testen.

Legen Sie die Objektträger nach dem Etikettieren auf ein sauberes Papiertuch und einen mit 70 % Ethanol gereinigten Kryostaten, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist. Legen Sie die Gewebeprobe in den Kryostaten und stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer und des Probenkopfes entsprechend der Art des Gewebes ein. Nachdem Sie das Gewebe 30 Minuten lang ausbalancieren gelassen haben, verwenden Sie eine Kryo-Gewebeeinbettungsmasse, um das Gewebe am Spannfutter zu befestigen.

Platzieren und fixieren Sie eine saubere Klinge in den Tisch, passen Sie die Position des Tisches und den Winkel der Probe an, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen. Und schneiden Sie das Gewebe, bis die interessierende Region sichtbar wird. Wenn der gewünschte Bereich erreicht ist, erhalten Sie 10 bis 12 Mikrometer dicke Abschnitte, indem Sie eine vorgekühlte Bürste verwenden, um jeden Abschnitt vorsichtig, aber schnell auf der beschrifteten Seite jedes Objektträgers zu sammeln, während er aufgenommen wird.

Legen Sie einen Finger unter die Schienen, um die Abschnitte zu erwärmen und eine sichere Befestigung auf der Schiene zu gewährleisten. Die Abschnitte werden in 5 bis 10 Sekunden transparent und nach etwa 30 bis 60 Sekunden undurchsichtig. Wenn alle Abschnitte eingesammelt sind, legen Sie die Dias in den Diahalter und tragen Sie das Trockeneis zu einem Entweiher.

Alternativ können Dias in einer Vakuumbox transportiert werden. Legen Sie die Objektträger in einen Entschärfer mit Trockenmittel und trocknen Sie die Objektträger 45 bis 60 Minuten lang vakuum. Nach dem Trocknen legen Sie die Objektträger, wenn Sie sie nicht sofort verwenden, in den Objektträgertransporter und füllen Sie den Transporter mit Stickstoff.

Verschließen Sie den Halter mit Parafilm und legen Sie den Halter in einen Reißverschlussbeutel. Dann wurde der erste Zip-Beutel in einen zweiten beschrifteten Zip-Beutel gelegt, der Trockenmittel für eine Lagerung von minus 80 Grad Celsius für bis zu sechs Monate enthielt. Verwenden Sie nach der Dehydrierung einen silbernen Marker mit fetter Spitze, um X-Markierungen auf den Leerräumen der Objektträger außerhalb der Gewebeschnitte zu platzieren, und verwenden Sie einen schwarzen Feinmarker, um ein zweites schwarzes X auf jedem silbernen X zu platzieren.Legen Sie einen Objektträger in das Metalltarget des MALDI-Objektträgers und legen Sie eine Plastikabdeckung über den Objektträger.

Umreißen Sie die Probenposition auf der Kunststoffabdeckung und platzieren Sie den Objektträger und das MALDI-Ziel auf der Oberfläche eines Flachbettscanners. Zeigen Sie dann eine Vorschau der Folie an und wählen Sie den gewünschten Bereich aus. Scannen Sie das Dia in 16-Bit-Graustufen, in 2.400 Punkten pro Zoll und speichern Sie das Bild für die spätere Verwendung.

Um die Matrix auf die Objektträger aufzubringen, schalten Sie eine automatische Matrixsprüheinheit ein, stellen Sie sicher, dass das Ventil bei Last positioniert ist, und starten Sie die Sprühsoftware. Überprüfen Sie, ob der Abluftventilator ordnungsgemäß funktioniert, und bestätigen Sie auf der Registerkarte Kommunikation, dass das System korrekt kommuniziert. Starten Sie die Lösungsmittelpumpe bei 100 Mikrolitern pro Minute mit einem Gegendruck von etwa 500 Pfund pro Quadratzoll.

Und stellen Sie den Stickstofftank auf 30 Pfund pro Quadratzoll ein, um den Druckluftstrom zum Matrixsprühgerät zu starten. Stellen Sie den Druckregler an der Vorderseite des Sprühgeräts auf 10 Pfund pro Quadratzoll ein und stellen Sie die Temperatur der Sprühdüse wie gewünscht ein. Verwenden Sie mit dem Ventil und der Lastposition die Spritze, um den Kreislauf mit sieben Millilitern 70 % Methanol zu spülen, bevor Sie den Kreislauf mit sechs Millilitern pro Matrix füllen.

Setzen Sie einen leeren Objektträger in den Halter und den Sprüher ein und kleben Sie beide Enden fest, um ein Verrutschen zu verhindern und zu überprüfen, ob die Durchflussmenge und die Temperatur stabil sind. Drücken Sie Start, um die Düsentemperatur einzustellen und die Pumpendurchflussmenge an die ausgewählte Methode anzupassen. Schalten Sie das Ventil von Last auf Spray um und klicken Sie auf Weiter.

Das System konnte bis zum Ende ausgeführt werden. Wenn die Abscheidung abgeschlossen ist, schalten Sie das Ventil von Spray auf Load um und klicken Sie auf Weiter. Untersuchen Sie das Muster der Matrixcodierung unter einem Mikroskop.

Wenn eine gleichmäßige Schicht aus feinem Matrixkristall beobachtet wird, wird die Matrix wie gerade gezeigt auf die entsprechenden Objektträger aufgebracht. Wenn alle Objektträger behandelt wurden, reinigen Sie das System gemäß den Anweisungen des Herstellers, um ein Verstopfen der Sprühdüse zu vermeiden. Hier werden Ausgabebilder von MALDI MS Imaging Data Analysis von Massenentladungsspektren gezeigt, die aus jedem 100-Dalton-Intervall ausgewählt wurden und den Nutzen für die Identifizierung von Spektren von niedermolekularen Metaboliten bis hin zu Lipiden mit hohem Molekulargewicht deutlich darstellen.

Jede Straße zeigt entsprechende Ionen-Heatmaps, die sowohl räumliche als auch spektrale Informationen einer bestimmten Metabolitenspezies in drei Geweben enthalten, die an den postnatalen Tagen 1, 21 und 60 gesammelt wurden. Eine Stärke der MALDI-MSI-Methodik ist die Fähigkeit, die Spezifität bestimmter Spezies anhand des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses zu Entwicklungsmeilensteinen oder spezifischen anatomischen Strukturen zu erkennen. In dieser Analyse wurde beobachtet, dass einige Metaboliten bei postnatalen Neugeborenen am ersten Tag oder bei Erwachsenen am 60. Tag nach der Geburt angereichert oder gleichmäßig über das getestete Alter verteilt waren.

Es wurde beobachtet, dass andere molekulare Spezies spezifisch mit grauer Substanz, weißer Substanz oder zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und Ventrikeln angereichert sind. Die räumliche Verteilung repräsentativer Metaboliten, darunter Hypoxanthin, Glutaminsäure, N-Acetylasparaginsäure, Arachidonsäure und verschiedene Lipide, wurde ebenfalls analysiert. Um die Genauigkeit des Stoffwechselzustands zu erhalten, sind eine geeignete Probendissektion, Lagerung und Cyrosektion entscheidend, um künstliche Stoffwechselveränderungen zu verhindern.

Nachdem Sie Ihr MALDI-Experiment durchgeführt haben, möchten Sie möglicherweise die Identität der gefundenen Metaboliten überprüfen. Dies kann durch Mikroextraktion und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-MS erreicht werden. MALDI MS Imaging ermöglicht metabolomics-basierte Untersuchungen mit räumlicher Auflösung und bietet Forschern die Möglichkeit, metabolische Daten in einem quantitativen und visuellen Medium zu ermitteln. In letzter Zeit gibt es ein großes Interesse an der Wirkung der Ernährung bei neurodegenerativen Erkrankungen, der Beziehung zwischen dem Darmmikrobiom und dem Gehirn.

Und so hat die Erforschung des Stoffwechsels in den Neurowissenschaften, von der Neuroentwicklung bis zur Neurodegeneration, eine enorme Bedeutung erlangt. Die Haupttatsache der Darm-Hirn-Interaktion. Und genau in diesem Zusammenhang kann die Idee der MALDI Imaging Facility wirklich hervorragende Technologien liefern, um die Auswirkungen einer bestimmten Manipulation auf das Gehirn sichtbar zu machen.