Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf 15 N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zusammensetzung von MultiPro-Komplexen in Thal-Strang-Membranen unter verschiedenen Bedingungen vergleichend zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Thalmembranen aus Lamonazellen isoliert werden, die anaeroben Bedingungen ausgesetzt sind. Als nächstes werden die Membranen des th-Strangs solubilisiert und auf einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert.

Dann werden gleiche Volumina der gewünschten Fraktionen gemischt und auf der SDB-Seite getrennt. Schließlich werden die mit Kumasi gefärbten Banden mit Trypsin verdaut. Abschließend werden die Proben mittels quantitativer Massenspektrometrie analysiert, um Veränderungen in der Proteinhäufigkeit zwischen den untersuchten Fraktionen zu beobachten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie quantitativen Proteomstudien, bei denen eine definierte Proteinmenge verglichen wird, besteht darin, dass bei unserem Ansatz gleiche Volumina fraktionierter Proben kombiniert und analysiert werden. Dies ermöglicht es, das Migrationsverhalten von Proteinen innerhalb des Gradienten zu untersuchen und darüber hinaus die Zusammensetzung verschiedener Nicht-Protein-Komplexe in der Membran der dritten Gruppe zu analysieren. In Bezug auf die verwendeten Stämme Nach der Kultivierung von Chlamydomonas zügelharten Stämmen gemäß dem Textprotokoll sind Stammlösungen von zwei molaren Saccharose, 10%beta TM in Wasser und 0,5 molaren Stämmen pH 8,0 zu verwenden.

Um die folgenden Lösungen für Saccharose-Dichtegradienten herzustellen, beginnen Sie zum Einrichten der Gradienten mit 14 x 89 Millimeter Zentrifugenröhrchen mit dem langsamen Eingießen eines Milliliters 1,3 molare Lösung, gefolgt von einem Milliliter 1,0 molaren Lösung. Gießen Sie dann jeweils zwei Milliliter der 0,85-, 0,7-, 0,65- und schließlich der 0,4-molaren Lösungen ein. Lagern Sie die Gradienten über Nacht im Kühlraum, um anaerobe Bedingungen zu induzieren.

In den Chlamydomonas-Kulturen wird eine Glaspipette in Kulturkolben eingeführt und vier Stunden lang unter ständigem Rühren und Beleuchten mit Argonnen sprudeln, um die Thalcord-Membranen zu isolieren. Beginnen Sie nach der Inkubation damit, die Zellen fünf Minuten lang bei der 2.500-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius zu pelletieren. Dann werden die Zellpellets in 30 Millilitern H und einem Puffer erneut aufgehängt.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und wiederholen Sie erneut. Suspendieren Sie die Zellen in H einen Puffer, um die Zellen zu brechen, und leiten Sie sie durch einen Vernebler mit einem Stickstoffdruck von 1.500 Pascal. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Keramikkugel und dem Metall klein genug ist, damit Zellen brechen können.

Dann drehen Sie die Zellen sieben Minuten lang bei der 2.500-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius herunter. Der Überstand sollte hellgrün sein. War der Zellbruch erfolgreich, werden die Zellen bei der Wiederbelebung in 50 Milliliter H-Zwei-Puffer suspendiert und 10 Minuten lang bei 32, 800-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius pelletiert.

Nachdem Sie die Zellen in 10 Millilitern H-Drei-Puffer suspendiert haben, verwenden Sie einen Töpfer, um den resuspendierten Gaumen zu homogenisieren. Als nächstes, um Thal Cord Saccharose Dichtegradienten vorzubereiten. Beginnen Sie mit 12 Millilitern Zellen in H drei Puffer.

Gießen Sie dann langsam eine Schicht von 12 Millilitern H vier Puffer und schließen Sie mit 12 Millilitern H fünf Puffer ab. Verwenden Sie H fünf, um den Rotor auszuwuchten und die Gradienten eine Stunde lang bei 70, 700-facher Schwerkraft zu zentrifugieren. Entfernen Sie die TH-Banden aus den Farbverläufen und verwenden Sie ein geeignetes Volumen H-Sechs-Puffer, um sie zu verdünnen.

Schleudern Sie Zellen bei 37.900-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Wenn das Pellet nicht dicht ist, geben Sie mehr H sechs Puffer in den Zentrifugationsschritt. Dann Reanimation.

Hängen Sie die Thal-Schnüre in einem kleinen Volumen von H sechs Puffer auf, um einen Saccharose-Dichtegradienten des Photosystems zu laden. Berechnen Sie zunächst die Mengen an Thal-Schnüren, Beta DM und H sechs Puffer, die für jeden Gradienten benötigt werden. Gemäß diesen Richtlinien enthält jeder Gradient 0,8 Milligramm pro Milliliter Chlorophyll in 0,9 %Beta TM und H 6 Buffer erhöht das Endvolumen auf 700 Mikroliter.

Um das Thys zu lösen, bereiten Sie separates Eloqua mit den Thylakoiden beta DM und H sechs Puffer für jeden Gradienten vor. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis und indrehen Sie sie alle paar Minuten, um sie zu mischen. Nach dem Zentrifugieren der Proben bei 14.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten und vier Grad Celsius.

Das Pellet sollte klein und weißlich sein, und der Überstand ist dunkelgrün. Laden Sie den Überstand auf die Gradientenwaage mit H sechs Puffer und ultra zentrifugieren Sie bei 134, 470-facher Schwerkraft für 14 Stunden und vier Grad Celsius. Machen Sie nach dem Schleudern Fotos von den Gradienten und fraktionieren Sie sie.

Stechen Sie mit einer Nadel ein Loch am Boden des Röhrchens und sammeln Sie Fraktionen in 500-Mikroliter-Röhrchen. Oder ein 96-Well-Plattenverfahren. Die Proben für die SDS-Seite in der Gelverdauung und Massenspektrometrie gemäß dem Textprotokoll, wie hier gezeigt, unter Verwendung der Ergebnisse der Immunblutanalyse, der sechsten Fraktion aus dem Wildtyp und der 13. Fraktion aus der Delta-PS-Eins.

In dieser Abbildung wurden die Peakfraktionen von A und R eins für die Analyse der superkomplexen Komponenten des zyklischen Elektronenflusses ausgewählt. Dargestellt sind relative Proteinverhältnisse, dargestellt als Wildtyp über Delta, PS eins, 14 N über 15 N, für mehrere PS eine, Kern- und Lichternteproteine von PS eins, sowie für Proteine, die dem zyklischen Elektronenfluss-Superkomplex zugeordnet sind, die Unterschiede in der Häufigkeit von einem NR eins und CAS in der Fraktion sechs und 13 von Wildtyp und delta PS eins deuten darauf hin, dass es sich um neuartige Bestandteile dieses gezeigten Komplexes handelt hier sind die Ergebnisse für den quantitativen Vergleich dieses zyklischen Elektronenfluss-Superkomplexes zwischen dem Wildtyp und einem PG L Ein-Knockout-Stamm. Interessanterweise scheinen HCF 1 36, Cytochrom B sechs, Cytochrom B sechs, F-Untereinheit vier und PET C im Wildtyp angereichert zu sein, während FTSH zwei, Cytochrom F und PET O in PG L eins angereichert zu sein scheinen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zusammensetzung von MultiPro-Komplexen in flüssigen Membranen unter verschiedenen Bedingungen vergleichen können. Denken Sie daran, dass für die erfolgreiche Vorbereitung der flüssigen Membranen und die Isolierung des zyklischen Elektronenflusses der superkomplexe Zellaufschluss, das Töpfern der Zellen und die Aktivierung der flüssigen Membranen die entscheidenden Schritte sind. Darüber hinaus müssen die Saccharose-Dichtegradienten mindestens 12 Stunden lang zentrifugiert werden, um eine vollständige Trennung der photosynthetischen Komplexe zu erreichen.