Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zusammensetzung von MultiPro-Komplexen in Thalkordmembranen unter verschiedenen Bedingungen vergleichend zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Thal-Membranen aus Lamona-Zellen isoliert werden, die anaeroben Bedingungen ausgesetzt waren. Anschließend werden die Thalkordmembranen solubilisiert und an einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert.

Anschließend werden gleiche Volumina der gewünschten Fraktionen gemischt und per SDS-Page getrennt. Schließlich werden die mit Kumasi gefärbten Banden mit Trypsin verdaut. Abschließend werden die Proben mittels quantitativer Massenspektrometrie analysiert, um Veränderungen in der Proteinmenge zwischen den untersuchten Fraktionen zu beobachten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie quantitativen proteomischen Studien, die eine definierte Menge an Protein vergleichen, liegt darin, dass in unserem Ansatz gleiche Volumina fraktionierter Proben kombiniert und analysiert werden. Dies ermöglicht die Untersuchung des Migrationsverhaltens von Proteinen innerhalb des Gradienten und darüber hinaus die Analyse der Zusammensetzung verschiedener nicht-proteinhaltiger Komplexe in der dritten Gruppenmembran. Bezüglich der verwendeten Stämme: Nach dem Kultivieren von Chlamydomonas reinhardtii-Stämmen gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie Stammlösungen aus zwei molarer Saccharose, 10 % Beta-DM in Wasser sowie 0,5 molarer Tris-HCl-Pufferlösung mit pH 8,0.

Zur Herstellung der folgenden Lösungen für Saccharosedichtegradienten unter Verwendung von Zentrifugenröhrchen mit den Maßen 14 × 89 Millimeter zunächst langsam ein Milliliter der 1,3 molar Lösung einfüllen, gefolgt von einem Milliliter der 1,0 molar Lösung. Anschließend jeweils zwei Milliliter der 0,85-, 0,7-, 0,65- und schließlich der 0,4-molar Lösung hinzufügen. Die Gradienten über Nacht im Kühlraum lagern, um anaerobe Bedingungen zu erzeugen.

In den Chlamydomonas-Kulturen eine Glaspipette in die Kulturgefäße einbringen und vier Stunden lang unter kontinuierlichem Rühren und Beleuchtung mit Argon durchblubbern, um Thylakoidmembranen zu isolieren. Nach der Inkubation die Zellen fünf Minuten bei 2.500 × g und 4 °C pelletieren. Anschließend die Zellpellets in 30 Milliliter H1-Puffer resuspendieren.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen erneut in H1-Puffer, um die Zellen zu lysieren. Führen Sie sie durch einen Nebulizer mit einem Stickstoffdruck von 1.500 Pascal. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Keramikkugel und dem Metall ausreichend gering ist, damit die Zellen zerbrechen.

Anschließend die Zellen sieben Minuten bei 2.500 × g und 4 °C abzentrifugieren. Das Überstandsmittel sollte hellgrün gefärbt sein. Falls die Zellzerstörung erfolgreich war, die Zellen in 50 Milliliter H₂-Puffer resuspendieren und zehn Minuten bei 32.800 × g und 4 °C pelletieren.

Danach suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter H3-Puffer und homogenisieren die resuspendierten Zellen mit einem Potter. Bereiten Sie anschließend Thalkord-Sucrose-Dichtegradienten vor. Beginnen Sie mit 12 Milliliter Zellen in H3-Puffer.

Dann langsam eine Schicht von 12 Milliliter H vier Puffer auftragen und mit 12 Milliliter H fünf Puffer abschließen. Mit H fünf den Rotor ausbalancieren und die Gradienten eine Stunde lang bei 70.700 × g zentrifugieren. Die TH-Banden aus den Gradienten entnehmen und mit einem geeigneten Volumen an H sechs Puffer verdünnen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 37.900 ×g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Falls der Pellet nicht fest ist, geben Sie mehr H6-Puffer zum Zentrifugationsschritt hinzu. Anschließend resuspendieren.

Suspendieren Sie die Thalkordeln in einem kleinen Volumen H-sechs-Puffer, um ein Photosystem auf einer Saccharose-Dichtegradienten aufzutragen. Berechnen Sie zunächst die Mengen an Thalkordeln, Beta-DM und H-sechs-Puffer, die für jeden Gradienten benötigt werden. Gemäß diesen Richtlinien enthält jeder Gradient 0,8 Milligramm pro Milliliter Chlorophyll in 0,9 % Beta-DM, und der H-sechs-Puffer wird das Endvolumen auf 700 Mikroliter anheben.

Um die Thylakoide aufzulösen, bereiten Sie separate Eppendorfgefäße mit Thylakoiden in Beta-DM- und H6-Puffer für jeden Gradienten vor. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten auf Eis und drehen Sie sie alle paar Minuten um, um sie zu mischen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben bei 14.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Das Pellet sollte klein und weißlich sein, und der Überstand wird dunkelgrün sein. Den Überstand auf die Gradienten auftragen, mit Puffer H sechs ausbalancieren und bei 134.470 × g für 14 Stunden bei vier Grad Celsius ultrazentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren Bilder der Gradienten aufnehmen, dann fraktionieren.

Verwenden Sie eine Nadel, um ein Loch an der Unterseite des Röhrchens zu stechen, und sammeln Sie die Fraktionen in 500-Mikroliter-Röhrchen. Alternativ ein 96-Well-Platten-Verfahren. Die Proben für SDS-Page, Gelverdauung und Massenspektrometrie gemäß dem schriftlichen Protokoll, wie hier gezeigt, unter Verwendung der Ergebnisse aus der Immuno-Blutanalyse, Fraktion sechs vom Wildtyp und Fraktion 13 vom Delta-PS1.

Spitzenfraktionen von A und R eins wurden für die Analyse der Komponenten des zyklischen Elektronentransport-Superkomplexes in dieser Abbildung ausgewählt. Relative Proteinverhältnisse, dargestellt als Wildtyp über Delta PS1 14N über 15N, für mehrere PS1-Kern- und Lichtsammelproteine von PS1 sowie für Proteine, die dem zyklischen Elektronentransport-Superkomplex zugeordnet sind, zeigen die Unterschiede in der Häufigkeit von NR1 und CAS in Fraktion sechs und 13 von Wildtyp und Delta PS1, was darauf hindeutet, dass sie neuartige Bestandteile dieses Komplexes sind. Dargestellt sind hier die Ergebnisse des quantitativen Vergleichs dieses zyklischen Elektronentransport-Superkomplexes zwischen dem Wildtyp und einem PG L1-Knockout-Stamm. Interessanterweise scheinen HCF136, Cytochrom B6, Cytochrom-B6F-Untereinheit vier und PETC im Wildtyp angereichert zu sein, während FTSH2, Cytochrom F und PETO im PG L1-Stamm angereichert erscheinen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zusammensetzung von MultiPro-Komplexen in th-Flüssigmembranen unter verschiedenen Bedingungen vergleicht. Beachten Sie, dass die erfolgreiche Herstellung der th-Flüssigmembranen und die Isolierung des zyklischen Elektronentransports, die Zerstörung superkomplexer Zellen, das Pottern der Zellen und die Isolierung der th-Flüssigmembranen kritische Schritte sind. Außerdem müssen die Saccharosedichtegradienten mindestens 12 Stunden zentrifugiert werden, um eine vollständige Trennung der photosynthetischen Komplexe zu erreichen.