Genetische und biochemische Ansätze für In Vivo und In Vitro Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2⁺ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Das übergeordnete Ziel dieser drei komplementären experimentellen Techniken, nämlich Hefe-Zwei-Hybrid, Co-Immunpräzipitation und chemische Vernetzung, besteht darin, Protein-Protein-Wechselwirkungen und insbesondere die Selbstassoziation zu bewerten und die stöchiometrische Zusammensetzung von Protein-Homo-Oligomeren zu bestimmen. Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kardiopathien zu beantworten, wie z. B. die Oligomerisierung des ultratrockenen Rezeptors, zugrunde liegende Herzrhythmusstörungen und den plötzlichen Tod. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind ihr relativ hoher Durchsatz, ihre einfache Handhabung und ihre hochgradig reproduzierbaren Ergebnisse bei minimalem Geräte- und Reagenzienaufwand.

Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Therapie arrhythmogener Herzerkrankungen, da sie dazu beitragen, den molekularen Wirkmechanismus von Antiarrhythmika zu etablieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Co-Immunpräzipitation sind, Schwierigkeiten haben, da sie möglicherweise die Protein-Agarose-Kügelchen, die sehr klein sind, verwerfen, wenn der Überstand während der Zentrifugationsschritte aspiriert wird. In diesem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay werden Hefezellen in der Mid-Log-Phase für die Transformation verwendet.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie jedes Pellet in fünf Millilitern sterilem Wasser und poolen Sie die Zellsuspensionen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Hefepellet in einem Milliliter frisch zubereitetem, sterilem One-x-Lithiumacetat und TE resuspendiert. Die zuständigen Hefezellen müssen innerhalb einer Stunde nach der Zubereitung verwendet werden.

Bereiten Sie Plasmidproben vor, indem Sie Köder- und Zielplasma-DNA mit 100 Mikrogramm Träger-DNA der Heringshoden mischen. Zu jedem 1,5-Milliliter-Röhrchen 100 Mikroliter der zuständigen Hefesuspension und 600 Mikroliter One-X Lithiumacetat und PEG-Lösung geben und etwa 30 Sekunden lang wirbeln. 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.

80 Mikroliter Dimethylsulfoxid zugeben und durch sanfte Inversion gut mischen. Hitzeschock für 15 Minuten in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad und dabei alle zwei bis drei Minuten mischen. Die Zellsuspension zwei Minuten lang auf Eis abkühlen lassen und dann zentrifugieren, um die Hefe zurückzugewinnen.

Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 100 Mikrolitern one-X TE. Plattieren Sie die Zellen auf geeigneten Platten mit minimalem SD-Medium, um den selektiven Druck sowohl auf die Köder- als auch auf die Zielplasmide aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 30 Grad Celsius für vier bis fünf Tage. Die Hefekolonien sind bereit für diesen Assay, wenn sie einen Durchmesser von etwa zwei Millimetern haben.

Pipettieren Sie 2,5 Milliliter frisch zubereiteten Z-Puffer und X-Gal-Lösung auf eine saubere 100-Millimeter-Platte und legen Sie ein Zellulosefilterpapier in die Platte. Legen Sie ein neues Filterpapier auf die Oberfläche der Platte mit den zu untersuchenden Hefekolonien. Reiben Sie das Filterpapier vorsichtig mit einer Pinzette auf die Platte und lassen Sie es etwa fünf Minuten lang einwirken, damit sich die Kolonien festsetzen können.

Heben Sie das Filterpapier vorsichtig an, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung verwenden, und tauchen Sie es 30 Sekunden lang in eine Lache mit flüssigem Stickstoff. Lassen Sie das gefrorene Filterpapier zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen. Legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf das vorgetränkte Filterpapier in die 100-Millimeter-Platte und inkubieren Sie es bei 30 Grad Celsius, bis blaue Kolonien erscheinen.

Einen Tag vor der Transfektion füttern Sie HEK293-Zellen in einer 100-Millimeter-Petrischale, damit die Zellen am nächsten Tag zu 60 bis 70 Prozent konfluiert sind. 16 bis 18 Stunden in einem befeuchteten Inkubator kultivieren. Am Tag der Transfektion werden 24 Mikrogramm Plasma-DNA mit 60 Mikrolitern 2,5 molaren Calciumchlorid und sterilem entionisiertem Wasser verdünnt, um ein Gesamtvolumen von 600 Mikrolitern zu erhalten.

Vortex zum Mischen. Geben Sie die Plasma-DNA plus Calciumlösung tropfenweise in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 600 Mikrolitern 2X HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, während Sie ständig und kräftig durch Vortexen mischen. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung von Calciumphosphat-Plasma-DNA-Komplexen zu ermöglichen.

Nach der 20-minütigen Inkubation kurz vortexen und die Lösung tropfenweise auf die HEK293-Zellen geben, um die gesamte Oberfläche der Petrischale zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid. Wechseln Sie nach etwa sechs Stunden das Wachstumsmedium und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.

Ernten Sie die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion, wie im Protokolltext beschrieben. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern eiskaltem Homogenisierungspuffer und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Glasperlen. Verwenden Sie eine feine Nadel, die an einer Ein-Millimeter-Spritze befestigt ist, um die Zellen auf Eis zu homogenisieren.

Bei geschlossenem Röhrchendeckel stechen Sie mit der Nadel in den Deckel und verteilen Sie die Zellsuspension kräftig durch die Glasperlen. Zentrifugen bei 1500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellkerne und unzerbrochene Zellen zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand, der die postnukleäre Fraktion darstellt, für die Verwendung in Co-Immunpräzipitations- oder Vernetzungsexperimenten auf.

Um dieses Verfahren durchzuführen, solubisiert man die postnukleäre subzelluläre Fraktion mit 0,5 Prozent Chaps und inkubiert mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius unter ständigem Mischen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das unlösliche Material zu pelletieren. Bewahren Sie den Überstand auf.

Dies wird als Zelllysat bezeichnet. Bereiten Sie Protein-A-Agarosekügelchen in Immunpräzipitationspuffer vor, wie im Protokolltext beschrieben. Geben Sie ein Mikrogramm des immunpräzipitierenden Antikörpers in ein Protein-A-haltiges Röhrchen.

Als Negativkontrolle fügen Sie ein Mikrogramm nicht-immunes IGG zu dem anderen Protein-A-haltigen Röhrchen hinzu. Mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren, unter ständigem Mischen. Die Kügelchen durch Zentrifugation zurückgewinnen und den Überstand durch Pipettieren vorsichtig entsorgen.

Übertragen Sie 200 Mikroliter des Zelllysats in jedes der beiden Röhrchen mit Antikörper- und Protein-A-Kügelchen. Mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit ständigem Mischen inkubieren, um eine Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen. Die Kügelchen zurückgewinnen und mit 200 Mikrolitern Immunpräzipitationspuffer waschen.

10 Minuten bei vier Grad Celsius unter Mischen inkubieren. Entsorgen Sie den Überstand nach drei Wäschen vorsichtig durch Pipettieren. Geben Sie 30 Mikroliter Proteinladepuffer zu den Kügelchen und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1500 mal G.

Bewahren Sie den Überstand mit der angespieleten co-IP-Probe für die nachfolgende SDS-Seite und das Immunblotting auf. Um eine chemische Vernetzung durchzuführen, zentrifugieren Sie die postnukleäre subzelluläre Fraktion zu Pelletproteinaggregaten. Den Überstand aufheben und in acht Aliquoten à 20 Mikroliter teilen.

Fügen Sie 0,0025 Volumenprozent Glutaraldehyd zu nur einer Probe hinzu. Starten Sie den Timer und lassen Sie das Glutaraldehyd bei Raumtemperatur für die angegebene Zeit reagieren. Stoppen Sie die Glutaraldehyd-Reaktion zum angegebenen Zeitpunkt mit zwei Volumenprozent Hydrazin und fügen Sie fünf Mikroliter 5X Protein Loading Buffer hinzu, um die Proteine zu denaturieren.

Der Hefe-Zwei-Hybrid wurde verwendet, um überlappende Konstrukte, die sich über die gesamte Länge der Ryanodinrezeptor-Peptidsequenz erstrecken, auf Interaktion mit AD4L und dem Endterminalfragment zu untersuchen. Beta-Gal-Assays mit Colony-Lift-Filterpapier erzeugten nur für das BT4L/AD4L-Paar leuchtend blau gefärbte Kolonien, was zeigt, dass AD4L mit sich selbst interagiert. Für das BT8/AD4L-Paar wurden blassblaue Kolonien nachgewiesen, was auf eine sekundäre, schwächere Assoziation mit der äußersten C-terminalen Domäne hindeutet.

Quantitative Ergebnisse von flüssigen Beta-Gal-Assays zeigten eine robuste BT4L/AD4L-Interaktion, die in ihrer Stärke der bekannten Assoziation zwischen dem P53-Protein pVA3 und dem SV40-Large-T-Antigen pTD1 entspricht. Die BT8/AD4L-Wechselwirkung war deutlich schwächer. Die Ergebnisse des Hefe-Zwei-Hybrid-Virus werden durch Co-Immunpräzipitationsexperimente nach transienter Expression von HA-markiertem AD4L und cMyc-markiertem BT4L in einer Säugetierzelllinie untermauert.

wurde eine direkte Immunpräzipitation von HA-markiertem AD4L durch einen Antikörper 2 HA beobachtet, und cMyc-markiertes BT4L wurde nur in der Anti-HA-Immunpräzipitation wiedergefunden. Die chemische Vernetzung wurde an einem Zellhomogenat, das cMyc BT4L exprimiert, durchgeführt, gefolgt von einer SDS-Seite und Immunblotting unter Verwendung eines Antikörpers gegen cMyc. Zusätzlich zu dem 100-Kilodalton-Monomer wurde eine Proteinbande mit hoher molekularer Masse von etwa 400 Kilodalton zeitabhängig nachgewiesen, was auf die Bildung von Ryanodinrezeptoren und Terminustetrameren hinweist.

Beim Versuch der Transfektion von Säugetierzellen durch Calciumphospatfällung ist es wichtig, daran zu denken, den Phosphatpuffer ständig und kräftig in einem großen Röhrchen zu wirbeln, um eine effiziente Belüftung zu gewährleisten, während die Plasma-DNA-Verbrauchslösung sehr langsam hinzugefügt wird. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden wie konfokal in der Mykroskopie in der Kalziumbildgebung durchgeführt werden. Diese Techniken sollten helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Lokalisierung und die Kalziumfreisetzungseigenschaften von Ryanodinrezeptorkanälen in lebenden Zellen.

Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken den Weg für Forscher in verschiedenen Bereichen der Zellsignalisierung, um die Protein-Homo-Oligomerisierung zu bewerten, einen grundlegenden biologischen Prozess, der die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, Enzymen, Ionenkanälen und Rezeptoren reguliert.