Name: Genetische und biochemische Ansätze für In Vivo und In Vitro Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Erfahren Sie genetische und biochemische Methoden zur Analyse von Protein-Oligomerisierung am Ryanodinrezeptor. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in vivo und in vitro für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Arbeit wurde von British Heart Foundation-Stipendien an SZ (FS / 08/063 und FS / 15/30/31494) unterstützt.

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<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
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Die Autoren haben nichts zu erklären.

Die Bildung von Protein Homooligomere ist ein fundamentaler biologischer Prozess, der die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, Enzyme, Rezeptoren , Ionenkanäle und 25,26 reguliert. Wichtig ist , daß Protein Oligomerisierung auch pathologische Folgen einschließlich Neurodegeneration und arrhythmogenic Herzerkrankung 4,27. Die Methoden in diesem Artikel beschrieben werden verwendet, um Domain-Domain Wechselwirkungen Vermittlung von Protein-Selbstassoziation und Oligomerisierung zu identifizieren. Im Folgenden zeigen wir wichtige Schritte innerhalb jedes Protokoll, und wir diskutieren wichtige Überlegungen, Einschränkungen und Fehlersuche. Das Y2H System kann zuerst verwendet werden, um potentielle Interacting Protein Partner zu screenen wegen seiner relativ hohen Durchsatzscreening, Benutzerfreundlichkeit und sehr gut reproduzierbare Ergebnisse. Y2H Verfahren werden in einem mikrobiologischen Labor mit Standard (Platte oder Shaker) Inkubatoren und Raum ausgestattet nach den Richtlinien durchgeführt. Die Verwendung von freshly hergestellten kompetenten Zellen (Schritt 1.1.8), ist entscheidend für eine hohe Effizienz Hefetransformation, wohingegen für die besten Ergebnisse in β-Gal-Assays frisch Hefekolonien gezüchtet (bis zu 5 Tage alt) sollte (Schritt 1.2.3) verwendet werden. Systeme auf Basis von Transkriptionsfaktoren als GAL4 und / oder zusätzliche / alternative Reportergene vorhanden sind, und daher Bait und Prey-Plasmiden sollte mit dem entsprechenden Y2H Belastung angepasst werden. Einige Stämme sollten in Gegenwart von 3-Amino-1,2,4-triazol, einem kompetitiven Inhibitor des HIS3 - Protein kultiviert werden, um jede konstitutive Expression des HIS3 - Reportergen 7,8 zu quenchen. Die Expression von Köder und Zielfusionsproteine ​​sollten durch Immunoblotting 17 überprüft werden. Im Falle Köder / Beute-Fusionsproteine ​​toxisch sind Hefe, niedrigere tolerierbar Proteinspiegel durch Klonierung in verschiedenen Vektoren erreicht werden könnte, wo Köder / Beute-Expression durch einen anderen Promotor angetrieben wird. Ferner ist es wesentlich, t, um sicherzustellen,Hut Köder / Beute-Fusionsproteine ​​zeigen keine autonome Aktivität des Reportergens. Autonome Reportergenaktivierung kann durch Modifikation des Konstrukts gerettet werden, um die verantwortliche Region zu entfernen, oder durch die GAL4 DNA-BD und AD-Fusionen für die beiden getesteten Proteine ​​tauschen. Darüber hinaus sind Domänen Trans besser aus Köder / Beute-Konstrukte weggelassen, weil sie Fehlfaltungen oder Fehllokalisation von Fusionsproteinen in intrazellulären Membrankompartimente induzieren kann. Tatsächlich ist der größte Nachteil des Y2H System , dass die Köder und Zielproteine ​​in der Hefe Zellkern lokalisiert sind weg von ihren physiologischen subzellulären Ort und möglicherweise spezifische post-translationale Modifikationen fehlen, was zu falsch-positiven oder falsch-negative Wechselwirkungen 6-9 . Mammalian heterologe Expressionssysteme sind besser geeignet für die Untersuchung von Säugetier integrale Membranproteine ​​in Bezug auf die Konformation, post-translationale Modifikationen und subzelluläre Lokalisierung.Eines der am häufigsten verwendeten Zell Transfektionsverfahren ist die Calciumphosphat - Präzipitation, vor allem wegen der Mindestausrüstung und Reagenzien erforderlich 11,15. Alternative Methoden, nämlich die Elektroporation, Liposomen, kationische Lipide und Polymere ergeben können höhere Transfektionseffizienz auf der Zelllinie abhängig und gebrauchte konstruieren. Im Allgemeinen sind die primären Faktoren Transfektionseffizienz beeinflussen Plasmid-DNA Qualität und Zellgesundheit / Lebensfähigkeit. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Plasmid-DNA von höchster Reinheit (260 nm / 280 nm-Absorptionsverhältnis von ~ 1,8) und sich aktiv teilende Zellen verwendet werden. Die Zellen sollten daher nicht mehr als 60 transfiziert werden - 70% Konfluenz (Schritt 2.1.2), da die Fähigkeit zur Oberfläche der Zelle zu dem Medium 11 ausgesetzt zusammenhängt Fremd - DNA aufzunehmen. Zusätzlich Einschluss von Antibiotika in das Kulturmedium während der Transfektion (Schritt 2.1.3) nicht aufgrund der erhöhten Zelltod 15 geraten. Foder Fällung Calciumphosphat insbesondere eine sorgfältige Vorbereitung und pH-Einstellung (auf 7,05 genau) der 2x HBS-Lösung (Schritt 2.1.1) und die korrekte Bildung von Plasmid-DNA / Calcium / Phosphat-Komplexe durch kräftiges Mischen (Schritt 2.1.5) sind wichtige Schritte für eine hohe Effizienz der Transfektion. Typischerweise Proteinexpression durch transiente Transfektion Spitzen innerhalb 24 - 72 Stunden. Sobald die Zellen geerntet werden, müssen nachfolgende Verfahren bei 4 ° C durchgeführt werden, um die Proteaseaktivität zu minimieren, und die Zugabe von Proteaseinhibitoren zu empfehlen ist. Zell Homogenisierung sollte durch einen Zentrifugationsschritt folgen Kerne zu entfernen, weil chromosomale DNA kann die Lösungsviskosität erhöhen und die nicht-spezifische Bindung. Somit Homogenisierung durch mechanische Mittel in einer iso-osmotischen Puffer ist bevorzugt, in der Regel in (0,3 M) Sucrose oder (150 mM) NaCl. Im allgemeinen werden bekannte Saccharose-basierten Puffern Proteinstabilität zu verbessern und potenzielle nicht-native Proteinaggregation vermindern, aber aufgrund preferentiellen Hydratation auf der Proteinoberfläche werden elektrostatische Protein-Protein-Wechselwirkungen begünstigt. Umgekehrt Salzbasis Puffer beeinflussen die Nettoladung der geladenen Aminosäure-Seitengruppen auf der Proteinoberfläche, wodurch eine Vorspannung 28 hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Richtung mehr. Co-IP ist das am häufigsten eingesetzte biochemische Assays Protein-Protein-Wechselwirkungen insbesondere von nativem Gewebe zu beurteilen. Sein Hauptnachteil ist die Voraussetzung für hochspezifisch für den Einsatz validierter Antikörper in IP und Immunoblotting 10,16,18. So werden häufig rekombinante Proteine ​​mit einem Peptid - Epitop markiert, z. B. Influenza - Hämagglutinin (YPYDVPDYA) oder menschliche cMyc (EQKLISEEDL), für den hochaffinen spezifischen Antikörpern sind kommerziell erhältlich. Falls gewünscht, kann die Immunpräzipitation Antikörper chemisch an die Protein-A-Harz, konjugiert werden, um seine Elution und Detektion während des Immunoblotting Stufe zu vermeiden, die die co-ausgefällten pr verdunkelnotein 16; Um dies zu erreichen, haben wir erfolgreich den chemischen Vernetzer 3,3&#39;-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) 24 verwendet. Es ist zwingend notwendig, dass ein geeignetes Detergens in dem Puffer IP enthalten ist und das unlösliche Material von homogenisierten Zellen durch Zentrifugieren entfernt wird, nicht-spezifische Bindung (Schritt 3.1.3) zu minimieren. Die Wahl und Konzentration des Detergens sind wichtige Überlegungen: stärkere Detergenzien und / oder höhere Konzentrationen werden im wesentlichen nicht-spezifische Verringerung Bindung kann aber auch X abschaffen: Y Protein-Wechselwirkung, wohingegen geringere Konzentrationen oder milder Detergentien können eine schwache Wechselwirkung ermöglichen beobachtet werden, sondern kann führen zu hohen unspezifischen Bindung. Zwischenfestigkeit Detergenzien sind bevorzugt, beispielsweise Triton X-100 bei 0,5 -. 1% Konzentration. Weiter zu reduzieren , nicht-spezifische Bindung, ein neutrales Protein (beispielsweise Rinderserumalbumin bei 100 ug / ml) in dem IP - Puffer enthalten sein, und / oder das Zelllysat kann vorge cleare werdend vorheriger Inkubation mit Protein-A-Harz allein. Y Paar getestet, typischerweise drei 10-minütiges Waschen mit IP-Puffer (Schritt 3.1.9): Die Anzahl der Wäschen sollte für die X optimiert werden. In jedem Fall ist ein Co-IP Probe mit nicht-immunem IgG als Immunpräzipitation Antikörper sollte immer parallel verarbeitet werden, als Negativkontrolle (Schritt 3.1.6) zu dienen. Der Hauptvorteil der chemischen Vernetzung ist, dass es auf die stöchiometrische Zusammensetzung des Proteins Homooligomer informiert. Glutaraldehyd ist eine häufig verwendete Vernetzer , weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert und erzeugt thermisch und chemisch stabile Vernetzungen zwischen interagierenden Proteinen 19,20. Verbindungen mit freien Aminogruppen sollte von Assay-Puffer (Schritt 3.2.1) weggelassen werden, da sie die chemische Reaktion auslöschen wird. Glutaraldehyd-Konzentration und Reaktionszeit (Schritt 3.2.4) sollte für die oligomeren Proteinkomplex von Interesse optimiert werden. Der Hauptnachteil dieser Technik especiVerbündeter, wenn auf ganze Zellpräparaten durchgeführt wird, ist die nicht-Spezifität der chemischen Reaktion, die künstliche Proteinaggregate ergeben könnte, die biologische Bedeutung fehlt. Alternative in vivo (z. B. Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer, bi-molekulare Fluoreszenz oder Lumineszenz Komplementierung) und in - vitro - Techniken (z. B. Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation, isothermen Titrationskalorimetrie) zur Charakterisierung der Selbstassoziation und Beurteilung Protein zur Verfügung stehen Oligomerisie- Stöchiometrie 29,30. Jedes Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile, und es kann besser geeignet für die Untersuchung eines spezifischen Proteins auf Proteinreinigung / Stabilität und Ausrüstung / Reagenz Verfügbarkeit abhängig sein. Die drei komplementären hier beschriebenen Verfahren im Detail, nämlich Y2H, Co-IP und Vernetzung wurden in Kombination verwendet worden zwingende Beweise für RyR2 homo-oligome bereitzustellenr Bildung in Isolation und innerhalb einer lebenden Zelle.

Skelett- und Herzmuskelkontraktion wird durch Retikulum Ca 2+ Freisetzung vermittelt durch RyR ausgelöst. Es gibt drei Säugetier RyR Isoformen mit dem Funktionskanal aus vier identischen Untereinheiten zusammengesetzt. Jede RyR Untereinheit besteht aus einer großen zytoplasmatischen regulatorischen N-terminalen Teil und einem kleinen C-terminalen Teil der Transmembran - Domänen enthält , die einen hohen Leitwert Ca 2+ Pore bilden. Abnormale intra- und interUnterEinheit Wechselwirkungen zu Grunde liegen RyR Kanalstörungen und führen zu einer neuromuskulären und Herzerkrankungen 1. Die Identifizierung und Charakterisierung von spezifischen Bereichen beteiligt in RyR Struktur: Funktionsbeziehung ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathophysiologie RyR. Traditionelle biochemische Protein-Protein-Interaktionstechniken erfordern beträchtliche Mengen an gereinigtem Protein, oft in Bakterien produziert. Dies ist nicht möglich, in dem Fall der RyR, eine sehr große Membran protein von ~ 5000 Aminosäuren besteht, während seine rekombinante Fragmente nicht leicht zugänglich für die bakterielle Expression und Reinigung sind. So alternative Expressionssysteme eukaryotischen Wirtszellen beteiligt sind für Säuger integrale Membranproteine ​​erforderlich. Wir haben zuvor Y2H, Co-IP und Vernetzungsassays eingesetzt kollektiv zu zeigen , dass N-Terminus Tetramerisierung ein strukturelles Merkmal, das in den drei Säugetier RyR 2,3 - Isoformen konserviert ist. Wichtig haben, wir , dass eine einzelne Punktmutation mit arrhythmogenic Herzkrankheit stört N-Terminus Selbstassoziation und die Ergebnisse in einer dysfunktionalen RyR Kanal 4 assoziiert gefunden. Wir haben auch diese Techniken Oligomerisierung Untersuchungen der RyR zytoplasmatischen C-terminal tail 5 sowie den N-Terminus des homologe intrazellulären Ca 2+ -Freisetzung Kanal angewendet, der Inositol - 1,4,5 triphosphat Rezeptor 2. Im Y2H-Assay wird die interactiauf zwischen zwei Proteinen (X und Y) durch die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors (GAL4) und der anschließenden Aktivierung von Reportergenen 6-9 gemessen. Zwei verschiedene Klonierungsvektoren verwendet Fusionen der beiden getesteten Proteine ​​mit den zwei physikalisch trennbaren unabhängigen Domänen von GAL4 zu generieren: DNA-bindenden Domäne (DNA-BD) / Protein X-Fusions (bait) und Aktivierungsdomäne (AD) / Protein Y Fusions (Ziel). Die Y2H kann verwendet werden, um zu testen, ob ein Protein mit sich selbst in Wechselwirkung von GAL4 DNA-BD und AD-Fusionen des gleichen Proteins zu erzeugen. Gentechnisch veränderte Y2H Stämme sind GAL4 und GAL80 - defizienten (das GAL80 - Protein ist ein Repressor der GAL4) sowie TRP1 und LEU2 - defizienten (Ernährungs Auswahl für Köder und Beute Plasmide zur Verfügung zu stellen, beziehungsweise). In der Hefe Kern werden die rekombinanten DNA-BD und AD-Peptide in enge physische Nähe brachte einen Hybrid-GAL4-Transkriptionsfaktor zu erzeugen, nur durch ihre Fusionen &#39;X: Y interaction. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle genetische Screening von Protein-Protein - Wechselwirkungen durch die parallel Transkriptionsaktivierung von prototrophen (HIS3 - Codierung für ein Enzym , die für Histidin - Biosynthese) und chromogenem (LacZ - Codierung für β-Galactosidase (β-Gal)) Reportergene zu detektieren. Der Hauptvorteil des Y2H ist , dass es ein in vivo Assay, der sogar schwach oder transiente Protein-Protein - Interaktionen detektiert. Darüber hinaus beinhaltet die einfache Detektion Verwendung von Wachstumsselektion (in Medium ohne Histidin) oder eines kolorimetrischen (β-Gal) Assay ohne die Notwendigkeit zur Reinigung der Köder und Zielproteine ​​oder die Erzeugung von spezifischen Antikörpern. Zusätzlich kann die Y2H verwendet werden, um eine Sammlung von zufälligen unbekannte Klone (cDNA-Bibliothek-Klone zu GAL4 AD fusioniert) zu screenen für neuartige Bindungspartner eines Köderprotein, auch einen direkten Zugang zu der cDNA der Bibliothek Protein geben. Um die Y2H Beobachtungen erstrecken, independent biochemischen Techniken können eingesetzt werden. Co-IP und Vernetzungsassays mit Immunoblotting kombiniert werden Verfahren verwendet , um Protein - Assoziationen in komplexen Probengemische erfassen, z. B., Ganzzelllysaten 10. Ihr Hauptvorteil ist, dass sie berichten über Protein-Protein-Wechselwirkungen von nativem Gewebe, im Gegensatz zu anderen Verfahren, die die Verwendung von rekombinanten Proteinen erforderlich. Rekombinante Proteine ​​können auch verwendet werden, typischerweise in einer Säugerzelllinie exprimiert wird, wo sie wahrscheinlich ihre korrekte Konformation und post-translationale Modifikationen aufweisen, sowie subzelluläre Lokalisierung. Da jedoch Co-IP und Vernetzung sind in vitro - Assays Verwendung von homogenisierten Zellen machen, ist es notwendig , zu bestätigen , ob die zwei Proteinpartnern in der intakten Zelle 11 co-lokalisiert sind. Wir verwenden routinemäßig Transfektion von Säuger HEK293 Zellen , die transient Säugetier integrale Membran und cytosolische Proteine ​​zu exprimieren unter Verwendung des Calciumphosphat - Fällungsverfahren 2-4,12-14, Beschrieben hier im Detail. Dies ist eine kostengünstige Möglichkeit , um effizient die Plasmid - DNA in Zellen zu liefern , aber es ist abhängig von der jeweiligen Zelllinie verwendet und Zellkonfluenz sowie die Reinheit der Plasmid DNA 11,15. Der Co-IP - Test umfasst die Isolierung des nativen oder rekombinanten Proteins von Interesse aus den Zelllysaten unter nicht-denaturierenden Bedingungen ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von vermeintlichen Interaktionspartner 10,16. Es erfordert die Verwendung von zwei unabhängigen Antikörper, die Immunpräzipitation Antikörper zur Isolierung von Protein X und dem Immunoblotting-Antikörper zur Detektion von Proteinpartner Y. es verwendet werden kann, um zu testen, ob ein Protein mit sich selbst durch Erzeugen von zwei verschiedenen Fusionen mit zwei verschiedenen Epitop interagiert Tags (z. B. HA und cMyc). Der Immunopräzipitieren Antikörper wird durch die Fc-Region auf Protein-A gebunden (oder Protein-G, von der Tierart ab, in dem der Antikörper erhöht wurde), diean Agarose (Sepharose oder Harz) konjugiert. Protein-A-Harz nach Inkubation mit dem Zelllysat, nämlich die detergenslöslichen Fraktion von homogenisiertem Zellen: Protein X wird durch den Antikörper präzipitiert. Protein Immunkomplexe eluiert mit SDS-haltigem Puffer und anschließend durch SDS-PAGE analysiert und Immunblotting unter Verwendung eines Antikörpers das Vorhandensein von Protein 17 Y zu detektieren. Co-IP sollte mit detergenslöslichen Proteinen durchgeführt werden, um übermäßige unspezifische Bindung zu vermeiden. Y pair 10,16,18: Die Wahl des Waschmittels und dessen Konzentration, sowie die Anzahl der Waschungen, sollte für jeden X optimiert werden. Vernetzung wird verwendet, um die Stöchiometrie des oligomeren Proteinkomplexes zu bestimmen. Es basiert auf einer chemischen Reaktion basiert auf kovalenten Bindungen zwischen benachbarten zusammenwirkenden Protomere erzeugen und es daher ermöglicht, die Erhaltung des oligomeren Status des Proteins während der SDS-PAGE-Trennung. Es gibt zahlreiche Vernetzungs reagents verschiedener Längen und Chemie verschiedene reaktive Gruppen auf Proteinen, die typischerweise primäre Amine, Carboxyl- oder Thiolgruppen Targeting. Hier beschreiben wir die Verwendung von Glutaraldehyd (OHC (CH 2) 3 CHO), ein homo-bifunktionelle Vernetzer mit zwei Aldehydgruppen an beiden Enden , die mit freien Aminogruppen in Lysinresten 19,20 reagieren. Vernetzung wird in einer konzentrations- und zeitabhängigen Weise, gefolgt in Adduktbildung führt. Glutaraldehyd Reaktion mit Hydrazin (H 2 NNH 2) und Proteinproben gestoppt werden dann durch SDS-PAGE analysiert und 17 Immunoblotting ihre Oligomerisierungszustand zu bewerten. Wir sollten diese Vernetzung beachten Sie keine Oligomerisierung induzieren, sondern lediglich schafft stabile Brücken zwischen bereits bestehenden Proteinkomplexen. Wichtige Überlegungen bei der Vernetzungs Durchführung von Experimenten sind die Wahl der Vernetzer, seine Konzentration und Reaktionszeit 19,20.

<table><tbody><tr><td>PART 1 Hefe Zwei-Hybrid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plattenbrutator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Verwendet bei 30 &/�; C</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler-Inkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Verwendet bei 30 > C mit Schütteln bei 230 - 250 U/min</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Zur Messung von O<D>sub600 von Hefekulturen; zur Messung der Extinktion bei 420 nm in flüssigem b-Gal-Assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Enthält den Ködervektor pGBKT7, den Beutevektor pACT2 und den Hefestamm Y190</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoff Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Zur Herstellung von minimalem SD Growh Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout-Ergänzung ohne Leucin und Tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Zur Herstellung von minimalem SD-Wachstumsmedium&nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout-Ergänzung ohne Leucin, Tryptophan, Histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Zur Herstellung von minimalem SD-Growh-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA des Trägers der Hoden von Heringshoden&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Für die Hefeumwandlung</td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier Güteklasse 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>zur Verwendung in Colony-Lift-Filterpapier, b-Gal-Assay</td></tr>, <tr><td>X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>zur Verwendung in Colony-Lift-Filterpapier, b-Gal-Assay</td></tr>, <tr><td>ONPG (o-Nitrophenyl-&beta;-D-Galactopyranosid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>zur Verwendung in flüssigen b-Gal-Assays</td></tr><tr><td><stark>TEIL 2. Proteinexpression in einer Säugetierzelllinie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573&Handel;</td><td></td></tr><tr><td>Befeuchteter Inkubator (5% CO2, 37 &deg; C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Zur Kultivierung von Säugetierzellen</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>Zur Vorbereitung von Wachstumsmedium für Säugetierzellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Zur Herstellung von Wachstumsmedium für Säugetierzellen</td></tr><tr><td>Glaskügelchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Zur Homogenisierung von Zellen</td></tr><tr><td>Nadel 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Mikrolanze</td><td>300700</td><td>Zur Homogenisierung von Zellen</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail (Komplett)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Zur Vorbeugung von Proteolyse</td></tr><tr><td>TEIL 3. In vitro biochemische Methoden&nbsp; </td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE-System<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Für die Elektrophorese von Polyacrylamid-Gel</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-Dry Transfer System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Für den elektrophoretischen Transfer</td></tr><tr><td>Kompakter Röntgenfilmprozessor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Zur Verwendung in chemischer Vernetzung</td></tr><tr><td>von Protein-A-Sepharosekügelchen&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Zur Verwendung in Co-IP-Assays</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 Kaninchen polyklonales IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Zur Verwendung in co-IP</td></tr><tr><td>Assays Nicht-immunes Kaninchen IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Zur Verwendung im co-IP-Assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 monoklonales IgG der Maus)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>Zur Verwendung bei Immunblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 Maus monoklonales IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Zur Verwendung bei Immunblotting</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-2005</td><td>Zur Verwendung bei Immunblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>Zur Verwendung bei Immunblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Zur Verwendung beim Immunblotting</td></tr></tbody></table>

genetische und biochemische ansätze für<em&gt; in vivo</em&gt; und<em&gt; in vitro</em&gt; beurteilung von protein oligomerisierung: der ryanodinrezeptor case study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerisierung ist oft eine strukturelle Voraussetzung für Proteine, um ihre spezifische zelluläre Funktion zu erfüllen. Zum Beispiel ist die Tetramerisierung des Ryanodinrezeptors (RyR) für die Bildung einer funktionellen Ca2+ -Freisetzungskanalpore notwendig. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle zur Beurteilung der Selbstassoziation von Proteinen, einschließlich Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H), Co-Immunpräzipitation (co-IP) und chemischer Vernetzungsassays. Im Y2H-System wird die Protein-Selbstinteraktion durch β-Galactosidase-Assay in Hefe nachgewiesen, die GAL4-Köder co-exprimiert und Zielfusionen des Testproteins durchführt. Die Protein-Selbstinteraktion wird weiter durch co-IP unter Verwendung von HA- und cMyc-markierten Fusionen des Testproteins untersucht, das in Säugetier-HEK293-Zellen co-exprimiert wird. Die genaue Stöchiometrie des Proteins Homo-Oligomer wird durch Vernetzung und SDS-PAGE-Analyse nach Expression in HEK293-Zellen untersucht. Mit diesen unterschiedlichen, aber komplementären Techniken haben wir die Selbstassoziation der RyR N-terminalen Domäne konsistent beobachtet und ihre intrinsische Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren nachgewiesen. Diese Methoden können auf Protein-Protein-Interaktions- und Homo-Oligomerisierungsstudien anderer integraler Membranproteine von Säugetieren angewendet werden.

Im Y2H System der Köder: Beute - Interaktion wird anfänglich durch das Wachstum der Hefe in Medium ohne Selektion (Tryptophan, Leucin und) Histidin und anschließend beurteilt durch β-Gal enzymatische Aktivitätstests (Figur 1) getestet. Hefe in Medium ohne Histidin hat langsame Wachstumsrate, die auf der Stärke des Köders hängt: Prey-Protein-Interaktion. Die β-Gal-Assay wird in Hefe durchgeführt (kultiviert in Medium ohne Tryptophan und Leucin nur) entweder wachsen auf festen Träger (Agarplatten) oder in Flüssigkultur, wobei letztere Nachgeben quantitative Ergebnisse. Wir haben erfolgreich die Y2H zu identifizieren domain-Domäne Wechselwirkungen innerhalb der RyR2 sowie neuartige Proteinpartner 2-4,12,21,22 verwendet. Beispielsweise gescreent wir eine Reihe von Konstrukten überlappend über die gesamte Länge des RyR2 Peptidsequenz für die Wechselwirkung mit einem N-terminalen Fragment überspannt (AD4L: RyR2 Reste 1-906 mit GAL4 AD fusioniert). 3 Kolonie-Lift - Filterpapier β-Gal Assays erzeugt lebendige blau-gefärbten Hefekolonien nur für die BT4L: AD4L Paar (2A), die zeigen , dass AD4L mit sich selbst in Wechselwirkung tritt, nämlich die BT4L konstruieren (RyR2 Reste 1-906 fusioniert mit GAL4 DNA-BD). Blasse blaue Kolonien wurden für die BT8 erkannt: AD4L Paar eine sekundäre schwächere Assoziation mit der extremen C-terminalen Domäne (BT8) darauf hindeutet, während Hefe co-transformiert mit einem anderen Konstrukt blieb weiß und daher negativ für Köder: Prey-Protein-Interaktion. Quantitative Ergebnisse, erhalten durch Flüssig β-Gal - Assays (2B), robust BT4L angegeben: AD4L Wechselwirkung äquivalente Festigkeit zu der bekannten Assoziation zwischen dem p53 Protein (PVA3) und SV40 large T - Antigen (pTD1), während die BT8: AD4L Wechselwirkung deutlich schwächer war (&lt;10% im Vergleich zur Kontrolle). Wir führen routinemßig aus Co-IP Experimenten (Figur 3) ftransiente Expression in einer Säugerzelllinie (HEK293) ach als unabhängige biochemische Assays die Y2H Erkenntnisse 2-4,12-14,21-24 zu verstärken. RyR2 N-Terminus Selbst Interaktion, zwei getrennte Plasmide kodieren für RyR2 Reste 1 Um zu überprüfen - 906 markiert mit entweder der cMyc oder HA-Peptid-Epitop (BT4L und AD4L, jeweils) waren cotransfiziert in HEK293-Zellen unter Verwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahren 3. Die post-nukleären Fraktion von homogenisiertem Zellen wurde mit dem Detergens CHAPS solubilisiert, und das unlösliche Material durch Zentrifugation entfernt wurde das Zell-Lysat zu erzeugen. Das Zelllysat, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wird , wurde dann mit Ab HA und Protein-A - Sepharose - Kügelchen inkubiert HA-markiertes AD4L zu immunpräzipitieren. Co-IP - Proben, Elution mit SDS-Puffer, wurden auf zwei getrennten Gelen SDS-PAGE geladen (1/10 und 9/10 th split) und analysiert durch Immunoblotting mit Ab HA und Ab cMyc, respectively. Erfolgreiche direkte IP von AD4L (~ 100 kDa) durch Ab HA wurde durch Immunoblotting nachgewiesen, aber nicht in der Negativkontrolle unter Verwendung von nicht-immunen Kaninchen IgG (4A). Wichtig ist , dass nur in der Ab HA IP gewonnen cMyc-tagged BT4L (~ 100 kDa) und nicht in der negativen Kontrolle in Abwesenheit von immunpräzipitierten AD4L (4B). Y2H und Co-IP-Assays bereitgestellt timmende Beweise für RyR2 N-Terminus selbst Wechselwirkung, aber sie haben auf der Oligomerisierung Status der N-terminalen Domäne nicht informieren, nämlich ob sie nur Dimere oder höhere Komplexe bildet. Es sollte beachtet werden, dass Komplexe dissoziiert und nur die Untereinheiten umfasst, wird durch SDS-PAGE nachgewiesen werden wegen SDS- und wärmeinduzierte Denaturierung von Proteinen Protein-Protein-Wechselwirkungen aufzuheben. Um dies zu überwinden, verwenden wir eine Vernetzung (Abbildung 5) , die chemisch stabil und vorbestehenden protei docktn - Oligomere, deren Molekularmasse kann dann 2-5 durch SDS-PAGE Größentrennung untersucht werden. Zum Beispiel Homogenat HEK293 Zellen exprimiert cMyc-BT4L, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wurde mit Glutaraldehyd und analysiert durch SDS-PAGE und Immunoblotting unter Verwendung von Ab cMyc (Abbildung 6) umgesetzt. Zusätzlich zu dem Monomer (~ 100 kDa), ein hochmolekulares Proteinbande von ~ 400 kDa wurde in einer zeitabhängigen Weise detektiert, was darauf hinweist RyR2 N-Terminus Tetramerbildung 3. Bemerkenswerterweise war Tetramer die vorherrschenden oligomeren Spezies, mit minimalen Dimer und Trimer beobachteten Banden. Um seine scheinbare Molekularmasse bestimmen, wurde das Oligomer BT4L getrennt durch 4-15% Gradienten - SDS-PAGE - Gelen 3. Wir produzierten die Molekularmasse / Gel-Retardation-Standardkurve unter Verwendung von Proteinstandards mit einem Bereich von 30 bis 460 kDa, und wir das Oligomer berechnet werden 358 kDa 15 (n = 4). Diese scheinbare Molekularmasse steht im Einklang mit einem BT4L Tetramer in a angeordnetgeschlossenen Kreismode statt in linearer Form, wie aus der Anordnung der vier Untereinheiten innerhalb der nativen Kanal RyR2 erwartet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Abbildung 1. Y2H Flussdiagramm. Hefe, co-transformiert mit Köder und Ziel Plasmide, wird für das Wachstum in Medium ohne Histidin ausgewählt und / oder für β-Gal enzymatische Aktivität getestet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Abbildung 2. Y2H Schlägt RyR2 N-Terminus Domain Self-Interaktion. (A) Schematische Darstellung der (Köder) Reihe von menschlichen RyR2 überlappende Protein getestet Fragmente im Y2H System für<html> Interaktion mit dem RyR2 N-terminalen AD4L (Beute) Konstrukt. &quot;-&quot; Für negative Wechselwirkung (B) Quantitative Flüssigkeit β-Gal - Tests gegen die positive Kontrolle normiert (PVA3 kodiert für GAL4 DNA-BD. Qualitative Ergebnisse , die durch Kolonie-Lift - Filterpapier β-Gal Assays sind in &quot;+&quot; Multiples oder angezeigt Fusion mit p53-Protein; pTD1 kodiert für GAL4 AD Fusion mit SV40 large T-Antigen). Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Abbildung 3. Co-IP Flussdiagramm. Säugerzellen co-transfiziert mit Plasmiden , X und Y, werden homogenisiert und Detergens-solubilisierten das Zelllysat in dem Co-IP - Assay, gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting verwendet erzeugen.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Abbildung 4. Co-IP Zeigt RyR2 N-Terminus Domain Self-Interaktion in Mammalian Cells. HEK293 - Zellen wurden kotransfiziert für transiente Coexpression cMyc-tagged (BT4L) und HA-markiertes (AD4L) RyR2 N-Terminus - Domäne ( Reste 1-906). AD4L wurde mit Ab HA von CHAPS-solubilisierte und Dithiothreit-behandelten Lysats HEK293 immunpräzipitiert, wohingegen als negative Kontrolle, Co-IP - Assays wurden mit nicht-immunem Kaninchen - IgG durchgeführt. Immunpräzipitierten Proteine ​​wurden für 5 min bei 85 ° C erhitzt und bei 20 mA für 3 Stunden durch getrennte 6% SDS-PAGE - Gele geladen mit 1/10 oder 9/10 th von IP Proben gelöst. Nach Proteintransfer bei 80 V für 2 h auf polyvinylidene difluoride Membran wurde Immunoblotting - Analyse durchgeführt unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) Ab HA (A) oder Ab cMyc (B) verbunden sind, gefolgt von Meerrettich - Peroxidase-konjugiertem anti-Maus - IgG (1: 10000 Verdünnung) und verstärkte Chemilumineszenz Detektions (1 min Exposition). Ein Aliquot des Zelllysats, 1/50 des Volumens in IP - Proben verarbeitet, wurde auch als Molekularmassenstandard dienen enthalten. Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vernetzungsflussdiagramm. Mammalian Zellen, die mit Plasmid X transfiziert werden homogenisiert und einer Reaktion mit Glutaraldehyd im Vernetzungs Assay, gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die Vernetzung Zeigt RyR2 N-Terminus Domain Tetramerbildung HEK293 - Zellen für die transiente Expression von transfizierten wurden cMyc-markierte (BT4L) RyR2 N-Terminus - Domäne (Reste 1-906).. Zellhomogenisat, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wurde mit Glutaraldehyd für den angegebenen Zeitpunkten inkubiert. Proben wurden 5 min bei 85 ° C erhitzt und durch SDS-PAGE (6% Gel) bei 20 mA für 3 h gelöst. Folgende Proteintransfer bei 80 V für 2 h auf Polyvinylidendifluorid-Membran wurde Immunoblotting - Analyse durchgeführt unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) Ab cMyc, gefolgt von Meerrettich - Peroxidase-konjugiertem anti-Maus - IgG (1:10.000 Verdünnung) und verbesserte Chemolumineszenznachweise (1 min Exposition). Monomer (M: ~ 100 kDa) und tetrameren (T) Formen sind durch die Pfeile angedeutet ist. Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Das übergeordnete Ziel dieser drei komplementären experimentellen Techniken – Hefe-Zwei-Hybrid, Co-Immunpräzipitation und chemische Vernetzung – besteht darin, Protein-Protein-Interaktionen und insbesondere die Selbstassoziation zu untersuchen sowie die stöchiometrische Zusammensetzung von proteinogenen Homo-Oligomeren zu bestimmen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kardiopathien zu beantworten, wie beispielsweise die Oligomerisierung ultrasensibler Rezeptoren, die Herzrhythmusstörungen und plötzlichen Herztod zugrunde liegt. Die wichtigsten Vorteile dieser Techniken liegen in ihrem relativ hohen Durchsatz, der einfachen Handhabung und den sehr gut reproduzierbaren Ergebnissen, wobei nur minimaler apparativer und reagentieller Aufwand erforderlich ist.Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methoden reichen bis hin zur Therapie arrhythmogener Herzerkrankungen, da sie dazu beitragen, den molekularen Wirkmechanismus von antiarrhythmischen Arzneistoffen aufzuklären. In der Regel haben Personen, die neu in der Co-Immunpräzipitation sind, Schwierigkeiten, weil sie die sehr kleinen Protein-Agarose-Kügelchen möglicherweise beim Absaugen des Überstandes während der Zentrifugationsschritte verwerfen könnten. Bei diesem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay werden Hefezellen in der mittleren Log-Phase für die Transformation verwendet.Die Zellen durch Zentrifugation gewinnen, jedes Pellet in fünf Milliliter steriler Wasser resuspendieren und die Zellsuspensionen vereinigen. Die Zellsuspension zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes das Hefepellet in einem Milliliter frisch hergestellter, steriler 1× Lithiumacetat- und TE-Lösung resuspendieren. Die kompetenten Hefezellen müssen innerhalb einer Stunde nach der Herstellung verwendet werden.Plasmidproben herstellen, indem DNA aus Bait- und Target-Plasma mit 100 Mikrogramm Heringstestes-Träger-DNA vermischt wird. Zu jedem 1,5-Milliliter-Röhrchen 100 Mikroliter der kompetenten Hefe-Suspension und 600 Mikroliter einer Einmal-Lösung aus Lithiumacetat und PEG hinzufügen und etwa 30 Sekunden lang vortexen. Für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.Gebe 80 µL Dimethylsulfoxid hinzu und mische vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen. Für 15 Minuten bei 42 °C im Wasserbad hocken, wobei alle zwei bis drei Minuten vorsichtig gemischt wird. Die Zellsuspension zwei Minuten lang auf Eis abkühlen lassen und anschließend die Hefe durch Zentrifugation gewinnen.Suspendieren Sie jedes Zellpellet in 100 Mikrolitern 1× TE-Puffer. Impfen Sie die Zellen auf geeignete minimale SD-Medium-Platten aus, um einen Selektionsdruck auf sowohl Köder- als auch Zielplasmide aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Platten für vier bis fünf Tage bei 30 Grad Celsius in umgekehrter Position. Die Hefe-Kolonien sind bereit für diesen Assay, wenn sie einen Durchmesser von etwa zwei Millimetern aufweisen.Pipettieren Sie 2,5 Milliliter frisch zubereitete Z-Puffer- und X-gal-Lösung in eine saubere 100-Millimeter-Platte und legen Sie ein Zellulosefilterpapier in die Platte. Legen Sie ein neues Filterpapier auf die Oberfläche der Platte mit den zu analysierenden Hefe-Kolonien. Benutzen Sie eine Pinzette, um das Filterpapier vorsichtig auf die Platte zu drücken, und lassen Sie es etwa fünf Minuten lang liegen, damit sich die Kolonien anheften können.Unter Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung das Filterpapier vorsichtig anheben und 30 Sekunden lang in eine Flüssigstickstofflache eintauchen. Das gefrorene Filterpapier zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen lassen. Das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf das vorher mit Flüssigkeit getränkte Filterpapier in der 100-Millimeter-Platte legen und bei 30 Grad Celsius inkubieren, bis blaue Kolonien erscheinen.Einen Tag vor der Transfektion die HEK293-Zellen in einer 100-Millimeter-Petrischale mit Nährmedium versorgen, sodass die Zellen am folgenden Tag 60 bis 70 Prozent konfluent sind. 16 bis 18 Stunden in einem befeuchteten Inkubator kultivieren. Am Tag der Transfektion 24 Mikrogramm Plasmid-DNA mit 60 Mikrolitern 2,5-molarer Calciumchloridlösung und steriler deionisierter Wasserlösung auf ein Gesamtvolumen von 600 Mikrolitern verdünnen.Schwenken, um zu mischen. Geben Sie die Plasmid-DNA plus Calciumlösung tropfenweise in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 600 Mikrolitern 2X HEPES-Pufferlösung, während kontinuierlich und kräftig durch Schwenken gemischt wird. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung von Calciumphosphat-Plasmid-DNA-Komplexen zu ermöglichen.Nach der 20-minütigen Inkubation kurz vortexen und die Lösung tropfenweise auf die HEK293-Zellen geben, sodass die gesamte Oberfläche der Petrischale bedeckt ist. Die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 Prozent Kohlendioxid inkubieren. Nach etwa sechs Stunden das Wachstumsmedium wechseln und die Zellen zurück in den Inkubator stellen.24 Stunden nach der Transfektion die Zellen wie im Protokolltext beschrieben gewinnen. Den Zellenpellet in 500 Mikroliter eiskaltem Homogenisierungspuffer resuspendieren und die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Glasperlen überführen. Die Zellen auf Eis mit einer feinen Nadel, die an eine Ein-Milliliter-Spritze angebracht ist, homogenisieren.Bei geschlossenem Röhrchenverschluss die Verschlusskappe mit der Nadel durchstechen und die Zellsuspension kräftig durch die Glasperlen hindurch dispersieren. Zentrifugieren Sie bei 1500 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Kerne und unbeschädigte Zellen zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand, der die postnukleäre Fraktion darstellt, für die Verwendung in Co-Immunpräzipitations- oder Vernetzungsversuchen auf.Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie den postnukleären subzellulären Anteil mit 0,5 Prozent CHAPS auf und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter ständigem Mischen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das unlösliche Material zu pelletieren. Heben Sie den Überstand auf.Dies wird als Zelllysat bezeichnet. Bereiten Sie Protein-A-Agarosekügelchen im Immunpräzipitationspuffer gemäß der Beschreibung im Protokolltext vor. Geben Sie ein Mikrogramm des immunpräzipitierenden Antikörpers zu einem Rohr mit Protein-A hinzu.Als negativen Kontrollversuch geben Sie ein Mikrogramm nicht-immunes IGG in das andere protein-A-haltige Reaktionsgefäß. Inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter ständigem Mischen. Gewinnen Sie die Kügelchen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren.Überführen Sie 200 Mikroliter des Zelllysats in jedes der beiden Röhrchen mit Antikörper und Protein-A-Kügelchen. Inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter ständigem Mischen, um die Bindung von Antigen und Antikörper zu ermöglichen. Gewinnen Sie die Kügelchen zurück und waschen Sie sie mit 200 Mikrolitern Immunpräzipitationspuffer.Ansatz für 10 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Nach drei Waschschritten das Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen. 30 Mikroliter Protein-Puffer zu den Kügelchen geben und bei 1500 × g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Das Überstand enthaltend die angesprochene Co-IP-Probe für nachfolgende SDS-Gelelektrophorese und Immunoblotting aufbewahren. Für die chemische Vernetzung die postnukleäre subzelluläre Fraktion zentrifugieren, um Proteinaggregate zu pelletieren. Den Überstand auffangen und in acht Aliquots zu jeweils 20 µL aufteilen.Fügen Sie 0,0025 Prozent (Volumen pro Volumen) Glutaraldehyd nur einer Probe hinzu. Starten Sie den Timer und lassen Sie den Glutaraldehyd bei Raumtemperatur für die angegebene Dauer reagieren. Beenden Sie die Glutaraldehyd-Reaktion zum festgelegten Zeitpunkt mit zwei Prozent (Volumen pro Volumen) Hydrazin und geben Sie fünf Mikroliter 5×-Protein-Puffer zum Denaturieren der Proteine hinzu.Der Hefe-Zwei-Hybrid-Test wurde verwendet, um überlappende Konstrukte, die die gesamte Länge der Ryanodin-Rezeptor-Peptidsequenz abdecken, auf Interaktion mit AD4L und dem endständigen Fragment zu untersuchen. Bei den Beta-Galaktosidase-Assays mittels Kolonieabdruck auf Filterpapier zeigten sich nur für das BT4L/AD4L-Paar deutlich blaue Kolonien, was zeigt, dass AD4L mit sich selbst interagiert. Für das BT8/AD4L-Paar wurden blassblaue Kolonien nachgewiesen, was auf eine sekundäre, schwächere Assoziation mit der extremen C-terminalen Domäne hindeutet.Quantitative Ergebnisse aus flüssigen Beta-Gal-Assays zeigten eine starke BT4L/AD4L-Interaktion, die in ihrer Stärke der bekannten Assoziation zwischen dem P53-Protein pVA3 und dem SV40 großen T-Antigen pTD1 entspricht. Die BT8/AD4L-Interaktion war deutlich schwächer. Die Befunde des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems werden durch Ko-Immunpräzipitations-Experimente gestützt, die nach der transienten Expression von HA-markiertem AD4L und cMyc-markiertem BT4L in einer Säugerzelllinie durchgeführt wurden.Die direkte Immunpräzipitation von HA-markiertem AD4L durch einen HA-Antikörper 2 wurde beobachtet, und cMyc-markiertes BT4L wurde nur bei der Anti-HA-Immunpräzipitation angereichert. Eine chemische Vernetzung wurde an einem Zellhomogenat durchgeführt, das cMyc-BT4L exprimierte, gefolgt von SDS-PAGE und Immunsouthernblot unter Verwendung eines Antikörpers gegen cMyc. Neben dem 100 Kilodalton schweren Monomer wurde eine proteinhaltige Bande hoher Molekülmasse von etwa 400 Kilodalton in abhängiger Weise von der Zeit nachgewiesen, was auf die Bildung eines Ryanodinrezeptors und terminales Tetramer hinweist.Bei der Transfektion von Säugetierzellen mittels Kalziumphosphat-Fällung ist es wichtig, den Phosphatpuffer in einem großen Reagenzglas ständig und kräftig zu wirbeln, um eine effiziente Belüftung zu gewährleisten, während die Plasmid-DNA-Lösung sehr langsam zugegeben wird. Nach diesen Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie in der Kalzium-Bildgebung durchgeführt werden. Diese Techniken sollten helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Lokalisation und zu den Kalziumfreisetzungseigenschaften von Ryanodin-Rezeptorkanälen in lebenden Zellen.Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken Forschern in verschiedenen Bereichen der Zellsignaltransduktion den Weg, um die Protein-Homo-Oligomerisierung zu untersuchen, einen grundlegenden biologischen Prozess, der die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, Enzymen, Ionenkanälen und Rezeptoren reguliert.

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Genetische und biochemische Ansätze für In Vivo und In Vitro Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study (Video) | JoVE Journal

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