マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成

このプロトコルでは、マウスの洞結節およびAV結節に対して、マイクロ解剖、ホールマウント免疫蛍光染色、および顕微鏡検査を行うために必要な手順を説明しています。ホールマウント法は、洞およびAVリンパ節の正確な3D局在と形態に対処し、周囲の組織との関係を調べるのに有利です。組織の形態は、組織の脱水と物理的破裂を最小限に抑えてかなり保存されています。

まず、針を左心室に慎重に押し込み、5〜10ミリリットルの氷冷PBSを静かに注入して心臓を大量に注入することにより、頂点の領域に27ゲージの針で心臓を穿刺します。ピンセットを使用して心臓を慎重に持ち上げ、大きな血管を切って心臓を取り除きます。解剖顕微鏡下で氷冷PBSで満たされた解剖皿に心臓を入れます。

心臓の向きを決定したら、心臓の前面が皿の底にくるように心臓を回転させます。小さなピンを頂点と心房付属器を通して解剖皿の下部にあるアガロースに入れることにより、心臓を固定します。細いピンセットやハサミを使って、上大静脈と下大静脈の周りの非心臓組織を慎重に取り除きます。

大静脈間領域を露出させるには、マイクロハサミで心室と心房の間の溝と平行に切断することにより、心室の大部分を切除します。固定および脱水のために、サンプルを4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩入れます。翌日、心臓を15%ショ糖溶液に移し、摂氏4度で24時間インキュベートします。

インキュベーション後、心臓を30%ショ糖溶液に4°Cでさらに24時間移します。PBSで希釈した1%Triton X-100で心臓を洗浄します。次に、ブロッキング溶液で摂氏4度で一晩ブロックし、透過化します。

心臓を1.5ミリリットルのチューブに入れ、ブロッキング溶液で希釈したウサギ抗マウスConnexin 43およびラット抗マウスHTN4抗体と4°Cで7日間インキュベートします。7日後、一次抗体を含む溶液をピペットで取り除きます。オービタルシェーカーで1%Triton X-100溶液を1回の洗浄につき1時間、3回心臓を洗浄します。

インキュベーション後、二次抗体とDAPIで洗浄ステップを繰り返します。プラスチックリングを準備して粘土で満たした後、心臓の後ろを上にして心臓を粘土の溝に入れます。心臓の背側に位置し、脳頭間領域があるSANを特定します。

心臓にPBSを追加して、心臓がPBSで完全に覆われるまで、空洞内のすべての空気を置換します。プラスチックリングの端にシリコンを塗布します。サンプルの周囲を粘土にそっと押し込んで心臓を固定し、カバースリップで心臓を覆います。

次に、粘土の裏側をそっと押してPBSの一部を絞り出し、イメージング領域内の気泡を避けながら心臓をカバースリップに取り付けます。ホールマウント染色サンプルを逆さまにして共焦点顕微鏡のプラットフォームに置き、テキスト原稿に記載されているようにイメージングを進めます。共焦点顕微鏡の各チャンネルのパラメータは、それぞれのソフトウェアを使用して設定します。

このプロトコルは、マウスの心臓の洞房結節と房室結節の両方の共焦点顕微鏡イメージングを実行するために使用されました。HCN4 と Connexin 43 をそれぞれ標的とする蛍光抗体による伝導系と作用性心筋の特異的染色により、無傷の解剖学的構造内の洞房結節と房室リンパ節を同定することが可能になります。このホールマウント染色プロトコルにより、さまざまな抗体を使用して、さまざまな細胞タイプの相互作用を研究することができます。