胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

この手順の全体的な目的は、発達中のマウス胚心臓における筋原線維および心筋細胞の成熟度を評価することです。まず、切片作製用培地の中で胚心臓を適切な方向に向けて凍結させます。次に、適切な方向で心臓を凍結切片化します。

次に、心臓切片を用いて、目的タンパク質の免疫蛍光標識を行います。最後に、免疫染色した心臓切片の共焦点顕微鏡観察を実施します。最終的に、2次元および3次元の画像解析を用いて、MyFiおよびその他の心筋細胞構造の発達を示します。

この手法は、変異や心臓遺伝子がMyFiの構築や、介在板やcostumersといった特定の構造の出現にどのように影響するかなど、心臓発生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。胚心臓を急速凍結させるには、化学フード内で3.5 centimeterのペトリ皿に最適切片温度（OCT）コンパウンドを満たします。液体窒素中で2-メチルブタンを冷却します。

テキストプロトコルに従ってマウス胚心臓を単離した後、心臓をOCTに入れ、数秒間静置して馴化した後、OCTが入った7 mmのモールドに移します。心臓の内壁がモールドの底面に向くように配置してください。その後、モールドを液体窒素で冷却した2-メチルブタンにそっと浸します。

OCTが完全に白く固まるまで、2-メチルブタン液体がOCTや心臓の凍結面に触れないように注意します。その後、モールドをドライアイスを入れた氷バケツに移します。すべての心臓が凍結したら、クライオモールドをアルミホイルで包み、凍結切片作成まで-80°Cで保存します。

胚心臓を固定するには、12ウェルの培養プレートの各ウェルにPBSで調製した4% PFAを満たします。テキストプロトコルに従って胚心臓を摘出した後、各心臓をPFAが入ったウェルに入れ、4°Cで一晩固定します。心臓を凍結保護するため、プラスチック製転送ピペットを用いて、各心臓をPBSで調製した15% Sucrose 1.5 mLを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、心臓がチューブの底に沈むまで4°Cで緩やかに撹拌します。その後、各心臓をPBSで調製した30% sucroseに移し、心臓がチューブの底に沈むまで4°Cで緩やかに撹拌します。

本ビデオで先に示した通り、胚をOCTで凍結させます。クライオモールドをクライオスタットチャンバーに入れ、温度を−17°Cに調整した後、クライオモールドを反転させ、緩やかに圧力をかけてモールドから心臓ブロックを押し出します。組織ブロックの上面に心臓の前壁が来るように配置してください。

チャックの上にOCTを大きく一滴滴下し、心臓ブロックをそのOCTの上に載せます。このとき、心臓の前壁がチャックから最も遠くなるように向きを調整してください。心臓がチャック上で凍結するまで待ちます。

チャックと心臓ブロックを装着した状態で、クライオスタットの試料ホルダーに設置します。刃の角度が試料に対して3〜5度になるように調整します。正電荷コーティングで前処理した顕微鏡スライドガラスに、10 µmの切片を採取します。

免疫蛍光染色を行うため、サンプルを完全に乾燥させた後、-80°Cで保存します。切片の固定およびOCTの除去後、PBSで希釈した1×ブロッキングバッファーを使用し、緩やかに振盪しながら45分間ブロッキングを行います。マウスで作製された一次抗体を使用する場合は、PBS 0.1% tween 20で1:100に希釈したdonkeyまたはgoat anti-mouse IgG H+L monovalent FAB fragmentを加え、室温で緩やかに振盪しながら45分間インキュベートします。

1xブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を加え、室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。インキュベート後、1xPBSを用いて切片を10分間、3回洗浄します。室温で、ブロッキングバッファーで1:500に希釈した標識二次抗体を試料に加え、遮光して2時間インキュベートします。

室温にて、XPBSを用いて切片を室温で10分間ずつ、遮光下で3回洗浄します。スライドの両端に封入剤を2滴ずつ滴下し、カバーガラスで覆って封入します。最後に、ネイルエナメルを用いてカバーガラスを密封します。

撮影の準備が整うまで、遮光して4 °Cで保存します。4倍対物レンズとレーザー蛍光を用いて、サンプルおよび目的の領域を探します。マップとして使用するための画像をキャプチャします。

高倍率でイメージングを行う際は、ステージへの調整を最小限に留めながらスライドを取り除きます。その後、60 x オイル浸漬対物レンズに切り替えます。

対物レンズに少量のオイルを滴下し、スライドをステージに戻します。次に、サンプルを再度探し、各チャンネルのレーザー出力、露光時間、およびビニングを希望のレベルに設定してください。テキストプロトコルのガイドラインに従い、最適な設定が決定したら、そのサンプル設定を実験内のすべての組織切片に使用します。

強度ヒストグラムを使用して、解析に使用する各チャネルの最適な強度範囲を確認します。適切なレーザーチャネルを選択し、取得関数を用いてZスタックを生成します。その後、Zスタックの上限および下限を選択してください。

ソフトウェアで提供される光学切片厚の2分の1の値となるZackステップサイズを選択します。[run]をクリックし、Fijiまたは同等の画像解析プログラムを使用して画像を収集します。カスタムカラーモードオプションを選択し、各チャンネルを個別のウィンドウに分割してZackファイルを開きます。

画像のプルダウンメニューから「明るさとコントラストの調整」ツールを開き、各チャンネルで最適なヒストグラム強度範囲を設定します。あらかじめ決定したこれらのチャンネル範囲を、解析対象となるすべてのZackに適用してください。次に、画像のカラープルダウンメニューから、個々のチャンネルを統合して1つの合成画像を作成します。

「Image Stacks」の「Z project」メニューを使用して、複合画像からフラット化されたZスタックを作成します。この画像は3D画像よりも大幅に明るくなるため、コントロールサンプルのヒストグラム強度範囲を調整してオーバーサチュレーションを避け、同じ設定を実験群のフラット化されたZスタックに適用してください。3D画像を生成するには、まず「Image Stacks」の「3D project」メニューを選択します。回転軸としてX軸またはY軸のいずれかを選択してください。

スライス間隔をZスタックのステップサイズと同じミクロン数に設定します。希望する総回転数を選択し、回転角度の増分を1に設定してください。次に、プラグインのプルダウンメニューからImageJ 3Dビューアを開きます。

合成画像の表示設定を「volume」に選択し、リサンプリング係数を1または2に設定します。これらの図は、急速冷凍およびアセトン固定した心臓における異なるタンパク質の共染色の代表的な結果を示しています。α-actininに対する抗体は、高い特異性と最小限のバックグラウンドで、Z線および介在板を再現性よく標識しました。接着接合タンパク質であるβ-cateninに対する抗体は、心筋細胞と非心筋細胞の両方の膜に結合し、E 16.5の推定介在板においてα-actininとの共局在が認められました。胚心臓におけるβ1-integrinの免疫蛍光染色は特に困難ですが、本研究でのβ1-integrin染色では、α-actininで標識されたZ線と同じ周期性のシグナルが検出され、これはE 16.5に形成されつつある nascent costameres を反映している可能性があります。

E 12.5において、SFA actininおよびtropomyosinの染色パターンは、外側のコンパクトゾーンに見られる成熟した筋原線維と一致する規則的な周期性を、心室中隔の心筋細胞に示しました。SFA actininは線状よりも点状に認められ、tropomyosinのシグナルは線状ではなく拡散していました。E 12.5の心臓におけるNCA接着染色および心室中隔の心筋細胞は、SFA actininの強染部位と共局在しており、これは介在板を表している可能性があります。ここでは、LifeAct RFP Rubyトランスジェニックマウスから得られた、SFA actininおよびフィラメント状アクチンを標識したPFA固定E 12.5胚心臓を示しています。SFA actinのS/N比は、急速凍結心臓切片と比較して低下していました。

3次元画像再構成により、心筋細胞内のMyFiは互いにほぼ平行である一方で、個々の心筋細胞は互いに異なる角度で配向していることが明らかになりました。このビデオを視聴することで、胚心臓の適切な配向法と凍結切片作成法、さらにマウス心臓の発達過程におけるMyFiおよび心筋細胞の成熟度を評価するための免疫染色、共焦点顕微鏡観察、および画像解析の手法について十分に理解できるはずです。承認する。