胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

この手順の全体的な目標は、発生中の胚マウス心臓における筋細胞および心筋細胞の成熟を評価することです。これは、最初に切断媒体で胚の心臓を向き付けて凍結することによって達成されます。次に、心臓を適切な向きで凍結切片化します。

次に、心臓切片は、目的のタンパク質の免疫蛍光標識を受けます。最後に、免疫染色心臓切片の共焦点顕微鏡検査が行われます。最終的に、2次元および3次元の画像解析を使用して、MyFiやその他の心筋細胞構造の発達を示します。

この方法は、突然変異や心臓遺伝子がMyFiアセンブリにどのように影響するか、介在する椎間板やコスチュームなどの特定の構造の出現など、心臓発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。胚の心臓をスナップフリーズするには、最適な切断温度またはOCT培地を使用して、化学フードに3.5センチメートルのペトリ皿を充填します。涼しい。液体窒素中の2つのメチルブタン。

テキストプロトコルに従ってマウス胚の心臓を単離した後、心臓をOCTに置き、数秒間平衡させてからOCTを含む7ミリメートルの型に移します。液体窒素に型を穏やかに置き、2つのメチルブタンを冷却します。

2つのメチルブタン液がOCTに触れないように注意するか、OCTが白く固まるまで心臓が凍結します。次に、型をドライアイスの入ったアイスバケツに移します。すべての心臓が凍結したら、クライオ型をホイルで包み、クライオセクショニングの準備ができるまで摂氏マイナス80度で保管します。

胚の心臓を固定するには、PBS中の4%PFAを使用して、12枚のホイル培養プレートのウェルを満たします。テキストプロトコルに従って胚の心臓を解剖した後、各心臓をPFAのウェルに入れ、摂氏4度で一晩固定します プラスチック製の移送ピペットを使用して心臓を凍結保護するには、PBS中の1.5ミリリットルの15%スクロースを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに各心臓を移動させ、心臓がチューブの底に沈むまで摂氏4度で穏やかに攪拌します。各心臓をPBS中の30%スクロースに移し、心臓がチューブの底に沈むまで摂氏4度で穏やかに攪拌します。

このビデオで前述したように、OCTで胚を凍結します。クライオモールドをクライオスタットチャンバーに入れ、摂氏マイナス17度に相当した後、クライオモールドを反転させ、穏やかな圧力を使用してモールドから心臓ブロックを排出します。心臓の前壁を成形組織ブロックの上部に向けます。

OCTの大きな滴をチャックに置き、ハートブロックをOCTドロップに取り付けます。心臓の前壁がチャックから最も遠ざかるように向きを保ちます。心臓がチャックに凍りつくのを待ちます。

チャックと取り付けられたハートブロックをクライオスタットオブジェクトホルダーにロードします。ブレードの角度がサンプルに対して3〜5度になるように調整します。正に帯電したコーティングで前処理された顕微鏡スライドに10マイクロメートルの切片を採取します。

サンプルを完全に乾燥させてから、摂氏マイナス80度で保存して免疫蛍光染色を行います。OCTを切片から固定および/または除去した後、PBSで希釈したブロッキングバッファー1個を使用して、穏やかに振とうしながら45分間ブロッキングします。マウスで作製した一次抗体を使用する場合は、PBS 0.1%tween 20で1〜100に希釈したロバまたはヤギの抗マウスIgG H plus L一価FABフラグメントを添加し、室温で45分間静かに振盪しながらインキュベー

一次抗体または1×ブロッキングバッファーで希釈した抗体を添加し、室温または摂氏4度で一晩2時間インキュベートします。インキュベーション後、1つのXPBSを使用して切片を10分間3回洗浄します。室温で、アドレーター標識二次抗体をブロッキングバッファーで1〜500に希釈し、サンプルにインキュベートし、光から保護して2時間インキュベートします。

室温で、1つのXPBSを使用して、光から保護された状態で10分間、室温で切片を洗浄します。スライドの両端に2滴のメディウムを置き、カバースリップを使用してカバーを覆うことにより、スライドをアンチフェードメディウムに取り付けます。マニキュアを使用してカバースリップを密封します。

摂氏4度で保管し、画像化する準備ができるまで光から保護します。4倍対物レンズとレーザー蛍光を使用して、サンプルと対象領域を見つけます。マップとして使用する画像をキャプチャします。

高倍率で撮像する場合。スライドを取り外し、スライドステージに最小限の調整を加えます。次に、60 x オイル浸対物レンズに変更します。

対物レンズに少量のオイルを注ぎ、スライドをスライドステージに交換します。次に、サンプルを再度見つけ、レーザー出力の露光時間とビニングを各チャネルの目的のレベルに設定します。テキストプロトコルのガイドラインに従って最適な設定が決定されたら、実験内のすべての組織切片のサンプル設定を使用します。

強度ヒストグラムを使用して、分析に使用される各チャネルの最適な強度範囲をメモします。アクイジション機能を使用して、適切なレーザーチャンネルを選択することでZackを生成します。次に、Z スタックの上限と下限を選択します。

ソフトウェアが提供する光学スライスの厚さの半分の値であるZackステップサイズを選択します。「実行」をクリックして、フィジーまたは画像分析用の同等のプログラムを使用して画像を収集します。カスタムカラーモードオプションを使用してZackファイルを開き、チャンネルを別々のウィンドウに分割します。

画像のプルダウンメニューから、明るさのコントラスト調整ツールを開き、各チャンネル内で最適なヒストグラム強度範囲を設定します。前に決定したように、これらのチャネル範囲を解析対象のすべてのZackに適用します。次に、画像の色からプルダウンメニューを選択し、個々のチャンネルを1つの合成画像にマージします。

イメージの「スタックZ」プロジェクトメニューを使用して、合成イメージからフラット化されたZスタックを作成します。この画像は3D画像よりも大幅に明るくなるため、コントロールサンプルのヒストグラム強度範囲を調整して過飽和を避け、実験的な平坦化されたザックに同じ設定を適用します3D画像を生成するには、まず画像スタック3Dプロジェクトメニューを選択します。回転の X 軸または Y 軸を選択します。

スライス間隔を Z スタック ステップ サイズと同じミクロン数に設定します。目的の合計回転を選択し、回転角度の増分を 1 に設定します。次に、プラグインのプルダウンメニューから画像J 3Dビューアを開きます。

生成された合成画像の表示をボリュームとして選択し、リサンプリング係数を 1 または 2 に設定します。これらの図は、スナップ凍結、アセトン固定心臓、再現性のある標識ZディスクであるSαアクチニンに対する抗体、および高い特異性と最小限のバックグラウンドを持つインターレーテッドディスクで、さまざまなタンパク質のcos染色の典型的な結果を示しています。接着接合タンパク質β-カテニンに対する抗体は、心筋細胞および非心筋細胞の両方の膜に結合し、SFAアクチニンとの共局在は、E 16.5ベータワンの推定インターレーテッドディスクで発生し、胚性心臓におけるインテグリン免疫蛍光は特に困難であるが、これらの研究におけるベータワンインテグリン染色は、SFAアクチニン標識Zディスクと同じ周期性を有するシグナルを明らかにした。 おそらく、E 16.5で形成された初期のコスチュームを反映しています。

E 12.5では、SFAアクチニンおよびトロポマイシン染色パターンは、外側コンパクトゾーンの成熟筋原線維と一致する小柱心筋細胞で規則的な周期性を示し、SFAアクチニンは線状よりも点状であり、トロポミオシン信号は線状ではなく拡散性であり、E 12.5心臓では、強いSFAアクチニン染色の領域と同時局在するSFAアクチニン染色の領域がインターレーテッドディスクを表している可能性があります。ここに示されているのは、Life Act RFP Rubyトランスジェニックマウス由来のSFAアクチニンおよび糸状アクトンで標識されたPFA固定E 12.5胚性心臓です。SFAアクチンのシグナル対雑音比は、スナップ凍結心臓切片と比較して減少しました。

3次元画像再構成により、心筋細胞内のMyFiは互いにほぼ平行であるが、個々の心筋細胞は互いに異なる角度で向き合っていることが明らかになりました。このビデオを見れば、胚の心臓の適切な向き付けと凍結切片の方法、マウスの心臓発生中のMyFiと心筋細胞の成熟を評価するための免疫染色、共焦点顕微鏡法、画像解析の方法について十分に理解できるはずです。認める。