Name: Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Lernen Sie die Analyse HBV-spezifischer CD4-T-Zell-Reaktionen bei chronischer Hepatitis-B-Infektion mittels Peptidstimulation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81930061), der Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) und Chinese Key unterstützt. Projekt spezialisiert auf Infektionskrankheiten (2018ZX10723203).

Von jedem patienten, der in die Studie eingeschlossen wurde, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Das Studienprotokoll entspricht den ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki von 1975, was sich in der a priori Genehmigung durch die medizinische Ethikkommission des Southwest Hospital widerspiegelt.
1. Design der HBV-abgeleiteten Peptidmatrix
<ol><li>Laden Sie Aminosäuresequenzen des HBV-Kernantigens aus NCBI-Datenbanken herunter (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Kaufen Sie HBV-Kernantigen-abgeleitete Peptide (ein Panel von 35 15-mer-Peptiden, die sich um 10 Rückstände überlappen, Reinheit &gt; 90%, 4 mg / Peptid) von einem Peptidsynthese-Dienstleister.</li>
	<li>Richten Sie eine quadratische 6×6-Peptidmatrix ein, wobei jede Position in der Matrix nur 1 Peptid enthält. Es gibt 12 Peptidpools: 6 Reihenpeptidpools und 6 Säulenpeptidpools, 5-6 Peptide in jedem Pool16. Die Zeilenpeptidpools und die Säulenpeptidpools in der Matrix stellen 2 separate Formationen des HBV-Kernantigens dar.</li>
	<li>Für 3/4 der gekauften Peptide mischen Sie Peptide in derselben Reihe/Spalte der Matrix in 12 separate Peptidpools, indem Sie sie zusammen in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen (2 μg/μL für jedes Peptid). Bei -80 °C für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen lagern.</li>
	<li>Den Rest der Peptide separat auflösen (10 μg/μL) und bei -80 °C zur Epitopidentifikation lagern.</li>
</ol>2. Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs)
<ol><li>Probenahme von 5 ml venösem Blut von Patienten mit chronischer HBV-Infektion. HINWEIS: Das Blutvolumen sollte grob nach der Anzahl der Peptidpools plus 1 Hintergrundkontrolle und 1 Positivkontrolle geschätzt werden. Die Analyse von 1 Peptidpool benötigt 3 x 105 PBMCs. Im Durchschnitt konnten 1 x10 6 PBMCs aus 1 ml Blut gewonnen werden.</li>
	<li>Isolieren Sie PBMCs aus dem Blut mit Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (800 × g, 20 min) und kryokonservieren Sie isolierte PBMCs in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um Granulozyten zwischen der klaren Ficoll-Schicht und der roten Blutkörperchenschicht zu sammeln. Extrahieren Sie genomische DNA aus Granulozyten mit einem genomischen DNA-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Senden Sie die DNA-Probe an Genotypisierungsdienstleister, um den HLA-DRB1-Genotyp zu bestimmen.</li>
</ol>3. In-vitro-Expansion von PBMCs mit einer HBV-Peptidmatrix
<ol><li>PBMCs auftauen.<ol>
<li>Warme RPMI 1640 ergänzt mit 1:10.000 Benzonase (25 U/ml) bis 37 °C im Wasserbad. HINWEIS: Benzonase hilft, die Zellklumpung während des Auftauens zu begrenzen. Jede Probe benötigt 20 ml RPMI 1640 mit Benzonase. Berechnen Sie die Menge, die zum Auftauen aller Proben benötigt wird, und bereiten Sie ein separates Aliquot von Medien (37 °C) mit 1:10.000 Benzonase (25 U / ml) vor. Tauen Sie nicht mehr als 5 Proben gleichzeitig auf.</li>
		<li>Proben aus flüssigem Stickstoff entnehmen und gefrorene Fläschchen in einem Wasserbad (37 °C) schnell auftauen.</li>
		<li>Die aufgetaute Zellsuspension in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) tropfenweise in das Röhrchen geben. Langsam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Zentrifugenröhrchen geben, Kryovial mit weiteren 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) abspülen, um alle Zellen abzurufen. Fahren Sie so schnell wie möglich mit den restlichen Proben fort. HINWEIS: Die langsame Verdünnung von kryokonservierten Proben ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit aufgetauter Zellen.</li>
		<li>Zentrifuge (400 × g, 10 min), entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet durch Klopfen des Rohres.</li>
		<li>Das Pellet vorsichtig in 1 ml warmer Benzonase RPMI 1640 wieder aufkehren. Mischen Sie vorsichtig und filtern Sie die Zellen bei Bedarf durch ein 70 μm-Zellsieb (d. H. Wenn ein sichtbarer Klumpen vorhanden ist).</li>
		<li>Aliquotieren Sie eine 10 μL-Suspension und verdünnen Sie sie in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), fügen Sie Trypanblau (0,04%) hinzu, laden Sie es auf ein Hämozytometer, warten Sie 1 Minute und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (klare Zellen).</li>
		<li>9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Röhrchen geben, zentrifugieren (400 × g, 10 min), den Überstand entfernen und das Pellet durch Klopfen des Röhrchens lösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend PBMCs in RPMI 1640 ergänzt mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% humanem AB-Serum (vollständiges Kulturmedium). Passen Sie die Zelldichte auf 1,5 x 106 Zellen/ml an. Platten-PBMCs in 96-Well-Platten (flacher Boden) mit einer Dichte von 3 x 105 Zellen/Well.</li>
	<li>Fügen Sie HBV-abgeleitete Peptidpools (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid) zu jeder Vertiefung hinzu. Für Vertiefungen der Hintergrundkontrolle und Positivkontrolle fügen Sie die gleiche Menge Lösungsmittel (DMSO, 1 μL / ml) hinzu. Fügen Sie 10 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7 hinzu. Bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.</li>
	<li>Ergänzen Sie an Tag 3 das Kulturmedium mit 50 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7. HINWEIS: Von Tag 1 bis Tag 3 wird keine offensichtliche T-Zell-Proliferation beobachtet. Die Gesamtzellzahl nimmt normalerweise um 1/3 bis 1/2 ab, da Nicht-T-Zellen wie B-Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen und Monozyten abstreichen.</li>
	<li>Ersetzen Sie an Tag 7 die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium, das Peptide (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) und IL-7 (20 ng/ml) enthält. HINWEIS: Um eine Störung der Zellen an der Unterseite zu vermeiden, pipetetten Sie etwa 90 μL Kulturmedium vorsichtig von der Oberseite des Mediums. Während Tag 3 bis Tag 7 wird eine robuste T-Zellproliferation beobachtet, und proliferierende T-Zellen aggregieren sich normalerweise zu Clustern.</li>
	<li>Am Tag 10 die Zellkultur in jeder Vertiefung 7-9 Mal vorsichtig pipetten, um Zellcluster zu disaggregieren, die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen und 2×105 Zellen in jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) für die HBV-spezifische CD4-T-Zell-Antwortanalyse zu übertragen.</li>
	<li>Setzen Sie die Kultivierung der übrigen Zellen zur Epitopidentifizierung am Tag 12 fort, stellen Sie das Volumen des Kulturmediums auf 100 μL ein (verwerfen Sie übermäßiges Medium) und ergänzen Sie die Kultur mit 100 μL frischem vollständigem Kulturmedium, das Peptide (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) und IL-7 (20 ng / ml) enthält. HINWEIS: Während Tag 7 bis Tag 10 vermehren sich die T-Zellen weiterhin kräftig. Ersetzen Sie das Kulturmedium wie in Schritt 3.5, wenn das Medium gelb wird. Im Allgemeinen überschreitet die Zellzahl 6×105 am Tag 10. Jede Vertiefung zeigt normalerweise eine ähnliche Zellzahl, zählt die Zellzahl in 3 Vertiefungen und verwendet den Durchschnittswert als Schätzung der Zellzahl für alle Vertiefungen.</li>
</ol>4. Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen mittels intrazellulärer Durchflusszytometrie
<ol><li>Stimulierung von PBMCs mit Peptidpools<ol>
<li>Für die auf die 96-Well-Platte (runder Boden) übertragenen Zellen 3 mal in einer Platte waschen (550 × g, 3 min). Verwenden Sie 200 μL Medium für jede Wäsche (RPMI 1640 für die ersten 2 Waschgänge, vollständiges Kulturmedium für die letzte Wäsche). Verwerfen Sie die Überstände. HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen in der Kultur durch wiederholtes Waschen könnte den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse effektiv verringern.</li>
		<li>Fügen Sie für jede Zellbohrung, die mit einem spezifischen Peptidpool stimuliert wird, 200 μL vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit den gleichen Peptidpools ergänzt wird (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid). Für die Hintergrundkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO ergänzt wird. Für die Positivkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und 1 μmol / L Ionomycin ergänzt wird. HINWEIS: Eine hohe Dosis DMSO blockiert die Zytokinsekretion von T-Zellen (am wichtigsten für TNF-α). Eine Dosis von DMSO über 5 μL/ml wird nicht empfohlen. Im Allgemeinen überschreitet die Dosis von DMSO in unserem Experiment 1 μL / ml nicht.</li>
		<li>Bei 37 °C und 5% CO 2 für6 h inkubieren.</li>
		<li>Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchflusszytometrie<ol>
<li>Nach 6 h Inkubation. Überstand nach Zentrifugation (550 × g, 3 min), Waschen sie die Zellen einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), Fleckenoberflächenmarkern (CD3, CD4 und CD8) und Lebensfähigkeitsmarker (mit Fixable Viability Dye) in einem 4 °C Kühlschrank für 30 min.</li>
		<li>Einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min) waschen. Fixieren und permeabilisieren Sie Zellen und färben Sie intrazelluläre Zytokine (TNF-α und IFN-γ) in einem 4 °C Kühlschrank für 45 min.</li>
		<li>Nach der abschließenden Wäsche in der intrazellulären Färbung werden die Zellen in 150 μL Durchflusszytometriepuffer (DPBS + 0,5% BSA) resuspendiert.</li>
		<li>Erfassen Sie Durchflusszytometriedaten auf einem Durchflusszytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie<ol>
<li>Definition des positiven Brunnens: Betrachten Sie einen Brunnen als positiv, wenn er eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden T-Zellen mindestens das Zweifache der Hintergrundkontrollbohrung aufwies (Abbildung 1).</li>
		<li>Berechnen Sie nach der folgenden Formel die Ansprechrate für jedes analysierte Zytokin (Abbildung 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> HINWEIS: Der Zeilenpeptidpool und die Säulenpeptidpools in der Matrix repräsentieren 2 verschiedene Formationen des HBV-Kernantigens, daher sollte die endgültige Ansprechrate durch 2 geteilt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identifizierung von HBV-spezifischen HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen
<ol><li>Auftauen und Pflegen allogener B-lymphoblastoider Zelllinien (BLCLs) im T-75-Kolben (5-20 ×106 Zellen, 20 ml vollständiges Kulturmedium). HINWEIS: Um den guten Zustand der BLCLs zu gewährleisten, sollte dieser Schritt 2 Wochen vor dem Auftauen der PBMCs der Patienten eingeleitet werden. BLCLs müssen im HLA-DRB1-Allel homozygot sein. Gemäß dem Genotypisierungsergebnis sollten patienten das gleiche HLA-DRB1-Allel wie BLCLs teilen.</li>
	<li>Screening von Kandidatenpeptiden zur Identifizierung (Abbildung 3)<ol>
<li>Gemäß den Ergebnissen der T-Zell-Antwortrate am Tag 10 sollten 2 Peptidpools mit der höchsten Ansprechrate (1-Reihen-Peptidpool und 1-Säulen-Peptidpool) untersucht werden.</li>
		<li>Setzen Sie das Peptid in diesen 2 Pools als Kandidatenpeptid, wenn der andere Peptidpool, der dieses Peptid enthält, auch ein positives Ergebnis in der T-Zell-Antwortanalyse zeigt. Verwenden Sie die PBMCs, die mit dem anderen Peptidpool erweitert wurden, um später Epitope zu identifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulsierende BLCLs mit Peptid<ol>
<li>Zählen Sie an Tag 12 die Anzahl der lebensfähigen BLCLs, übertragen Sie die Zellen auf 15 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie (350 × g, 10 min) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Kulturmedium und aliquot BLCLs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) bei 4×104 Zellen/Vertiefung in 80 μL vollständigem Kulturmedium.</li>
		<li>Ein einzelnes Peptid (10 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO2 für 2 h inkubieren. Set 2 Hintergrundkontrolle: Peptidpulsing mit HLA-DR-Blockierung (Vorbehandlung mit Anti-HLA-DR (10 μg/ml) für 1 h); DMSO (1 μL/ml) pulsierend. Das Endvolumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 100 μL.</li>
		<li>Mitomycin C (100 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h inkubieren.</li>
		<li>3 mal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen, um ungepulstes Peptid und Mitomycin C zu entfernen. Für die erste Wäsche die Inkubationskultur mit 100 μL RPMI 1640 ergänzen.</li>
		<li>Resuspend Zellen in 120 μL vollständigem Kulturmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimulation von PBMCs mit peptidgepulsten BLCLs.<ol>
<li>An Tag 12 PBMCs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) übertragen.</li>
		<li>Den Überstand nach der Zentrifugation (550 × g, 3 min) in einer Platte entfernen, zweimal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen. HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen und Peptiden in der Kultur durch wiederholtes Waschen ist der Schlüsselschritt, um den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse zu verringern. Besonders bei Restpeptiden bindet es an BLCLs und erhöht den Hintergrund deutlich.</li>
		<li>Resuspend PBMCs an jeder Vertiefung mit 210 μL vollständigem Kulturmedium.</li>
		<li>Für den Brunnen von PBMCs, die für die Epitopidentifikation ausgewählt wurden, mischen Sie das Aliquot (jeweils 70 μL) mit peptidgepulsten BLCLs (3 Vertiefungen, einschließlich 2 Hintergrundkontrollen). HINWEIS: An Tag 12 erreicht die Anzahl der expandierten PBMCs in Peptidpools normalerweise über 5-7×105 pro Vertiefung, so dass das Verhältnis von PBMCs / BLCLs etwa 6/1 zu 4/1 beträgt.</li>
		<li>Bei 37 °C und 5% CO 2 für6 h inkubieren.</li>
		<li>Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben. Das endende Volumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchflusszytometrie<ol>
<li>Wiederholen Sie die gleichen Vorgänge wie in Schritt 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie<ol>
<li>Überprüfung eines Peptids als HLA-DR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop, wenn PBMCs, die mit diesem Peptid gepulst wurden, gepulste BLCLs eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen zeigen, die mindestens das Zweifache der pbMCs aufweisen, die mit Hintergrundkontrollen inkubiert wurden (Peptidpulsing mit HLA-DR-Vorblockierung; DMSO pulsierend) (Abbildung 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die kritischsten Schritte in diesem Protokoll sind wie folgt aufgeführt: 1) genügend PBMCs mit hoher Lebensfähigkeit, um die PBMCs-Expansion zu starten; 2) geeignete Umgebung für die Erweiterung von PBMCs; und 3) vollständige Entfernung von restenPtidpools in PBMCs-Kultur vor der Epitopidentifizierung.
Die gesamte Analyse in diesem Protokoll hängt von der robusten Proliferation von CD4-T-Zellen ab. Im Allgemeinen ist die Anzahl der PBMCs nach 10-tägiger Erweiterung das 2-3-fache der ursprüngli...

Derzeit gibt es 3 Hauptansätze zur Analyse antigenspezifischer T-Zellen. Der erste Ansatz basiert auf der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Peptid (Epitop). Antigenspezifische T-Zellen könnten direkt mit Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Multimeren gefärbt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie lebensfähige antigenspezifische T-Zellen erhalten könnte, die sich für die nachgelagerte Transkriptomik/Metabolomik-Analyse eignen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über die gesamte T-Zell-Reaktion auf ein bestimmtes Antigen liefern konnte, da sie validierte Epitoppeptide erfordert, während die Anzahl der identifizierten Epitope für ein bestimmtes Antigen vorerst begrenzt ist. Im Vergleich zu Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD8-T-Zell-Epitopen wurden weniger HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope identifiziert1,2, was diese Methode für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen derzeit weniger anwendbar macht.
Der zweite Ansatz basiert auf der Hochregulierung einer Reihe von aktivierungsinduzierten Markern nach Antigenpeptidstimulation3. Zu den häufig verwendeten Markern gehören CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Diese Methode wurde nun verwendet, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei geimpften Personen5,6, Human Immunodeficiency Virus Infektion Patienten7und Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infektion Patienten8,9zu analysieren. Im Gegensatz zum Peptid-MHC-Multimer-basierten Assay ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt und könnte lebensfähige Zellen für die nachgelagerte Analyse erhalten. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über das Zytokinprofil antigenspezifischer T-Zellen liefern konnte. Auch die Expression dieser aktivierungsinduzierten Marker durch einige aktivierte Antigen-unspezifische Zellen könnte zu den Hintergrundsignalen in der Analyse beitragen, was ein Problem darstellen könnte, insbesondere wenn die Zielantigen-spezifischen T-Zellen selten sind. Derzeit gibt es eine begrenzte Anwendung dieser Methode auf HBV-spezifische CD4-T-Zellen4. Ob diese Methode genutzt werden kann, um HBV-spezifische CD4-T-Zellen zuverlässig zu analysieren, bedarf weiterer Untersuchungen.
Der dritte Ansatz basiert auf der Zytokinsekretion nach Antigenpeptidstimulation. Wie die aktivierungsinduzierte markerbasierte Analyse ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt. Diese Methode könnte das Zytokinprofil von antigenspezifischen T-Zellen direkt aufdecken. Die Sensitivität dieser Methode ist geringer als die aktivierungsinduzierte markerbasierte Methode, da sie auf der Zytokinsekretion antigenspezifischer T-Zellen beruht und die Anzahl der getesteten Zytokine in der Regel begrenzt ist. Derzeit wird diese Methode häufig in der Analyse von HBV-spezifischen T-Zellen eingesetzt. Da Zytokin-sezernierende HBV-spezifische T-Zellen durch direkte ex vivo Peptidstimulation kaum nachgewiesen werdenkonnten10,11, wird das Zytokinprofil von HBV-spezifischen T-Zellen in der Regel nach 10-tägiger in vitro peptidstimulierender Expansion analysiert12,13,14,15,16. Die Anordnung von Peptidpools in Matrixform wurde verwendet, um die Identifizierung antigenspezifischer Epitope zu erleichtern17,18. Mit der Kombination von Peptidmatrix und Zytokinsekretionsanalyse wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig zu identifizieren16. In diesem Protokoll werden die Details dieser Methode beschrieben. HBV-Kernantigen wird in diesem Protokoll als Beispiel für die Demonstration ausgewählt.

<table><tbody><tr><td>Albumin Bovine V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjugiertes Anti-humanes TNF-&alpha;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Vor Licht geschützt</td></tr><tr><td>aufbewahren Benzonase-Nuklease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Begrenzung der Zellverklumpung</td></tr><tr><td>von B-lymphoblastoiden Zelllinien (BLCLs)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td></td> IHW09126 <td>HLA-DRB1*0803 homozygote</td></tr><tr><td>B-lymphoblastoide Zelllinien (BLCLs)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td></td> IHW09121 <td>HLA-DRB1*1202 homozygot</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche (T75)</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte (96 Well, flacher Boden)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Zellkulturplatte mit flachem Boden</td></tr><tr><td>(96 Well, runder Boden)</td><td>Corning</td><td>3799</td> Zellsieb <td>mit rundem Boden</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Porengröße 70 &mu; m, weiß, steril</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 mL)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>Steriles</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (50 mL)</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Zentrifuge, gekühlt</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge,</td><td>gekühlt Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge,</td><td>gekühlt Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>Lösung vor Gebrauch vorbereiten</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td> Bei <td>Raumtemperatur aufbewahren, um eine Kristallisation zu verhindern</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepuffertes</td><td></td><td></td><td>Kochsalzpräparat ddH2O (1000 ml) mit NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) und Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Stellen Sie den PH-Wert auf 7,4 ein. Sterilisieren Sie durch den Autoklaven.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitzen (0,5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Filterspitzen (100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Filterspitzen (1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>FITC-konjugierte Anti-Human-CD4</td><td>BioLegend 300506</td><td></td><td>Vor Licht geschützt</td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Vor Licht schützen</td></tr><tr><td>GolgiStop Proteintransportinhibitor (enthält Monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Proteintransportinhibitor</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Marke</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>HBV-Kernantigen abgeleitete Peptide</td><td>ChinaPeptide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Humanserum AB</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td>Autoklaviersterilisation vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Mikrotiterplattenschüttler</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen (0,2 mL)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-konjugiert Anti-Human-CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Vor Licht geschützt</td></tr><tr><td>PE-konjugiert Anti-Human-IFN-& Gamma;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Vor Licht geschützt</td></tr><tr><td>halten Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-konjugiert Anti-Human-CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Vor Licht geschützt</td></tr><tr><td>halten Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant humanes IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Farbstoff (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF gereinigtes Anti-Human-HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Genomische DNA Aufreinigungsset</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von hbv-spezifischen cd4-t-zell-reaktionen und identifizierung von hla-dr-beschränkten cd4-t-zell-epitopen auf basis einer peptidmatrix

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4-T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Hepatitis B. Als vielseitige Zellpopulation wurden CD4-T-Zellen basierend auf den zytokinen, die sie sezernierten, als unterschiedliche funktionelle Untergruppen klassifiziert: zum Beispiel IFN-γ für CD4 T-Helfer-1-Zellen, IL-4 und IL-13 für CD4-T-Helfer-2-Zellen, IL-21 für CD4-T-Follikel-Helferzellen und IL-17 für CD4-T-Helfer 17-Zellen. Die Analyse von Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD4-T-Zellen auf der Grundlage der Zytokinsekretion nach HBV-abgeleiteter Peptidstimulation könnte nicht nur Aufschluss über das Ausmaß der HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktion geben, sondern auch über die funktionellen Untergruppen von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen. Neuartige Ansätze wie Transkriptomik und Metabolomik-Analyse könnten detailliertere funktionelle Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zellen liefern. Diese Ansätze erfordern in der Regel die Isolierung lebensfähiger HBV-spezifischer CD4-T-Zellen auf der Grundlage von Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex-II-Multimeren, während derzeit die Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope begrenzt sind. Basierend auf einer HBV-abgeleiteten Peptidmatrix wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellproben von chronischen HBV-Infektionspatienten zu identifizieren.

Die Häufigkeit der Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen wird als Summe von Einzelproduzenten und Doppelproduzenten berechnet. Wie in Abbildung 1gezeigt, betragen die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Hintergrundkontrolle (DMSO) 0,154% bzw. 0,013%. Die Häufigkeit der TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit der IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen, die für den Peptidpool Core11 spezifisch sind, betragen 0,2...

Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.

Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

Bei einer chronischen HBV-Infektion spielen CD4-T-Zellen eine wichtige Rolle sowohl bei der viralen Clearance als auch bei den Rückkehrern. Diese Methode ermöglicht es uns, HBV-spezifische CD4-T-Zellantworten zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zellepitope gleichzeitig zu identifizieren. Demonstriert wird das Verfahren von Jianmei Xiao, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter.Und Xing Wan, ein Techniker aus Bilao. Um zu beginnen, isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMCs aus Blut, indem Sie die Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation bei 800 mal G für 20 Minuten verwenden. Dann sammeln Sie die Granulozyten zwischen der und der roten Blutkörperchenschicht mit einer Pasteurpipette.Die aufgetaute Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, einen Milliliter der vorgewärmten Benzonase RPMI 1640 hinzufügen, fallenweise, dann langsam weitere sechs Milliliter hinzufügen. Spülen Sie die Kryo-Durchstechflasche mit zwei Millilitern Benzonase RPMI 1640 aus, um die verbleibenden Zellen zu entnehmen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet durch Klopfen des Rohres. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter warmer Bensenase NACE RPMI 1640. Mischen Sie die Zellen vorsichtig und filtern Sie sie durch ein 70 Mikrometer großes Zellsieb, wenn Zellklumpen sichtbar sind.Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Suspendieren Sie die PBMCs und das komplette Kulturmedium erneut, das 10 Einheiten pro Milliliter IL2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL7 enthält. Stellen Sie die Zelldichte auf 1,5 x 10 bis zu den 6 Zellen pro Milliliter ein.Dann platten die Zellen in 96-Well flachen Bodenplatten mit einer Dichte von 3x10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung. Fügen Sie hepatitis-B-Virus oder HBV-abgeleitete Peptidpools zu jedem Brunnen hinzu. Für die Hintergrund- und Positivkontrollbrunnen fügen Sie die gleiche Menge Lösungsmittel hinzu.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ergänzen Sie das Kulturmedium am dritten Tag mit 50 Einheiten pro Milliliter IL2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL7. Ersetzen Sie am siebten Tag die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium, das Vier Mikrogramm pro Milliliter Peptide, 100 Einheiten pro Milliliter IL2 und 20 Nanogramm pro Milliliter IL7 enthält.Am Tag 10 pipetieren Sie die Zellen in jedem Bohrpunkt sieben bis neun Mal vorsichtig, um Zellcluster zu disaggregieren. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen und übertragen Sie 2x10 auf die fünften Zellen in jede Vertiefung einer runden 96-Well-Bodenplatte für die HPV-spezifische CD4-T-Zellantwortanalyse. Für die Restzellen in der flachen 96-Well-Bodenplatte stellen Sie das Volumen des Kulturmediums auf 100 Mikroliter ein, indem Sie überschüssiges Medium verwerfen.Ergänzen Sie dann die Kultur mit 100 Mikrolitern frischem, vollständigem Kulturmedium, das Folgendes enthält:vier Mikrogramm pro Milliliter Peptide, 100 Einheiten pro Milliliter IL2 und 20 Nanogramm pro Milliliter IL7. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zur Epitopidentifizierung am Tag 12 fort. Waschen Sie die Zellen in der runden 96-Well-Bodenplatte, indem Sie 200 Mikroliter RPMI 1640 hinzufügen, die Platte drei Minuten lang bei 550 mal G zentrifugieren und den Überstand entsorgen.Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit vollständigem Kulturmedium für die letzte Wäsche. Fügen Sie für jede Zellbohrung, die mit einem spezifischen Peptidpool stimuliert wird, 200 Mikroliter vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit demselben Peptidpool ergänzt wird. Fügen Sie für die Hintergrundsteuerungsbohrung ein vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit einem Mikroliter pro Milliliter DMSO ergänzt wird.Fügen Sie für den Positive Control Well ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit einem Mikroliter pro Milliliter DMSO, 150 Nanogramm pro Milliliter PMA und einem Mikromol pro Liter Ionomycin ergänzt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Nach einer Stunde Inkubation 1,37 Mikrogramm pro Milliliter Monensin in die Kultur geben.Nachdem die sechsstündige Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 550 mal G. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 Mikrolitern DPPs, wie zuvor gezeigt. Färbung für Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 und einen Lebensfähigkeitsmarker.Nachdem Sie die Zellen mit dem Vibrator aufgehängt haben, kühlen Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nachdem Sie die Platte einmal mit 200 Mikrolitern DPBS gewaschen haben, fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen, färben Sie sie für intrazelluläre Zytokine, TNF Alpha und Interferon-gamma ein und kühlen Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 45 Minuten. Waschen Sie die Zellen noch einmal und suspendieren Sie sie in 150 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer erneut.Erfassen Sie dann die Durchflusszytometriedaten mit einem Durchflusszytometer. Pflegen Sie allergene B-lymphoblastoide Zelllinien oder BLCLs in einem T-75-Kolben. Zählen Sie am 12. Tag der PBMC-Erweiterung die Anzahl der lebensfähigen BLCLs und übertragen Sie sie auf 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 mal G für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet und das komplette Kulturmedium erneut. Dann aliquotieren Sie die BLCLs zu einer runden 96-Well-Bodenplatte bei 4x10 zur vierten Zellen pro Vertiefung und 80 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums.Fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter eines einzelnen Peptids hinzu und legen Sie zwei Hintergrundkontrollen fest. Peptidpulsing mit HLADR-Blockierung und DMSO-Pulsierung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden.Fügen Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern RPMI 1640, um ungestoßendes Peptid und Mitomycin C zu entfernen, und suspendieren Sie die Zellen dann in 120 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums mit einem Vibrator. Übertragen Sie am 12. Tag der PBMC-Erweiterung die PBMCs auf eine runde 96-Well-Bodenplatte.Zentrifugieren Sie die Zellen in der Platte, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sie zweimal mit 200 Mikrolitern RPMI 1640, wie zuvor gezeigt. Suspendieren Sie die PBMCs in jeder Vertiefung mit 210 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums erneut. Für die PBMC-Wells, die für die Epitopidentifikation ausgewählt wurden, aliquotieren Sie 70 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie sich mit peptidgepulsten BLCLs in drei Wells, einschließlich zwei Hintergrundkontrollen.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Nach einer Stunde Inkubation 1,37 Mikrogramm pro Milliliter Monensin in die Kultur geben und das endende Volumen in jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter mit vollständigem Kulturmedium bringen. In diesem repräsentativen Beispiel sind die TNF Alpha und Interferon-gamma sezernierenden CD4 T-Zellantworten für den Peptidpool Core11 niedriger als das Zweifache der Hintergrundwerte und werden daher als negativ angesehen.In der Zwischenzeit sind die Antworten für den Peptidpool Core09 höher als das Zweifache des Hintergrunds und gelten als positiv. Der graue Hintergrund zeigt Wells mit einer positiven CD4-T-Zellantwort und Kandidatenpeptide für die Epitopidentifikation sind rot angezeigt, Core01 hat die höchste Ansprechrate, sowohl nach TNF Alpha- als auch nach Interferon-gamma-sezernierenden CD4T-Zellen in Säulenpeptidpools. Die Peptide C1 bis 15, C31 bis 45, C61 bis 75 und C91 bis 105 in diesem Peptidpool werden als Kandidatenpeptide festgelegt, da die Reihe der Peptidpools, die diese Peptide enthalten, ebenfalls positive Ergebnisse zeigt.PBMCs, die mit den Peptidpools Core07, 08, 09 und 10 erweitert wurden, werden zur Epitopidentifizierung dieser Peptide verwendet. In ähnlicher Weise hat Core09 die höchste Ansprechrate in Reihenpeptidpools. Alle Peptide in diesem Pool sind als Kandidatenpeptide gesetzt und PBMCs mit Peptidpools erweitert:Core01, 02, 03, 04, 05 und 06 werden zur Epitopidentifikation dieser Peptide verwendet.Für peptidpool Core08 expandierte PBMCs nach Stimulation mit Peptid C31 auf 45 gepulste BLCLs, die Frequenzen von TNF Alpha und Interferon-gamma sezernierenden CD4 T-Zellen sind zweimal höher als Hintergrundkontrollen. Somit ist das Peptid C31 bis 45 ein verifiziertes HLADR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop. Es war dort, zusätzliche erweiterte PBMCs, die nach der Epitopidentifikation übrig blieben.Die Feinmarkierung der identifizierten Epitope kann mit einem Panel verkürzter Peptide durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von...

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Das Video zeigt einen Assay, bei dem von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete CD8+ T-Zellen verwendet werden, um die Replikation des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Mäusen zu hemmen. Diese T-Zellen, die mit HBV-spezifischen Rezeptoren versehen sind, werden in transgene Mäuse übertragen. Replikationskompetente HBV-Genom-Plasmide werden dann direkt in die Leber injiziert und ermöglichen so die Aufnahme viraler DNA. Sobald virale Antigene exprimiert und von hybriden...

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Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

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Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik

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Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix (Video) | JoVE Journal

Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix

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