Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bindung kurzer Peptide an humane MHC-Klasse-II-Immunitätsproteine mithilfe eines Hochdurchsatz-3-84-Well-Platten-Assays zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Lösungsphasen-Kompetitionsbindungsassays mit den betreffenden Peptiden durchgeführt werden. Im zweiten Schritt werden die im Gleichgewicht befindlichen Peptid-MHC-Klasse-II-Komplexe mittels eines auf Hochbindungs-ELISA-Platten immobilisierten Anti-MHC-Klasse-II-Antikörpers erfasst.

Anschließend werden die gebundenen Komplexe mit mit Opium markiertem Streptavidin inkubiert, wobei das nicht gebundene Streptavidin abgewaschen wird, und das gebundene Opium aktiviert wird. Abschließend kann mithilfe der zeitaufgelösten Fluorimetrie die Menge des gebundenen MHC-Klasse-II-Kontrollpeptids quantifiziert werden. Diese Methode kann vorläufige Erkenntnisse über das Immunogenitätspotential von Zielproteinen liefern.

Es ist besonders nützlich zur Validierung der Ergebnisse von In-silico-Prädiktoren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 25 µL frisch verdünnte L 2 43 Antikörperlösung in jedes Loch einer 3 84-Loch-High-Binding-weißen ELIZA-Platte geben, verschließen die Platte mit einem Polyesterfilm und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie dann mit einem 10 mmolaren Stammlösungssatz jedes Testpräparats.

Peptid und DMSO werden verwendet, um die folgende Verdünnungsreihe in Citratphosphatpuffer unter Verwendung von drei 84-well-Polypropylenplatten herzustellen. Beachten Sie, dass eine vollständige 84-well-Polypropylenplatte drei separate EIA-Platten erfordert, wie veranschaulicht. Verdünnen Sie anschließend die ausgewählten MHC-Klasse-II-Stammlösungen auf eine Konzentration von 101 Nanomolar in Reaktionspuffer unter Verwendung eines 15-Milliliter-Konischen Rohrs.

Anschließend verdünnen Sie das Kontrollpeptid von 20 µM im Verhältnis 1:100 in der frisch hergestellten MHC-II-Hauptmischung und geben 21,5 µL der MHC-II-Hauptmischung mit Kontrollpeptid in das Positivkontroll-Loch der 384-Loch-Polypropylenplatte. Fügen Sie die MHC-II-Hauptmischung, die das Kontrollpeptid enthält, zu jeder der Testpeptidverdünnungen im Verhältnis 1:1 hinzu, um gleichzeitig die Bindungsreaktion herzustellen. Versiegeln Sie die Bindungsreaktion abschließend mit einer Polyesterfolie und inkubieren Sie die Platte 12 bis 24 Stunden in einem Inkubator ohne CO₂-Regelung bei 37 °C, ohne zu schütteln.

Am nächsten Tag verdünnen Sie die Bindungsreaktionsansätze in den Vertiefungen der 384-Loch-Platte im Verhältnis 1:1 mit Neutralisierungspuffer. Anschließend waschen Sie die ELISA-Platte dreimal mit jeweils 60 Mikrolitern PBS mit 0,05 % Tween 20 pro Vertiefung. Danach übertragen Sie je 25 Mikroliter jeder neutralisierten Bindungsreaktionslösung aus der 384-Loch-Platte im Dreifachansatz auf die mit Antikörper beschichtete 384-Loch-Platte.

Decken Sie die ELISA-Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem die Inkubation erfolgt ist. Waschen Sie die ELISA-Platte dreimal, wie gerade gezeigt, und geben Sie anschließend 25 Mikroliter frisch verdünntes Streptavidin-OPD zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte, die mit einem Polyesterfilm bedeckt ist, eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Während der Inkubation 10 Milliliter Enhancementslösung pro Platte nach einer Stunde ebenfalls im Dunkeln auf Raumtemperatur bringen, die ELIZA-Platte wie gezeigt waschen und dann 25 Mikroliter Enhancementslösung in jede Vertiefung geben. Die Platte abgedeckt mit Polyesterfolie 10 bis 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Abschließend die Fluoreszenz mit einem zeitauflösenden Fluoreszenzplattenreader mit Opium-Einstellungen messen. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine reife Peptidsequenz von Enterobacter Cloe P nine nine Beta-Lactamase auf mögliche Peptid-Binder an das MHC-Typ-II-Allel analysiert.

DRB 15:01:01-spezifische Peptide wurden identifiziert, wobei eine obligatorische P1-Ankerstelle an Position 1 für die Bindung an MHC-Klasse-II bei einer Schwelle von 5 % erforderlich ist. Peptide mit einem Score von größer oder gleich 2,6 gelten als wahrscheinliche Binder. Daher werden bei der 5 %-Schwelle lediglich die 11 besten Peptide als bindungsfähig an MHC-Klasse-II DRB 15:01:01 vorhergesagt.

Ein repräsentatives Panel vorhergesagter Epitope wurde für die Analyse in diesem MHC-Klasse-II-Bindungsassay ausgewählt. Beta-Lactamase-Peptidfragmente dieser 15 Reste wurden chemisch synthetisiert, sodass mutmaßliche nonamere MHC-Klasse-II-Epitope in ihre synthetischen Proteinfragmente eingebettet waren. Die Fähigkeit dieser synthetischen Peptide, mit einem biotinylierten Kontrollpeptid des myelinschen Basisproteins B um die Bindung an MHC-Klasse-II-DRB1*15:01 zu konkurrieren, wurde anschließend wie zuvor gezeigt analysiert.

Hier sind die Wettbewerbsbindungscurven für die synthetischen Peptide dargestellt. Die IC50-Werte wurden durch Anpassung der logarithmisch transformierten Daten unter Verwendung der nichtlinearen Anpassungsfunktion für eine Bindungsstelle im Wettbewerb von Prism berechnet. Wie in der Tabelle und im Diagramm gezeigt, gruppierten sich die Peptide natürlicherweise in drei Gruppen: starke Binder mit einem IC50 unter einem Mikromolar, moderate Binder mit einem IC50 größer oder gleich einem Mikromolar, jedoch kleiner als 100 Mikromolar, und schwache Binder mit einem IC50 größer oder gleich 100 Mikromolar nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher in den Bereichen molekulare Immunologie und biotherapeutisches Design, die entscheidenden molekularen Erkennungsvorgänge, die menschlichen Immunantworten gegen Proteine zugrunde liegen, umfassender zu untersuchen.