Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation

Das übergeordnete Ziel dieser kundenspezifischen Array-Methode zum Nachweis von Alloantikörpern ist die Abgrenzung von humanen Leukozytenantigenen oder HLA-Epitopen bei Organtransplantationen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Organtransplantation über die spezifischen Immunepitope zu beantworten, die an der Abstoßung von Transplantaten beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie vollständig anpassbar ist und die Integration personalisierter Antigen-Sets ermöglicht, die die HLA-Sequenzen der einzelnen Organspender widerspiegeln können.

Die Technik hat das Potenzial, spezifische HLA-Epitope für Alloantikörper nachzuweisen. Um Sequenzen aus der Datenbank des International Immunogenetics Project für humane Leukozyten-Antigene abzurufen, öffnen Sie auf der Seite "Mehrdeutige Allelkombinationen" das Allel-Abfrageformular der Datenbank und geben Sie den Namen des ersten Allels des Probanden in das Suchfeld ein. Klicken Sie auf Jetzt nach Allelen suchen und suchen Sie den passenden Allelnamen, der auf dem Bildschirm angezeigt wird.

Klicken Sie auf Allel, kopieren Sie die Proteinsequenz und fügen Sie sie in ein Textdokument unter einer Kopfzeile mit dem Allelnamen ein, um den Allelnamen in einem FASTA-Format nacheinander anzuordnen. Wenn alle Sequenzen identifiziert wurden, kopieren Sie die Sequenzen aus dem FASTA-Format und fügen Sie sie in das Feld Geben Sie Ihre Eingabesequenzen auf der Cluster Omega-Website ein, und klicken Sie auf Job mit den Standardparametereinstellungen senden. Klicken Sie dann auf Senden.

Eine Ausrichtung der Sequenzen wird angezeigt. Um die spenderspezifischen Diskrepanzen zu markieren, kopieren Sie den Ausrichtungstext und fügen Sie ihn in ein neues Textdokument ein, und verwenden Sie eine charakteristische Schriftfarbe, um jeden nicht übereinstimmenden spenderspezifischen Rest innerhalb der ausgerichteten Sequenzen zu markieren, die eindeutig zum Spender gehören. Unterstreichen Sie alle Buchstaben in den Donorsequenzen, die sich um 14 Reste nach oben und stromabwärts der markierten donorspezifischen Fehlpaarungen erstrecken, und verwenden Sie die unterstrichenen Sequenzen als Vorlagen, um sequenziell kurze 15-Aminosäure-Sequenzen in einer Serie abzuleiten, die sich zwischen zwei unmittelbar benachbarten Sequenzen in der Serie um vier Reste überlappen.

Kopieren Sie diese 15 Aminosäuresequenzen und fügen Sie sie in eine Tabelle in einem Spaltenformat ein, begleitet von Notationsspalten, die die entsprechenden Namen der Spenderallele enthalten. Um ein benutzerdefiniertes Array-Layout zu entwerfen, generieren Sie eine Tabelle mit Peptidsequenzen mit entsprechenden Allelaufrufen mit 20 Zeilen und 30 Spalten. Geben Sie dann die Sequenzen in jede der Array-Zellen ein und verwenden Sie den Spot-Synthesizer, um eine automatisierte Peptid-Array-Synthese durchzuführen.

Beim Design eines Arrays ist es wichtig, die HLA-Sequenzen einzelner Spender als Vorlage für die Ableitung des Antigensets zu verwenden. Wenn die Arrays synthetisiert wurden, blockieren Sie die Membranen mit 20 Millilitern 5%fettfreier Milch, gelöst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1%tween 20 oder TBST für die entsprechende Inkubationszeit unter Schaukeln. Waschen Sie die Membran anschließend dreimal mit 20 Millilitern frischem TBST für fünf Minuten pro Waschgang, gefolgt von einer Inkubation mit 20 Mikrolitern Rohrezeptorserum in 2,5 % Milch in TBST für zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Membran am Ende der Inkubation dreimal für 10 Minuten pro Waschgang und inkubieren Sie die Membranen zwei Stunden lang mit einem Sekundärantikörper aus Ziegen-Anti-Human-Meerrettichperoxidase-konjugiertem IgG. Entfernen Sie den ungebundenen Sekundärantikörper mit drei 10-minütigen Wäschen in TBST und entwickeln Sie die Membranen in fünf Millilitern frisch zubereiteter Luminollösung plus fünf Milliliter Peroxidlösung. Nach einer Minute visualisieren Sie die verstärkten Chemilumineszenzsignale auf einem geeigneten Imager.

Nachdem Sie die entwickelten Bilder gespeichert haben, inkubieren Sie die Membranen mit 20 Millilitern handelsüblichem Stripping-Puffer bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen in TBST. Blockieren Sie dann die Membranen, sondieren Sie sie erneut und visualisieren Sie sie, wie gerade mit einer Serumprobe desselben Patienten gezeigt, die zu einem anderen Zeitpunkt entnommen wurde. Um die positiven Antigenpeptide manuell zu annotieren, lokalisieren Sie die Spots mit positiven Antikörpersignalen in den gespeicherten entwickelten Bilddateien und bestimmen Sie jede ihrer Gitterpositionen.

Rufen Sie dann die Peptidsequenzen aus dem Master-Arbeitsblatt ab, um potenziell gemeinsam genutzte Epitopsequenzen anhand ihrer überlappenden Segmente reaktiver Peptide zu identifizieren. Um Antigen-Epitope strukturell zu modellieren, erhalten Sie Prototyp-HLA-Kristallstrukturen aus der Proteindatenbank und stellen Sie den Prototyp der HLA-Struktur in Pymol dar. Markieren Sie die reaktiven Peptidsequenzen, um die entdeckten Anti-Donor-Epitope auf die 3D-Strukturen des HLA-Prototyps abzubilden.

Klicken Sie dann auf Anzeige und Hintergrund und wählen Sie Weiß aus, um die Daten als PNG-Datei zu speichern. Nach der Sequenzierung mehrerer Alignments der Allele dieses repräsentativen Spenderpatienten, wie gerade gezeigt, wurde für jedes der Allele eine Alignment-Datei erstellt. Die Template-Sequenzen des Donors, die lang genug waren, um alle nicht übereinstimmenden Reste abzudecken, wurden dann identifiziert und unterstrichen, und es wurden drei Serien von 15-mer-Peptiden für das erste Allel abgeleitet.

Nachdem alle Allele des Spenders analysiert worden waren, wurden insgesamt 202 Peptide in ein Array geladen, um das Serum des Spenders nach der Transplantation spezifisch zu untersuchen. Der Vergleich der Ergebnisse mit denen, die aus einer anschließenden erneuten Untersuchung des Serums des Spenders vor der Transplantation gewonnen wurden, zeigte, dass die Antikörpersignale, die mit der Probe nach der Transplantation verbunden waren, von denen mehrere spenderspezifische Rückstände, die vom Empfänger nicht übereinstimmten, an der Auslösung der Antikörperreaktivität beteiligt zu sein schienen. Als die Antikörper-reaktiven Epitope auf HLA-DQA1 und DQB1 auf eine co-kristalline Heterodimerstruktur modelliert wurden, wurde ein prominentes Segment der Struktur, der als Beta-Eins-Strang bekannt ist, als Hotspot identifiziert, der bei den Transplantatprobanden in einer repräsentativen Kohorte von fünf Fällen eine viel höhere Wahrscheinlichkeit hatte, von Alloantikörpern angegriffen zu werden.

Einmal gemeistert, kann die Technik in sieben bis acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transplantatabstoßung, um den personalisierten Nachweis von spenderspezifischen Alloantikörpern zu erforschen.