Name: Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden. Diese Methode verbessert Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für die gastrointestinale Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>15 mL Corning Röhrchen</td><td>Falke</td><td>21008-918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>30% Saccharose</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hergestellt in PBS.</td></tr><tr><td>5% Normales Eselserum</td><td>Jackson ImmunForschungslabor</td><td>017-000-121</td><td>N/A</td></tr><tr><td>50 mL Corning Röhrchen</td><td>Falke</td><td>21008-951</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1110501</td><td>Lösung zur Zellablösung; aliquotieren Sie 5 mL Accutase in 10 ml-Röhrchen mit insgesamt 20 Röhrchen und lagern Sie es bei -20 & deg; C für bis zu 6 Monate. Bei 4 Grad platzieren; C über Nacht vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Zellführungssysteme</td><td>GFH6-100x10</td><td>Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA). Aliquot 38 &Mikro; L von Activin A in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei -80 ° C lagern; C (Röhren verfallen 12 Monate nach dem Datum des Erhalts).</td></tr><tr><td>Activin Tag 1 mittel (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basismedium Tag 1: 500 ml RPMI 1640 und 500 ml NEAA. Bei der Zubereitung von Activin Day 1 Medium fügen Sie 13 ml Basic Day 1 Medium, 13 & micro; l von Activin A (100 &micro; g/mL) und 2 &micro; l BMP4 (100 &micro; g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Activin Tag 2 mittel (RPMI 1640, 0,2 % FBS vol/vol)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070,03 T</td><td>Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basismedium für Tag 2: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA und 1 ml 0,2% Serum. Bei der Zubereitung von Activin Day 2 Medium fügen Sie 12,5 ml Basic Day 2 Medium und 12,5 & micro; L von Activin A (100 & Mikro; g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Activin Tag 3 mittel (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070,03 T</td><td>Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basic Tag 3 Medium: 500 ml RPMI 1640, 500 mL NEAA und 10 ml 2% Serum. Bei der Zubereitung von Activin Day 3 Medium fügen Sie 12,5 ml Basic Day 3 und 12,5 & micro hinzu. L von Activin A (100 & Mikro; g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr. A11055</td><td>1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr. A21206</td><td>1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Esel Anti-Maus</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr. A10036</td><td>1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Esel Anti-Maus</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr. A31571</td><td>1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Grundform</td><td>Fischer</td><td>22-363-552</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Basic Darm Medium (Advanced DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Bei der Zubereitung von Basic Darmmedium fügen Sie 500 ml DMEM, 500 ml N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml B27 (Gibco), 500 ml L-Glutamin hinzu, um 2 mM L-Glutamin (Corning A2916801), 5 ml 100 μl/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122) und 7,5 ml L&nbsp; 1 M HEPES, um 15 mM HEPES zu erhalten. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Biorad CFX96 Touch Echtzeit-PCR-Nachweissystem</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td>Es können auch andere qRT-PCR-Systeme verwendet werden.</td></tr><tr><td>Lösung zur Zellrückgewinnung</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>ECM-schädigende Lösung</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>4000410</td><td>Rekonstituieren Sie durch Zugabe von 2,15 mL DMSO bei 10 mM. Vorbereiten 50 & Mikro; L aliquotiert und bei -20°C lagern. Pulver bei 4 Grad lagern; C, vor Licht geschützt.</td></tr><tr><td>STRG HIO Musterung mittel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Grundlegendes Darmmedium und 100 ng/mL EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. D9542</td><td>1:100 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)</td></tr><tr><td>DE Monolayer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Die Monoschicht wurde in den vorangegangenen Schritten (Abschnitt 4.4) erzeugt.</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td>Resuspendieren Sie lyophilisiertes Pulver in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml. Filtern Sie die Lösung für die Sterilisation durch Vakuumieren mit einem Millipore-Filtersterilisationsröhrchen. Machen Sie 10 ml-Aliquots (1 mg/ml) und lagern Sie sie bei -20 μg; C für bis zu 6 Monate. Bei 4 Grad platzieren; C über Nacht vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermo Scientific</td><td>Artikel-Nr.: 236-EG-01M</td><td>Bei der Herstellung von 100 ng/ml EGF-Rekonstitution von 500 & micro; g/ml in sterilem PBS. Fügen Sie als nächstes 2 ml steriles PBS zu 1 mg EGF hinzu und stellen Sie 500 & Mikro her. g/mL EGF-Lösung. Aliquot 100 &Mikro; L EGF in 20 Röhrchen.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 6 cm Petrischalen mit durchsichtigem Deckel</td><td>Fischer</td><td>FB0875713A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Zellheber</td><td>Fischer</td><td>08-100-240</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Klarglasfläschchen der Klasse B mit Gewinde und angebrachten Verschlüssen</td><td>Fischer</td><td>03-338B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Einweg-Pasteur-Pipette aus Borosilikatglas</td><td>Fischer</td><td>Artikel-Nr.: 13-678-2D0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fluoromount G Objektträger Einbettmedium</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Gibco advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12-491-023</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin von Ziegen</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>Nr. AF648</td><td>1:400 Verdünnung (Primärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Anti-SOX17-Ziege</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>Nr. AF1924</td><td>1:500 Verdünnung (Primärer Antikörper)</td></tr><tr><td>HCOs Strukturierungsmittel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Grundisches Darmmedium, 100 ng/mL EGF und 100 ng/mL BMP2. Bei der Zubereitung von BMP2 1 ml steriles 4 mM HCl 0,1 % BSA in BMP2-Fläschchen (100 & Mikro; g). Aliquot 25 &micro; L der BMP4-Lösung in 4 Röhrchen. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Humane pluripotente Stammzellen (hPSC)</td><td>Einrichtung für pluripotente Stammzellen</td><td>N/A</td><td>Die Zellen wurden in einer mit Matrigel beschichteten 24-Well-Platte (Thermo Scientific 73520-906) ausgesät.</td></tr><tr><td>Eiskalte 4%ige Paraformaldehyd-Lösung (PFA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Der pH-Wert muss 7,4 betragen.</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophober Barrierestift</td><td>Vector Laboratorien</td><td>101098-065</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs)</td><td>Einrichtung für pluripotente Stammzellen (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)</td><td>N/A</td><td>Andere hESC- oder iPSC-Linien können verwendet werden, aber das Protokoll muss für jede Zelllinie optimiert werden.</td></tr><tr><td>Leica Mikrotom</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran-Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualifizierte Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Bereiten Sie 4 x Matrigel-Aliquots zu, was einem Volumen entspricht, das ausreicht, um genügend verdünntes Matrigel für 4 x 6-Well-Gerichte herzustellen.</td></tr><tr><td>Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 & Mikro; M CHIR99021 und 500 ng/mL FGF4. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>Sphäroide im mittleren Hinterdarm</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Maus Anti-CDX2</td><td>BioGenex</td><td>MU392-UC</td><td>1:300 Verdünnung (Primärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Maus Anti-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>mTeSR1 vollständiges Wachstumsmedium</td><td>Technologien für Stammzellen</td><td>85870</td><td>Geben Sie 100 ml mTeSR-Supplement (85870) in ein 400-ml-mTeSR-Medium (85870) und aliquotieren Sie es in 50-ml-Röhrchen, wobei eine Kontamination vermieden wird. Bei 4° lagern; C bis zum Gebrauch.</td></tr><tr><td>Murray's Clear-Lösung (auch bekannt als BABB)</td><td>Murrays</td><td>N/A</td><td>1:2 Benzylbenzoat und Benzylalkohol.</td></tr><tr><td>NOG HIO Musterung mittel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Grundlegendes Darmmedium, 100 ng/mL EGF und 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 & micro; g NOGGIN in 250 & micro; l steriles PBS mit 0,1 % BSA).</td></tr><tr><td>NukleoSpin-RNA</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Andere RNA-Isolationskits können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale mit 24 Vertiefungen (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 24 Vertiefungen, beschichtet mit Matrigel</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 6-Wells (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 6-Wells, beschichtet mit&nbsp; Matrigel.</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Outgrowth-Medium für HIOs, CTRL-HIOs und HCOs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Basis-Darmmedium und 100 ng/mL EGF (Endkonzentration)</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung, 0,5 % Triton X (PBS-T)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zündkapseln</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)</td><td>N/A</td><td>Die Primer sind in Tabelle 2 des Protokolls aufgeführt.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-CDX2</td><td>Cell-Marke</td><td>EPR22764Y</td><td>1:100 Verdünnung (Primärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-SATB2</td><td>Cell-Marke</td><td>EP281</td><td>1:100 Verdünnung (Primärer Antikörper)</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes BMP-4-Protein</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>Artikel-Nr.: 314-BP-010</td><td>Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem 4 mM HCl mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie 4,17 mL HCl-Lösung zu 45,83 mL molekularem Wasser hinzu, insgesamt 50 mL 1 M HCl. Fügen Sie dann 200 & Mikro hinzu; L von 1 M HCl bis 49,8 mL Wasser in molekularer Qualität, insgesamt 50 mL von 4 mM HCl. Geben Sie anschließend 0,05 g BSA zu 50 mL 4 mM HCl und filtrieren Sie, um es steril zu machen. Aliquot steril 4 mM HCl 0,1 % BSA auf 33 Mikrozentrifugenröhrchen aufsummieren und bei -20 μC lagern. 100 μC hinzufügen l steriler 4 mM HCl 0,1 % BSA auf die BMP4-Fläschchen (10 & Mikro; g) um BMP4-Lösung bei 100 & Mikro herzustellen; g/ml.</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes FGF-4-Protein</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>235-F4-01M</td><td>Rekonstituieren bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin. Fügen Sie 0,05 g BSA in 50 ml PBS hinzu, um 0,1 % BSA zu erhalten. Filter 0.22 &Mikro; M BSA zur Sterilisation der BSA. Aliquot 10 mL 0,1 % BSA in 5 Röhrchen. Fügen Sie 1 mg FGF-4 in 10 ml steriles 0,1% BSA hinzu. Aliquot 250 &Mikro; L in vorgekühlte 40 Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei -80 °C lagern.</td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Die Endkonzentration beträgt 10 mM (10 mmol/L). In DMSO bei 10 mM resuspendieren und mit Filter sterilisieren. Geben Sie 3 ml steriles PBS in jede Durchstechflasche. Aliqout 100 & micro; L des ROCK-Inhibitors in 30 Röhrchen abfüllen und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA-Synthese-Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-754-250</td><td>N/A</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Verbindung</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

erzeugung, erhaltung und charakterisierung von humanen pluripotenten stammzell-abgeleiteten darm- und dickdarm-organoiden

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Die erfolgreiche Erzeugung von Sphäroiden während der Induktionsphase des Mittel-/Hinterdarms ist ein Hinweis auf eine erfolgreiche Strukturierung. Führen Sie eine IF-Färbung für CDX2 auf schwebenden Sphäroiden und auf der Monoschicht durch, um zu bestätigen, dass die Strukturierung korrekt ist. Obwohl die Färbung im definitiven Endodermstadium (DE) auf die Wirksamkeit der DE-Induktion hinweisen kann, ist die Erzeugung von Sphäroiden ohne effiziente DE-Induktion nicht möglich. Um die Wirksamkeit der DE-Induktion zu teste...

Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Das folgende Protokoll beschreibt die Erzeugung von humanen Darm- und Dickdarm-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, die an der Darmmusterung beteiligt sind, zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, regionsspezifische Organoide zu erzeugen, die isogen sind. Dieses Protokoll könnte einen Einblick in die Faktoren geben, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der Darmmusterbildung regulieren.[Erzähler] Beginnen Sie damit, eine extrazelluläre Matrix oder eine EZM-beschichtete 24-Well-Platte für 30 Minuten in eine Biosicherheitswerkbank zu legen, damit sie Raumtemperatur erreichen kann. Geben Sie mTeSR1 die komplette Lösung zur Ablösung von Mediumzellen und das fortschrittliche DMEM in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad und lassen Sie sie 30 Minuten lang erwärmen. Bereiten Sie das Beschichtungsmedium in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie 13 Milliliter mTeSR1 und 13 Mikroliter 10 millimolare Y-27632 Rho-assoziierte Proteinkinase oder ROCK-Inhibitor hinzufügen. Um Zellen aus der Sechs-Well-Platte zu gewinnen, aspirieren Sie das Medium aus drei bis vier Wells und waschen Sie es einmal mit zwei Millilitern fortschrittlichem DMEM pro Well. Aspirieren Sie das fortschrittliche DMEM und geben Sie einen Milliliter der Zelldissoziationslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte fünf bis sieben Minuten lang in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Dissoziieren Sie alle Zellklumpen, indem Sie vier- bis fünfmal mit einer Fünf-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, um die Zellsuspension vorzubereiten. Geben Sie zwei Milliliter fortschrittliches DMEM in jede Vertiefung. Vier- bis fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Schleudern Sie die Zellen bei 300 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur herunter. Saugen Sie das Medium aus dem Rohr an, ohne das Küvettenpellet anzusaugen. Und fügen Sie sechs Milliliter des vorbereiteten Mediums mTeSR1 plus ROCK-Inhibitor hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann die Suspension auf den Rest des mTeSR1- und ROCK-Inhibitormediums in der 50-Milliliter-Tube. Resuspendieren Sie vier- bis fünfmal kräftig und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Aspirieren Sie die EZM aus der 24-Well-Platte, kurz bevor Sie die Zellen plattieren. Resuspendieren Sie die Zellen erneut, indem Sie zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren und 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die Platte vorsichtig dreimal im Uhrzeigersinn, dreimal gegen den Uhrzeigersinn, dreimal vorwärts und rückwärts und dreimal von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Nach 24 Stunden aspirieren Sie das verbrauchte Medium. Fügen Sie 0,5 Milliliter mTeSR1 pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie erneut 24 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen. Bereiten Sie das vollständige Medium von Activin am ersten Tag vor, indem Sie die Stammlösung von 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A und 100 Mikrogramm pro Milliliter BMP4 in einem konischen Röhrchen in das Medium von Activin für den ersten Tag verdünnen. Erwärmen Sie das Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Perlbad. Aspirieren Sie das mTeSR1-Medium aus der 24-Well-Platte und fügen Sie 0,5 Milliliter Activin Day One Medium pro Well hinzu. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Überprüfen Sie die Zellen nach 24 Stunden. Bereiten Sie das Activin Day Two Complete Medium vor, indem Sie die 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A Stammlösung in einem konischen Röhrchen in Activin Day Two Medium verdünnen und das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad legen. Nehmen Sie die 24-Well-Differenzierungsplatte aus dem Kohlendioxid-Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium. Geben Sie 0,5 Milliliter vorgewärmtes Activin Day Two Medium pro Vertiefung ab und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in den Kohlendioxid-Inkubator. Bereiten Sie das komplette Medium für den dritten Tag vor, indem Sie die 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A-Stammlösung in einem konischen Röhrchen in das Activin-Medium für den dritten Tag verdünnen und das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad legen. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und geben Sie 0,5 Milliliter Activin Tag drei Medium pro Vertiefung ab. Um mit der Differenzierung des definitiven Endoderms in Sphäroide des mittleren Hinterdarms zu beginnen, fügen Sie 25 Milliliter Induktionsmedium des mittleren Hinterdarms mit FGF4 in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und legen Sie es für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad. Um das komplette Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm zuzubereiten, fügen Sie 7,5 Mikroliter CHIR99021 hinzu, nachdem das Medium erwärmt ist. Entfernen Sie das verbrauchte Medium, geben Sie 0,5 Milliliter Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm pro Vertiefung ab und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nachdem am nächsten Tag eine Kondensation der Zellen in der Monoschicht aufgetreten ist, ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch ein frisches Induktionsmedium aus dem mittleren Hinterdarm und stellen Sie die Platte für 24 Stunden zur Inkubation zurück. Um zu vermeiden, dass die schwimmenden Sphäroide beim Wechsel des Mediums verworfen werden, wird das alte Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und eine Minute lang bei 300 g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Sphäroide in 12,5 Millilitern frischem Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm, geben Sie 0,5 Milliliter pro Vertiefung in dieselbe 24-Well-Platte und inkubieren Sie 24 Stunden lang im Inkubator. Am vierten Tag der Induktion des Hinterdarms werden schwimmende Sphäroide aus den Plattenvertiefungen entnommen, indem das Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen abgefüllt und anschließend eine Minute lang bei 300 g zentrifugiert wird. Die Wirksamkeit der definitiven Endoderm-Induktion wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für FOXA2 und SOX17 bewertet. Es wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression des anterioren HOX-Faktors HOXD3 bei Noggin-behandelten humanen Darmorganoiden oder HIOs am höchsten, bei epithelialen Wachstumsfaktor- oder EGF-behandelten HIOs geringer und bei BMP-behandelten humanen Dickdarmorganoiden oder HCOs am niedrigsten ist. Umgekehrt wurde festgestellt, dass die mRNA-Expressionen von HOXA13 und HOXD13 bei HIOs niedrig und bei HCOs hoch sind. Eine Immunfluoreszenzfärbung wurde für SATB2, CDX2 und CDH1 durchgeführt, um festzustellen, ob das HCO-Epithel richtig strukturiert war.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Organoide sind zu wertvollen Werkzeugen für die Modellierung von Krankheiten geworden. Die extrazelluläre Matrix (EZM) steuert das Zellschicksal während der Organoidgenerierung, und die Verwendung eines Systems, das dem nativen Gewebe ähnelt, kann die Modellgenauigkeit verbessern. Diese Studie vergleicht die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen humanen Darmorganoiden in tierischer EZM und xenofreien Hydrogelen.

Vergleichende Studie von Basalmembranmatrizen für die Erhaltung humaner Stammzellen und die Generierung von intestinalen Organoiden

Menschliche Darmorganoide müssen innerviert werden, um die Struktur und Funktion des nativen menschlichen Darms besser rekapitulieren zu können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein enterisches Nervensystem in diese Konstrukte einzubauen.

Innervation menschlicher Darmorganoide

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung von apikal-out-Darmorganoiden aus Standard-Matrix-eingebetteten Organoidkulturen. Es skizziert auch den anschließenden Einbau von EdU in aktiv proliferierende Zellen und die halbautomatische Quantifizierung von EdU-positiven Zellen.

Generierung apikaler Darmorganoide und Bestimmung der Organoid-Proliferationsrate mittels EdU-Markierung

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Lernen Sie die Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden. Diese Methode verbessert Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für die gastrointestinale Forschung.

Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Weitere Videos entdecken