Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Das folgende Protokoll beschreibt die Erzeugung von humanen Darm- und Dickdarm-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, die an der Darmmusterung beteiligt sind, zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, regionsspezifische Organoide zu erzeugen, die isogen sind. Dieses Protokoll könnte einen Einblick in die Faktoren geben, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der Darmmusterbildung regulieren.

[Erzähler] Beginnen Sie damit, eine extrazelluläre Matrix oder eine EZM-beschichtete 24-Well-Platte für 30 Minuten in eine Biosicherheitswerkbank zu legen, damit sie Raumtemperatur erreichen kann. Geben Sie mTeSR1 die komplette Lösung zur Ablösung von Mediumzellen und das fortschrittliche DMEM in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad und lassen Sie sie 30 Minuten lang erwärmen. Bereiten Sie das Beschichtungsmedium in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie 13 Milliliter mTeSR1 und 13 Mikroliter 10 millimolare Y-27632 Rho-assoziierte Proteinkinase oder ROCK-Inhibitor hinzufügen. Um Zellen aus der Sechs-Well-Platte zu gewinnen, aspirieren Sie das Medium aus drei bis vier Wells und waschen Sie es einmal mit zwei Millilitern fortschrittlichem DMEM pro Well. Aspirieren Sie das fortschrittliche DMEM und geben Sie einen Milliliter der Zelldissoziationslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte fünf bis sieben Minuten lang in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Dissoziieren Sie alle Zellklumpen, indem Sie vier- bis fünfmal mit einer Fünf-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, um die Zellsuspension vorzubereiten. Geben Sie zwei Milliliter fortschrittliches DMEM in jede Vertiefung. Vier- bis fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Schleudern Sie die Zellen bei 300 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur herunter. Saugen Sie das Medium aus dem Rohr an, ohne das Küvettenpellet anzusaugen. Und fügen Sie sechs Milliliter des vorbereiteten Mediums mTeSR1 plus ROCK-Inhibitor hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann die Suspension auf den Rest des mTeSR1- und ROCK-Inhibitormediums in der 50-Milliliter-Tube. Resuspendieren Sie vier- bis fünfmal kräftig und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Aspirieren Sie die EZM aus der 24-Well-Platte, kurz bevor Sie die Zellen plattieren. Resuspendieren Sie die Zellen erneut, indem Sie zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren und 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die Platte vorsichtig dreimal im Uhrzeigersinn, dreimal gegen den Uhrzeigersinn, dreimal vorwärts und rückwärts und dreimal von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Nach 24 Stunden aspirieren Sie das verbrauchte Medium. Fügen Sie 0,5 Milliliter mTeSR1 pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie erneut 24 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen. Bereiten Sie das vollständige Medium von Activin am ersten Tag vor, indem Sie die Stammlösung von 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A und 100 Mikrogramm pro Milliliter BMP4 in einem konischen Röhrchen in das Medium von Activin für den ersten Tag verdünnen. Erwärmen Sie das Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Perlbad. Aspirieren Sie das mTeSR1-Medium aus der 24-Well-Platte und fügen Sie 0,5 Milliliter Activin Day One Medium pro Well hinzu. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Überprüfen Sie die Zellen nach 24 Stunden. Bereiten Sie das Activin Day Two Complete Medium vor, indem Sie die 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A Stammlösung in einem konischen Röhrchen in Activin Day Two Medium verdünnen und das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad legen. Nehmen Sie die 24-Well-Differenzierungsplatte aus dem Kohlendioxid-Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium. Geben Sie 0,5 Milliliter vorgewärmtes Activin Day Two Medium pro Vertiefung ab und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in den Kohlendioxid-Inkubator. Bereiten Sie das komplette Medium für den dritten Tag vor, indem Sie die 100 Mikrogramm pro Milliliter Activin A-Stammlösung in einem konischen Röhrchen in das Activin-Medium für den dritten Tag verdünnen und das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad legen. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und geben Sie 0,5 Milliliter Activin Tag drei Medium pro Vertiefung ab. Um mit der Differenzierung des definitiven Endoderms in Sphäroide des mittleren Hinterdarms zu beginnen, fügen Sie 25 Milliliter Induktionsmedium des mittleren Hinterdarms mit FGF4 in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und legen Sie es für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Bead-Bad. Um das komplette Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm zuzubereiten, fügen Sie 7,5 Mikroliter CHIR99021 hinzu, nachdem das Medium erwärmt ist. Entfernen Sie das verbrauchte Medium, geben Sie 0,5 Milliliter Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm pro Vertiefung ab und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nachdem am nächsten Tag eine Kondensation der Zellen in der Monoschicht aufgetreten ist, ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch ein frisches Induktionsmedium aus dem mittleren Hinterdarm und stellen Sie die Platte für 24 Stunden zur Inkubation zurück. Um zu vermeiden, dass die schwimmenden Sphäroide beim Wechsel des Mediums verworfen werden, wird das alte Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und eine Minute lang bei 300 g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Sphäroide in 12,5 Millilitern frischem Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm, geben Sie 0,5 Milliliter pro Vertiefung in dieselbe 24-Well-Platte und inkubieren Sie 24 Stunden lang im Inkubator. Am vierten Tag der Induktion des Hinterdarms werden schwimmende Sphäroide aus den Plattenvertiefungen entnommen, indem das Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen abgefüllt und anschließend eine Minute lang bei 300 g zentrifugiert wird. Die Wirksamkeit der definitiven Endoderm-Induktion wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für FOXA2 und SOX17 bewertet. Es wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression des anterioren HOX-Faktors HOXD3 bei Noggin-behandelten humanen Darmorganoiden oder HIOs am höchsten, bei epithelialen Wachstumsfaktor- oder EGF-behandelten HIOs geringer und bei BMP-behandelten humanen Dickdarmorganoiden oder HCOs am niedrigsten ist. Umgekehrt wurde festgestellt, dass die mRNA-Expressionen von HOXA13 und HOXD13 bei HIOs niedrig und bei HCOs hoch sind. Eine Immunfluoreszenzfärbung wurde für SATB2, CDX2 und CDH1 durchgeführt, um festzustellen, ob das HCO-Epithel richtig strukturiert war.