Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti
10. September 2021
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.
Dieses Protokoll ist eine sehr einfache und effiziente Möglichkeit, Mutanten zu erkennen, die durch die CRISPR/Cas9-Technologie von zahlreichen Individuen erzeugt werden. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie in wenigen Stunden durchgeführt werden kann und dass sie auf eine Vielzahl von Organismen anwendbar ist. Das Primer-Design kann für bestimmte Gene eine Herausforderung darstellen, und es können mehrere Runden des Primer-Designs und der Verifizierung erforderlich sein, um HRMA effizient zu machen.
Um eine Verlaufs-PCR durchzuführen, beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Master-Mixes. Entfernen Sie dann 19 Mikroliter der Mastermischung für die Nicht-Template-Steuerung oder NTC in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie dann die Vorlage dem verbleibenden Master-Mix hinzu.
Aliquot 20 Mikroliter der Probe mischen sich in die 96-Well-Platte. Führen Sie eine PCR nach den Zyklusparametern durch und generieren Sie dann die thermischen Schmelzeprofile unter Verwendung der im Manuskript genannten Parameter. Nachdem Sie das gesamte erforderliche Material gesammelt haben, bereiten Sie eine Mastermischung mit 0,5 Mikrolitern des DNA-Freisetzungsreagenzes und 20 Mikrolitern Verdünnungspuffer pro zu genotypisierendem Individuum vor.
Mit einem Mehrkanalpipet werden 20 Mikroliter der Mischung aliquot in eine PCR-Platte gegeben und die PCR-Platte auf Eis gelassen. Als nächstes legen Sie die betäubten G1-Moskitos in eine Glas-Petrischale, um sie sediert zu halten, und legen Sie acht Wildtyp-Moskitos in die zweite Petrischale. Wischen Sie eine Pinzette mit 70% Ethanol ab und verwenden Sie die desinfizierte Pinzette, um eines der Hinterbeine der Moskitos zu entfernen.
Tauchen Sie dann das Bein in die DNA-Freisetzungsreagenzienlösung. Legen Sie die Mücke in die entsprechende Durchstechflasche und schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Schwamm. Sobald Sie fertig sind, wischen Sie die Pinzette mit 70% Ethanol ab, bevor Sie das Bein von der nächsten Mücke entfernen, bis die 96-Well-Platte fertig ist.
Später versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattenversiegelung und inkubieren Sie die PCR-Platte mit den Beinen bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 98 Grad Celsius für zwei Minuten. Lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur abkühlen. Bereiten Sie für die PCR eine Mastermischung vor, die die bevorzugten Komponenten enthält, und verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 19 Mikroliter der Mastermischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu übertragen.
Nachdem Sie einen Mikroliter der DNA-Freisetzungslösung, die zuvor vorbereitete Mücken-DNA enthält, auf die Platte übertragen haben, versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattenversiegelung. Führen Sie die PCR mit den entsprechenden Zyklusparametern durch, um thermische Schmelzeprofile gemäß den im Manuskript beschriebenen Parametern zu erzeugen, und untersuchen Sie dann die Schmelzeprofile, indem Sie dem Referenzcluster eine Wildtyp-Kontrolle zuweisen. Markieren Sie die verschiedenen Cluster mit den entsprechenden Farben auf der 96-Well-Vorlage.
Wählen Sie als Nächstes die Individuen mit interessanten Kurven aus und entfernen Sie die ausgewählten Individuen aus den Röhren zum hinteren Kreuz. Blut füttern die gemachten Weibchen, gefolgt vom Sammeln von G2As. In der repräsentativen Analyse wird die Sequenzanalyse der ZIP11-Mutante von Aedes aegypti gezeigt.
Das Elektropherogramm von Aedes aegypti ZIP11 heterozygoten Mutanten zeigte die Nukleotidposition an, in der der Indel auftrat. Der Indel wird durch eine Verschiebung von einfachen zu doppelten Peaks dargestellt, da polymorphe Positionen beide Nukleotide gleichzeitig zeigen. Am Ende des Laufs wurde die Anzahl der gelöschten oder eingefügten Basenpaare durch Zählen der einzelnen Peaks berechnet.
Mücken, die Mutationen in den Genen Aedes aegypti ZIP11 und myo-fem enthielten, wurden genotypisiert und mit der hochauflösenden Schmelzanalyse von HRMA sequenziert. Die Fluoreszenzsignale der Proben wurden auf relative Werte von eins bis null normiert. Zusätzlich wurde jede Kurve von der Wildtyp-Referenz subtrahiert und mit der entsprechenden Vergrößerung versehen.
In den repräsentativen Ergebnissen wird eine fehlgeschlagene automatische Clusterzuordnung angezeigt, bei der keine richtige Unterscheidung zwischen den Gruppen vorgenommen wurde. Darüber hinaus wurde jede Probe einzeln analysiert und den richtigen Gruppen zugeordnet, basierend auf der Ähnlichkeit mit Referenzproben von Heterozygoten, Homozygoten und Transheterozygoten. Nach der Durchführung von HRMAs ist die Sequenzierung der DNA der mutierten Individuen notwendig, um die Indels zu analysieren und die anderen Mutationen in der Zielsequenz zu identifizieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von durch CRISPR/Cas9 induzierten Indels und zur Auswahl von Mutantenlinien bei der Mücke Aedes aegypti mittels Hochauflösender Schmelzanalyse beschrieben. Die Methode ist effizient und auf verschiedene Organismen anwendbar, wodurch eine schnelle Detektion von Mutanten ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genetik
- Molekularbiologie
- Entomologie
Hintergrund
- Die CRISPR/Cas9-Technologie wird häufig für die Genomeditierung verwendet.
- Die effiziente Identifizierung von Mutationen ist entscheidend für genetische Untersuchungen.
- Die Hochauflösende Schmelzpunktanalyse (HRMA) bietet ein schnelles Nachweisverfahren.
- Herausforderungen bei der Primerdesign können die Effizienz der HRMA beeinträchtigen.
Zweck der Studie
- Eine Anleitung zur Identifizierung von CRISPR-induzierten Mutationen bereitstellen.
- Die Anwendbarkeit der HRMA bei verschiedenen Organismen demonstrieren.
- Den Prozess der Auswahl von Mutantenlinien vereinfachen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Master-Mix-Lösung für die PCR.
- Verwendung von Nicht-Vorlagen-Kontrollen (NTC) in einer 96-Loch-Platte.
- Gradienten-PCR zur Optimierung der Bedingungen.
- Schmelzanalyse mit hoher Auflösung zum Nachweis von Indels.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Mutanten.
- Die HRMA kann innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden.
- Mehrere Runden des Primer-Designs können zur Erzielung einer hohen Effizienz erforderlich sein.
- Die Methode ist vielseitig auf verschiedene Arten anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll verbessert die Effizienz der Mutantendetektion.
- Es stellt ein wertvolles Werkzeug für genetische Untersuchungen bei Mücken dar.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode für weiterreichende Anwendungen aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle Detektion von CRISPR/Cas9-induzierten Indels ermöglicht eine effiziente Zielvalidierung in der Vektorkontrollforschung und verkürzt die Zeitspanne für funktionelle Genstudien. Die Analyse mittels Hochauflösender Schmelzkurven ermöglicht eine skalierbare Genotypisierung, ohne dass Organismen getötet werden müssen, und erleichtert nachgeschaltete phänotypische Assays sowie genetische Kreuzungen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er eine quantitative Mutationsdetektion anhand minimaler Gewebeproben bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch schnelle Indel-Detektion nach CRISPR-Mutagenese.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem mutante Allele identifiziert werden, ohne Organismen zu opfern, und Proben für Nachfolgeanalysen erhalten bleiben.
- Portfolio-Wirkung: Beschleunigt Target-Validierungsworkflows und ermöglicht eine schnellere Priorisierung von Genzielen in krankheitsrelevanten Systemen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt normalisierte Fluoreszenz-Schmelzkurven, die einen quantitativen Vergleich von Wildtyp- und Mutanten-Genotypen ermöglichen.
- Operativer Wert: Kompatibel mit 96-Loch-Plattenformaten und somit geeignet für die mittelhochdurchsatzfähige Analyse von editierten Individuen.
- Bereitschaft des Assays: Erzeugt unterscheidbare Schmelzprofile für Heterozygoten, Homozygoten und Transheterozygoten, wodurch eine zuverlässige Clusterzuordnung ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Genotypisierung gefolgt von Phänotypisierung oder Blutmahl, wodurch genetische Modifikationen mit funktionellen Ergebnissen in Krankheitsmodellen verknüpft werden können.
- Mechanistische Entwederisikung: Erleichtert die Charakterisierung von Indels durch nachgeschaltete Sequenzierung, um on-target-Effekte zu bestätigen und potenzielle off-target-Modifikationen zu identifizieren.
- Unterstützung präklinischer Modelle: Ermöglicht die Etablierung mutanter Linien in Aedes aegypti, einem zentralen Vektor für Studien zur Arbovirus-Übertragung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der CRISPR-Mutagenese bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und bietet einen Genotypisierungs-Checkpunkt vor der funktionellen Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem schnell Indels identifiziert werden, die die Genfunktion in Zielwegen stören.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch normalisierte Schmelzkurvenanalyse und referenzbasierte Clusterung.
- Analytik: Erzeugt quantitative Verschiebungen der Schmelzprofile, die mit der Indel-Größe korrelieren und einen vergleichenden Analyseansatz über verschiedene Proben hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Modifikation mit der phänotypischen Beurteilung, indem die Verwendung lebender Organismen nach der Genotypisierung erlaubt ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Wiederverwendbar über Organismen und Gene hinweg, wobei die Anpassungsfähigkeit des Primerdesigns eine breite Zielanwendbarkeit unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung, indem direkte Nachweise für die Ergebnisse der Genom-Editierung bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte PCR- und Schmelzanalysenprotokolle mit integrierten Kontrollen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem Zeit und Ressourcen für die Mutantenscreening-Verfahren reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem das Vorhandensein von Mutationen vor Investitionen in phänotypische Assays bestätigt wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Primer-Design und -Optimierung, da bestimmte Gene möglicherweise mehrere Designiterationen für eine effiziente HRMA benötigen.
- Setzt ein Instrumentarium mit präziser Temperaturanstiegsregelung und Fluoreszenzdetektion zur hochauflösenden Schmelzanalyse voraus.
- Benötigt standardisierte Probenvorbereitung unter Verwendung von Bein-Gewebe und DNA-Freisetzungspuffer, um eine konsistente Eingangsqualität sicherzustellen.
- Benötigt Wildtyp-Referenzproben für eine genaue Cluster-Zuordnung und Normalisierung der Schmelzprofile.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer Sequenzierung nach der HRMA, um Indels vollständig zu charakterisieren und zusätzliche Mutationen in der Zielsequenz zu detektieren.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
