Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Mikroinjektionstechniken von Embryonen haben den Weg für die Entwicklung zahlreicher genetischer Instrumente zur Kontrolle von Vektoren geebnet. Obwohl die Protokolle für zahlreiche Insektenarten bereits gut entwickelt sind, ist Culex quinquefasciatus noch relativ wenig erforscht. Dieses Mikroinjektionsprotokoll wurde speziell entwickelt, um die einzigartigen biologischen Eigenschaften von Culex quinquefasciatus zu berücksichtigen, einschließlich der Eizellentnahme, der Trennung der Eiablage und der Verfahren nach der Injektion.

Diese Methode kann wahrscheinlich an jede interessierende Culex-Spezies angepasst werden und kann zur Untersuchung der Genfunktion oder zur Entwicklung genetischer Kontrolltechnologien für Culex-Arten verwendet werden. Beginne damit, die Eier von den Flößen zu trennen. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel auf das Floß drücken und die einzelnen Eier auseinandertoupieren.

Richte die Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, das oben auf einem Objektträger platziert ist, und bemühe dich, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu zeigen. Bereiten Sie die Halogenkohlenwasserstoffmischung vor, indem Sie die Halogenkohlenwasserstoffreagenzien vorsichtig mit Wasser mischen und die Mischung über Nacht bei 25 Grad Celsius inkubieren. Ausgerichtete Eier mit der Halogenkohlenwasserstoff-Ölmischung bedecken.

Um Nadeln für die Mikroinjektionen zu erzeugen, setzen Sie ein Aluminiumsilikat-Kapillarglas in einen Nadelabzieher ein, wobei Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Stellen Sie die Hitze auf 560, die Geschwindigkeit auf 100, die Verzögerung auf 70, den Zug auf 97 und den Druck auf 500 ein. Aktivieren Sie dann den Nadelabzieher.

Berühren Sie die Spitze der gezogenen Nadel etwa 10 Sekunden lang vorsichtig in einem Winkel von 50 Grad auf der rotierenden Diamantschleifplatte, um die Nadelspitze abzuschrägen. Betten Sie gezogene und abgeschrägte Nadeln in Linien aus Modelliermasse in einer Petrischale ein. Bereiten Sie die Injektionsmischung bestehend aus Reagenzien zur Genommodifikation vor und lagern Sie sie auf Eis.

Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um zwei Mikroliter Injektionsmischung in die Injektionsnadel zu füllen. Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist, und platzieren Sie den Objektträger mit den ausgerichteten Eiern auf dem Tisch eines Verbundmikroskops. Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator so aus, dass sie in einem Winkel von 25 bis 35 Grad auf das hintere Ende des Embryos zielt.

Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung in einer Menge von etwa 10 % des Volumens des Embryos. Injizieren Sie jeweils 20 Eizellen, stoppen Sie dann und führen Sie die Embryonenwiederherstellung durch. Entfernen Sie innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig das Halogenkohlenwasserstofföl von den Eiern, indem Sie sie leicht mit einem sauberen Pinsel abbürsten.

Heben Sie die Eier mit dem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse mit doppelt destilliertem Wasser, wobei Sie darauf achten, dass die Eier an der Oberfläche bleiben. Kontrollieren Sie in den nächsten sieben Tagen täglich die Eier auf das Schlüpfen und befolgen Sie die normalen Verfahren zur Larvenaufzucht. Untersuchen Sie die injizierten Mücken mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen.

Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges entscheidend ist. CRISPR-Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen im Pupillenstadium von injizierten Personen bewertet. Somatische Mutationen lagen im Allgemeinen als Mosaik-Phänotypen vor, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen.

Keimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik-G-Null-Individuen und Scoring pro vollständig weißäugigem Nachkommen bestimmt. Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64 bis 82 %, einer somatischen Mutageneserate von 37 bis 57 % und einer Mutageneserate von mehr als 61 %. Durch das Multiplexing von sgRNAs, die auf mehrere Loci im selben Gen abzielen, stiegen die somatischen und Keimbahn-Mutageneseseraten auf bis zu 86 %. Darüber hinaus wurden über viele Generationen hinweg lebensfähige homozygote Stämme der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.

Um die Überlebens- und Mutageneseraten zu optimieren, sollten alle Materialien, einschließlich Halogenkohlenwasserstofföl, Injektionsflüssigkeit und Nadeln, vor dem Versuch von Mikroinjektionen ordnungsgemäß vorbereitet werden. Dies ermöglicht einen schlankeren und fokussierteren Mikroinjektionsprozess.