Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus
24. Mai 2020
Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.
Mikroinjektionstechniken von Embryonen haben den Weg für die Entwicklung zahlreicher genetischer Instrumente zur Kontrolle von Vektoren geebnet. Obwohl die Protokolle für zahlreiche Insektenarten bereits gut entwickelt sind, ist Culex quinquefasciatus noch relativ wenig erforscht. Dieses Mikroinjektionsprotokoll wurde speziell entwickelt, um die einzigartigen biologischen Eigenschaften von Culex quinquefasciatus zu berücksichtigen, einschließlich der Eizellentnahme, der Trennung der Eiablage und der Verfahren nach der Injektion.
Diese Methode kann wahrscheinlich an jede interessierende Culex-Spezies angepasst werden und kann zur Untersuchung der Genfunktion oder zur Entwicklung genetischer Kontrolltechnologien für Culex-Arten verwendet werden. Beginne damit, die Eier von den Flößen zu trennen. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel auf das Floß drücken und die einzelnen Eier auseinandertoupieren.
Richte die Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, das oben auf einem Objektträger platziert ist, und bemühe dich, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu zeigen. Bereiten Sie die Halogenkohlenwasserstoffmischung vor, indem Sie die Halogenkohlenwasserstoffreagenzien vorsichtig mit Wasser mischen und die Mischung über Nacht bei 25 Grad Celsius inkubieren. Ausgerichtete Eier mit der Halogenkohlenwasserstoff-Ölmischung bedecken.
Um Nadeln für die Mikroinjektionen zu erzeugen, setzen Sie ein Aluminiumsilikat-Kapillarglas in einen Nadelabzieher ein, wobei Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Stellen Sie die Hitze auf 560, die Geschwindigkeit auf 100, die Verzögerung auf 70, den Zug auf 97 und den Druck auf 500 ein. Aktivieren Sie dann den Nadelabzieher.
Berühren Sie die Spitze der gezogenen Nadel etwa 10 Sekunden lang vorsichtig in einem Winkel von 50 Grad auf der rotierenden Diamantschleifplatte, um die Nadelspitze abzuschrägen. Betten Sie gezogene und abgeschrägte Nadeln in Linien aus Modelliermasse in einer Petrischale ein. Bereiten Sie die Injektionsmischung bestehend aus Reagenzien zur Genommodifikation vor und lagern Sie sie auf Eis.
Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um zwei Mikroliter Injektionsmischung in die Injektionsnadel zu füllen. Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist, und platzieren Sie den Objektträger mit den ausgerichteten Eiern auf dem Tisch eines Verbundmikroskops. Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator so aus, dass sie in einem Winkel von 25 bis 35 Grad auf das hintere Ende des Embryos zielt.
Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung in einer Menge von etwa 10 % des Volumens des Embryos. Injizieren Sie jeweils 20 Eizellen, stoppen Sie dann und führen Sie die Embryonenwiederherstellung durch. Entfernen Sie innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig das Halogenkohlenwasserstofföl von den Eiern, indem Sie sie leicht mit einem sauberen Pinsel abbürsten.
Heben Sie die Eier mit dem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse mit doppelt destilliertem Wasser, wobei Sie darauf achten, dass die Eier an der Oberfläche bleiben. Kontrollieren Sie in den nächsten sieben Tagen täglich die Eier auf das Schlüpfen und befolgen Sie die normalen Verfahren zur Larvenaufzucht. Untersuchen Sie die injizierten Mücken mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen.
Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges entscheidend ist. CRISPR-Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen im Pupillenstadium von injizierten Personen bewertet. Somatische Mutationen lagen im Allgemeinen als Mosaik-Phänotypen vor, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen.
DieKeimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik-G-Null-Individuen und Scoring pro vollständig weißäugigem Nachkommen bestimmt. Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64 bis 82 %, einer somatischen Mutageneserate von 37 bis 57 % und einer Mutageneserate von mehr als 61 %. Durch das Multiplexing von sgRNAs, die auf mehrere Loci im selben Gen abzielen, stiegen die somatischen und Keimbahn-Mutageneseseraten auf bis zu 86 %. Darüber hinaus wurden über viele Generationen hinweg lebensfähige homozygote Stämme der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.
Um die Überlebens- und Mutageneseraten zu optimieren, sollten alle Materialien, einschließlich Halogenkohlenwasserstofföl, Injektionsflüssigkeit und Nadeln, vor dem Versuch von Mikroinjektionen ordnungsgemäß vorbereitet werden. Dies ermöglicht einen schlankeren und fokussierteren Mikroinjektionsprozess.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionstechniken für Culex quinquefasciatus-Embryonen, optimiert für CRISPR/Cas9-Genbearbeitung. Es ermöglicht die effiziente Erzeugung von vererbbaren Keimbahnmutationen für genetische Forschung und Vektorkontrolltechnologien.
Hauptbestandteile der Studie
Wissenschaftsbereich
- Gentechnik
- Vektorbiologie
- CRISPR/Cas9-Technologie
Hintergrund
- Culex quinquefasciatus ist ein wenig erforschter Krankheitsvektor.
- Mikroinjektionstechniken sind entscheidend für die Entwicklung genetischer Kontrollwerkzeuge.
- Bestehende Protokolle für andere Insektenarten sind gut etabliert.
- Diese Methode berücksichtigt die einzigartigen biologischen Merkmale der Culex-Arten.
Zweck der Studie
- Ein Mikroinjektionsprotokoll für Culex quinquefasciatus zu entwickeln.
- Genfunktionsstudien und genetische Kontrolltechnologien zu erleichtern.
- Überlebens- und Mutageneseraten bei injizierten Embryonen zu optimieren.
Verwendete Methoden
- Eiersammlung und Trenntechniken von Ei-Rafts.
- Zubereitung von Halocarbonöl und Injektionsmischung.
- Mikroinjektion von Embryonen mithilfe eines Mikromanipulators.
- Screening auf mutierte Phänotypen nach der Injektion.
Hauptergebnisse
- 64-82% Embryonen-Überlebensrate erreicht.
- Somatische Mutageneseraten lagen zwischen 37-57%.
- Keimbahn-Mutageneseraten überschritten 61%.
- Multiplexing von sgRNAs erhöhte die Mutageneseraten auf 86%.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll generiert erfolgreich somatische und Keimbahnmutationen.
- Lebensfähige homozygote Mutantenstämme wurden im Labor gehalten.
- Eine angemessene Vorbereitung der Materialien verbessert den Mikroinjektionsvorgang.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient embryo microinjection enables site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus, a key vector for diseases such as West Nile virus and lymphatic filariasis. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by generating heritable mutations for functional gene studies. The protocol addresses species-specific barriers, improving predictive confidence in vector control target identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise gene knockout in a disease-relevant insect vector.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate germline mutations for functional validation of targets involved in pathogen transmission.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene disruption to phenotypic outcomes critical for vector competence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable mutagenesis readouts (somatic and germline rates) to assess editing efficiency across guide RNA designs.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection conditions, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scalability: Enables multiplexed sgRNA delivery to increase mutagenesis rates, supporting high-throughput target screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates heritable white-eye mutants to establish stable genetic lines for long-term phenotypic and transmission studies.
- Operational Value: Achieves embryo survival rates of 64–82%, ensuring sufficient viable mutants for downstream phenotypic screening.
- Translational Continuity: Maintains viable homozygous mutant stocks across generations, supporting preclinical evaluation of genetic control strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification by enabling functional genomics in an understudied vector species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to clarify gene function in pathogen-vector interactions.
- Screening: Delivers quantitative mutagenesis rates (37–57% somatic, >61% germline) to compare guide RNA efficacy and optimize editing conditions.
- Analytics: Enables scoring of mutant phenotypes through stereoscopic screening, providing measurable outputs for hit validation.
- Translational Research: Facilitates continuity from gene discovery to preclinical model development by generating stable mutant lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized microinjection workflow adaptable across Culex species, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct genotype-phenotype linkage in a vector-borne disease model.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized egg alignment, halocarbon overlay, and needle preparation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation of targets essential for vector survival or pathogen transmission.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on heritable mutation rates and phenotypic severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, micromanipulation, and fluorescent or stereoscopic screening.
- Dependent on needle puller, microinjector, and halocarbon oil preparation for embryo viability.
- Necessitates cross-team standardization of egg collection and raft separation techniques.
- Adaptation across Culex species may require adjustments to injection volume and needle geometry.
- Practical limitations include embryo fragility and the need for immediate post-injection recovery to maintain survival rates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
