Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Mutagenese-Protokolls ist es, mit einem einfachen LED-Aufbau die genomische DNA von C.elegans zu mutagenisieren, die blaulichtabhängige, reaktive Sauerstoffgeneratorproteine exprimieren. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind einer: Das Mutagenese-Protokoll ist sehr einfach und erfordert keine giftigen Chemikalien. Und zweitens, beweist der Mutagenese-Generator nach langer Mutation

Ich hatte zuerst die Idee für diese Methode, und mir wurde klar, dass ROS-erzeugende Proteine noch nie verwendet wurden, um vererbbare Mutationen zu induzieren. Verbinden Sie für dieses Experiment den Controller des LED-Beleuchtungsgeräts über ein BNC-Kabel mit einem digitalen Funktionsgenerator. Befestigen Sie die LED-Leuchten mit einer speziellen Halterung 10 Zentimeter über der Bühne.

Decken Sie nun den Aufbau teilweise ab, um die Exposition des blauen Lichts auf die Umgebung zu begrenzen, aber nicht so viel, dass sich die Hitze auf der Bühne ansammelt. Hier kommt eine maßgefertigte Hartplastikabdeckung mit offener Ober- und Unterseite zum Einsatz. Tragen Sie während des Betriebs der LED immer eine Laserschutzbrille oder eine Sonnenbrille, da das Licht sehr hell ist.

Schalten Sie nun den Hebel des LED-Controllers auf intern und stellen Sie ihn auf 65 % der maximalen Leistung ein. Stellen Sie die Leistung des Lichts bei Bedarf mit einem Photometer so ein, dass sie auf der Bühne bei kontinuierlicher Beleuchtung 2,0 Milliwatt pro Quadratmillimeter beträgt. Halten Sie für dieses Protokoll den lichtempfindlichen Stamm unter Standardbedingungen im Dunkeln.

Unnötige Lichteinwirkung sollte vermieden werden, aber die routinemäßige Verwendung von Halogenlampen für den Durchgang führt nicht zu Mutationen. Da eine versehentliche Mutation ein Problem darstellt, frieren Sie die Aliquots des Stammes ein, wenn sie zum ersten Mal erhalten werden. Bereiten Sie für die Mutagenese ein Filterpapier vor, auf das eine 60-Millimeter-Platte mit einem etwa 25 Millimeter großen quadratischen Loch in der Mitte passt, und legen Sie es auf eine nicht besäte Platte.

Verteilen Sie dann 100 Mikroliter 100 Millimolar Kupferchlorid gleichmäßig auf dem Filterpapier, um zu verhindern, dass die Würmer das quadratische Loch verlassen. Nehmen Sie nun von einem Teller mit Würmern, die etwa 12 Stunden nach ihrem L4-Stadium sind, die trächtigen, jungen erwachsenen Hermaphroditen und legen Sie sie in das mittlere Quadrat auf dem Teller. Schalten Sie anschließend die LED und den Funktionsgenerator ein.

Schalten Sie dann den LED-Controller auf extern, um ihn mit dem Funktionsgenerator zu steuern, und stellen Sie die Leistung entsprechend ein. Erzeugen Sie aus dem Funktionsgenerator eine Sinuswelle mit 4 Hertz. Bringen Sie nun die Platte auf die Bühne und beleuchten Sie die Würmer 30 Minuten lang mit blauem Licht.

Übertragen Sie sofort nach der Behandlung alle gesund aussehenden Würmer auf eine ausgesäte Platte. Diese Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert, erholen sich aber. Bewahren Sie die lichtbehandelten Würmer im Dunkeln auf.

Überprüfen Sie später, ob die erwachsenen F2-Nachkommen anomale Morphologien oder Verhaltensweisen aufweisen. Ein genetisches Forward Screening wurde unter Verwendung der beschriebenen Technik für 60 F1-Platten durchgeführt, was 120 mutagenisierten haploiden Genomen entspricht. Acht der 60 F1-Platten mit F2-Würmern zeigten sichtbare Phänotypen, wie z. B. dumpfe Körperform, unkoordinierte Bewegung oder Letalität bei Erwachsenen.

Die Nachkommen dieser F2-Würmer behielten diese beobachtbaren Phänotypen bei. Die Anzahl der sichtbaren Mutanten aus diesem Screening deutet darauf hin, dass der Stamm und der Aufbau für die optogenetische Mutagenese ordnungsgemäß funktionieren. Das Mutageneseverfahren kann innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.

Bitte genießen Sie die schnelle und sichere Mutagenese-Methode.