Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in C. elegans
14. November 2016
Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.
Das übergeordnete Ziel dieses Mutagenese-Protokolls ist es, mit einem einfachen LED-Aufbau die genomische DNA von C.elegans zu mutagenisieren, die blaulichtabhängige, reaktive Sauerstoffgeneratorproteine exprimieren. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind einer: Das Mutagenese-Protokoll ist sehr einfach und erfordert keine giftigen Chemikalien. Und zweitens, beweist der Mutagenese-Generator nach langer Mutation
.Ich hatte zuerst die Idee für diese Methode, und mir wurde klar, dass ROS-erzeugende Proteine noch nie verwendet wurden, um vererbbare Mutationen zu induzieren. Verbinden Sie für dieses Experiment den Controller des LED-Beleuchtungsgeräts über ein BNC-Kabel mit einem digitalen Funktionsgenerator. Befestigen Sie die LED-Leuchten mit einer speziellen Halterung 10 Zentimeter über der Bühne.
Decken Sie nun den Aufbau teilweise ab, um die Exposition des blauen Lichts auf die Umgebung zu begrenzen, aber nicht so viel, dass sich die Hitze auf der Bühne ansammelt. Hier kommt eine maßgefertigte Hartplastikabdeckung mit offener Ober- und Unterseite zum Einsatz. Tragen Sie während des Betriebs der LED immer eine Laserschutzbrille oder eine Sonnenbrille, da das Licht sehr hell ist.
Schalten Sie nun den Hebel des LED-Controllers auf intern und stellen Sie ihn auf 65 % der maximalen Leistung ein. Stellen Sie die Leistung des Lichts bei Bedarf mit einem Photometer so ein, dass sie auf der Bühne bei kontinuierlicher Beleuchtung 2,0 Milliwatt pro Quadratmillimeter beträgt. Halten Sie für dieses Protokoll den lichtempfindlichen Stamm unter Standardbedingungen im Dunkeln.
Unnötige Lichteinwirkung sollte vermieden werden, aber die routinemäßige Verwendung von Halogenlampen für den Durchgang führt nicht zu Mutationen. Da eine versehentliche Mutation ein Problem darstellt, frieren Sie die Aliquots des Stammes ein, wenn sie zum ersten Mal erhalten werden. Bereiten Sie für die Mutagenese ein Filterpapier vor, auf das eine 60-Millimeter-Platte mit einem etwa 25 Millimeter großen quadratischen Loch in der Mitte passt, und legen Sie es auf eine nicht besäte Platte.
Verteilen Sie dann 100 Mikroliter 100 Millimolar Kupferchlorid gleichmäßig auf dem Filterpapier, um zu verhindern, dass die Würmer das quadratische Loch verlassen. Nehmen Sie nun von einem Teller mit Würmern, die etwa 12 Stunden nach ihrem L4-Stadium sind, die trächtigen, jungen erwachsenen Hermaphroditen und legen Sie sie in das mittlere Quadrat auf dem Teller. Schalten Sie anschließend die LED und den Funktionsgenerator ein.
Schalten Sie dann den LED-Controller auf extern, um ihn mit dem Funktionsgenerator zu steuern, und stellen Sie die Leistung entsprechend ein. Erzeugen Sie aus dem Funktionsgenerator eine Sinuswelle mit 4 Hertz. Bringen Sie nun die Platte auf die Bühne und beleuchten Sie die Würmer 30 Minuten lang mit blauem Licht.
Übertragen Sie sofort nach der Behandlung alle gesund aussehenden Würmer auf eine ausgesäte Platte. Diese Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert, erholen sich aber. Bewahren Sie die lichtbehandelten Würmer im Dunkeln auf.
Überprüfen Sie später, ob die erwachsenen F2-Nachkommen anomale Morphologien oder Verhaltensweisen aufweisen. Ein genetisches Forward Screening wurde unter Verwendung der beschriebenen Technik für 60 F1-Platten durchgeführt, was 120 mutagenisierten haploiden Genomen entspricht. Acht der 60 F1-Platten mit F2-Würmern zeigten sichtbare Phänotypen, wie z. B. dumpfe Körperform, unkoordinierte Bewegung oder Letalität bei Erwachsenen.
Die Nachkommen dieser F2-Würmer behielten diese beobachtbaren Phänotypen bei. Die Anzahl der sichtbaren Mutanten aus diesem Screening deutet darauf hin, dass der Stamm und der Aufbau für die optogenetische Mutagenese ordnungsgemäß funktionieren. Das Mutageneseverfahren kann innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.
Bitte genießen Sie die schnelle und sichere Mutagenese-Methode.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Mutageneseprotokoll vor, das histon-gebundenes miniSOG zur Induktion vererbbarer Mutationen im gesamten Genom in einer blaulichtabhängigen Weise nutzt. Die Methode ist einfach, schnell und frei von toxischen Chemikalien, was sie ideal für genetische Vorwärts-Screens und die Integration von Transgenen macht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genetik
- Neurowissenschaften
- Mutagenese
Hintergrund
- Genetisch kodierte Proteine können reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen.
- Frühere Methoden zur Induktion von Mutationen beinhalten oft toxische Chemikalien.
- Diese Studie untersucht einen neuartigen Ansatz zur vererbbaren Mutagenese.
- C. elegans dient als Modellorganismus für dieses Protokoll.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen Mutageneseprotokolls unter Verwendung von blauem Licht.
- Nachweis der Wirksamkeit von ROS-erzeugenden Proteinen bei der Induktion von Mutationen.
- Erleichterung der direkten genetischen Bildschirmanalyse und Integration von Transgenen.
Verwendete Methoden
- Nutzung einer einfachen LED-Anordnung für die Mutagenese.
- Verbindung des LED-Beleuchtungsgeräts mit einem digitalen Funktionsgenerator.
- Befestigung der LED-Leuchten oberhalb des Objekttisches mithilfe einer speziellen Halterung.
- Beobachtung der Mutagenese-Effekte bei C. elegans.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion vererbbarer Mutationen im gesamten Genom.
- Nachweis eines nicht-toxischen Mutageneseverfahrens.
- Validierung der Technik für genetische Forward-Screens.
- Potenzial für die Integration von Transgenen mittels dieser Methode.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen einfachen und effektiven Ansatz für die Mutagenese.
- Die blaulichtabhängige Mutagenese ist eine aussichtsreiche Technik für genetische Untersuchungen.
- Diese Methode kann die Forschung in der Genetik und Molekularbiologie voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels optogenetischer zufälliger Mutagenese unter Verwendung von Histon-miniSOG in C. elegans lassen sich schnelle, vererbbare Genomveränderungen ohne gefährliche Chemikalien durchführen, wodurch frühe Entdeckungsabläufe vereinfacht werden. Dieser Ansatz ermöglicht genetische Hochdurchsatz-Screenings und die Integration von Transgenen, verringert operationelle Hürden und erhöht die Flexibilität des Forschungsportfolios. Aufgrund seiner Sicherheit und Einfachheit stellt er ein skalierbares Werkzeug für die funktionelle Genomik und die Validierung von Zielstrukturen in der präklinischen Forschung dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die systematische Untersuchung der Genfunktion durch ein vorwärtsgerichtetes genetisches Screening.
- Erleichtert die Identifizierung neuartiger Signalwege und genetischer Modifikatoren, die für Krankheitsmodelle relevant sind.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem vielfältige allelische Varianten für mechanistische Studien erzeugt werden.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Auswahl, indem eine unvoreingenommene Mutagenese ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes, reproduzierbares System zur Erzeugung von Mutantenbibliotheken in C. elegans.
- Beseitigt chemische Gefahren und vereinfacht die Standardisierung von Assays sowie die Einhaltung von Laborvorschriften.
- Ermöglicht die schnelle Herstellung genetisch diverser Populationen für nachgeschaltete phänotypische Screens.
- Unterstützt skalierbare, plattformtaugliche Arbeitsabläufe für die Wirkstoffprüfung und Untersuchungen genetischer Interaktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung auf die Entwicklung krankheitsrelevanter Modelle durch gezielte Mutagenese und Integration von Transgenen.
- Erleichtert die kontinuierliche Übertragung genetischer Erkenntnisse in die präklinische Validierung an Modellorganismen.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem robuste genetische Werkzeuge zur mechanistischen Risikominimierung bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese optogenetische Mutagenesemethode wird in den frühen Phasen der Entdeckung und der Zielvalidierung integriert und unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen sowie die Entwicklung präklinischer Modelle.
- Entdeckungsbiochemie: Beschleunigt die Hypothesenprüfung und Aufklärung von Signalwegen durch unvoreingenommene Mutagenese.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die Auswahl von Mutanten und die phänotypische Analyse.
- Analytik: Ermöglicht statistische Vergleiche von Mutantenphänotypen und der Effizienz der Transgenintegration.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Entdeckungen mit der Optimierung präklinischer Modelle in C. elegans.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, ungiftige Plattform für laufende genetische Screenings und die Entwicklung von Werkzeugen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit und die Validierung von Zielstrukturen, indem umfassende Mutagenese ohne chemische Störfaktoren ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Erhöht die Laborsicherheit, Standardisierung und Durchsatzleistung, indem gefährliche Reagenzien eliminiert werden.
- Strategischer Wert: Unterstützt effiziente Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsphasen durch robuste genetische Werkzeuge.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung und flexible Weiterentwicklung von Programmen zur genetischen Entdeckung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Genetik von C. elegans und im Aufbau optogenetischer Systeme.
- Benötigt eine LED-Beleuchtungsinfrastruktur sowie grundlegende Laborsicherheitsprotokolle für die Lichtexposition.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg zur Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten voraus.
- Kann auf andere Modellsysteme mit kompatiblen optogenetischen Konstrukten übertragen werden.
- Hängt von sorgfältiger Handhabung ab, um unbeabsichtigte, lichtinduzierte Mutationen zu vermeiden.
