Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomembran-Microarrays mit einer einfachen Präparationsmethode zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem Kieselsäurekügelchen zunächst mit Lipid-Doppelschichtmembranen beschichtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die lipidbeschichteten Kügelchen auf dem Silikon-Mikrotitersubstrat abzuscheiden.

Der dritte Schritt besteht darin, Kügelchen, die sich nicht in Mikrovertiefungen befinden, mit einem Polymethylsuboxan-Rakel zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die lipidbeschichteten Bead-Arrays mit Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um Bindungskonstanten für Toxin-Lipid-Wechselwirkungen mit Hilfe eines Array-Imaging-Ansatzes zu bestimmen.

Mit dieser Methode können Arrays aus kugelförmig gestützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membranpartikeln hergestellt werden, die aus Zellen gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren besteht darin, dass neben der Herstellung der Mikrowells keine chemische Modifikation des Substrats oder der Lipidmembranen erforderlich ist, um räumlich definierte Biomembran-Arrays zu erzeugen. Die Anwendungen dieser Technik können auf die markierungsfreie Detektion von Lipidprotein-Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasma und Resonanz auf der Grundlage von nanometrischen Metallloch-Arrays erweitert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen von Lipidproteinen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Studien zur zellulären fokalen Adhäsion, Mikro-Well-Arrays und Rakelpräparationen, die im Textprotokoll detailliert beschrieben sind. Dieses Video beginnt mit der Vesikelvorbereitung. Zuerst werden in einem kleinen Glasfläschchen die Bestandteile Lipide für die Vesikel vermischt.

Insgesamt ein halbes Milligramm Lipid befindet sich in dieser Lösung, unter Vakuum wird das Gemisch sechs Stunden lang getrocknet. Als nächstes stellen Sie eine 0,1 molare Natriumchloridlösung her und fügen Sie einen halben Milliliter zu den getrockneten Lipiden hinzu. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.

Am nächsten Tag wirbeln Sie die Mischung ein, um die Vesikel zu suspendieren. Dann die Mischung 20 Minuten lang in einem Bad beschallen, bei Raumtemperatur beschallen. Nach der Beschallung extrudieren Sie die Suspension durch einen 100-Nanometer-Polycarbonat-Membranfilter.

Die Suspension wird insgesamt 17 Mal durch den Extrusionsfilter geleitet. Lagern Sie dann die extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei vier Grad Celsius. Zunächst mit Siliziumdioxidkügelchen mit einem Durchmesser von 700 Nanometern.

Stellen Sie eine Suspension aus 15 Milliarden Kügelchen in 0,1 molaren Natriumchlorid her. Die Suspension wird vertexelt und dann 20 Minuten lang bei 1700 G zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie die Wäsche durch Reanimation, indem Sie die Kügelchen in einem weiteren Milliliter Salzlösung aufhängen und weitere 20 Minuten lang eindrehen.

Wiederholen Sie dann den Vorgang ein drittes Mal, um die kugelförmig gestützten Lipiddoppelschichten oder SSBs zu bilden. Mischen Sie 25 Mikroliter der Siliziumdioxid-Kügelchensuspension mit 200 Mikrolitern der Vesikelsuspension aus dem vorherigen Abschnitt. Die Mischung vortexen und anzünden, eine Stunde später bei Raumtemperatur inkubieren, die Mischung 20 Minuten lang bei 1700 g zentrifugieren.

Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet ist rosa bis zu geplatzte Vesikel mit einer Reihe DPPE auf den Kügelchen. Resuspendieren Sie es in 225 Mikrolitern PBS bei PH 7,4.

Wiederholen Sie die Spin- und Resus-Suspensionsschritte zweimal, um die nicht geplatzten Vesikel zu entfernen und die Erstellung der SSBs abzuschließen. Teilen Sie die Wafer von Micro-Well-Arrays in rechteckige Stücke mit jeweils vier bis sechs Arrays auf. Als nächstes wird die SSLB-Suspension aus dem vorherigen Abschnitt vortext und 10 Mikroliter auf jedes Mikrovertiefungsarray übertragen.

Warten Sie eine Stunde, bis sich die SSBs später beruhigt haben. Waschen Sie die Array-Chips vorsichtig mit PBS und tauchen Sie das Array in PBS ein, indem Sie den Rakel fünfmal über die Oberfläche der eingetauchten Chips gleiten. Dadurch werden SLPs entfernt, die sich nicht in den Mikrovertiefungen befinden.

Fassen Sie anschließend jeden Array-Chip mit einer Pinzette an und schütteln Sie den PBS vorsichtig ab. Übertragen Sie es dann in ein frisches PBS-Bad. Die Oberseite der Späne muss nass bleiben.

Entfernen Sie einen Chip aus der Badewanne und entfernen Sie ihn. Die meisten PBS mit einem Labortuch. Lassen Sie genügend PBS übrig, um das Array mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Fügen Sie nun dem Array 200 Mikroliter BSA-Lösung hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Lassen Sie das Array eine Stunde lang inkubieren. In einer befeuchteten Box später das BSA mit einer Mikropipette entfernen und 200 Mikroliter Choleratoxinlösung hinzufügen.

Bringen Sie dann das Array wieder in die befeuchtete Kammer zurück. Warten Sie eine weitere Stunde, waschen Sie dann das Array mit PBS und leiten Sie überschüssiges PBS mit einem Schoßtuch ab. Platzieren Sie dann den Array-Chip auf einem Standard-Objektträger für die Mikroskopie, befestigen Sie ein 24 x 40 Millimeter großes quadratisches Deckglas an dem Array und fahren Sie mit der Bildgebung fort.

Die Bildanalyse kann mit den Funktionen image J.Automated particle analysis durchgeführt werden. Fassen Sie dann für jedes Array die mittleren Intensitäten der einzelnen SSBs als Histogramme zusammen. Nach Verwendung der skizzierten Methoden zeigt eine 100 Mikrometer große quadratische Fläche auf einem Array 936 SSBs.

Während der Belegungsdaten berechnet und ein Histogramm der SSLB-Fluoreszenzintensitäten nach einer Woche Lagerung erstellt wurde. Das gleiche Array wurde auf die gleiche Weise erneut analysiert, und es gab keine Änderung der Fluoreszenzintensität oder der Array-Belegung. Auch die sequentielle Abscheidung verschiedener SSBs mit unterschiedlichen Identifizierungsmarkern war mit den skizzierten Methoden möglich.

Die zweiten SSBs wurden zu einem 10. hinterlegt. Die Konzentration der ersten abgelagerten SSBs. Für ein Experiment wird eine Überlagerung beider Marker angezeigt.

Die Arrays wurden mit SSBs mit unterschiedlichen Konzentrationen von GM One hergestellt und einer festen Konzentration von Choleratoxin ausgesetzt. Die Umkehrung wurde auch durchgeführt, um die Gleichgewichtsdissoziationskonstante zu bestimmen. Für GM one.

Choleratoxin-Bindungsarrays können auch aus natürlichen Biomembranen hergestellt werden, wie z. B. dieses Array aus Myelinpartikeln. Es ist mit lipophilem Fluorvier FM 1 43 markiert. Lipid Rafts sind mit Cholesterin und Gangliosiden wie GM One angereichert.

So bindet Alexa 4 88 konjugiertes Choleratoxin stark an Lipid-Raft-Microarrays, im Gegensatz dazu bindet fluoreszenzmarkiertes gestripptes Aden nicht an diese Arrays. Ein Array wurde hergestellt, indem Myelin und Lipid Rafts über einen mikrofluidischen Chip mit 250-Mikron-Kanälen in die Mikrovertiefungen gebracht wurden. Es wurde mit Anti-Oligodendrozyten IgM markiert und das im Myelin enthaltene S-Sulfid wurde markiert, die Lipid Rafts jedoch nicht.

Nicht, sobald die mit Lipid-Bator beschichteten Kügelchen hergestellt sind. Diese Technik kann verwendet werden, um Arrays in einer Stunde vorzubereiten, wenn sie richtig durchgeführt wird, nach der Erstellung von natürlichen Membranpartikelarrays. Andere Methoden, wie z. B. Nanolochoberflächenplasma und Resonanz, können für die markierungsfreie Erfassung biomolekularer Wechselwirkungen verwendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Biomembran-Arrays mit lipidbeschichteten Gallenschicht-beschichteten Kügelchen und natürlichen Membranpartikeln erstellen.