Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren
8. Mai 2014
Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biomembran-Mikroarrays mithilfe einer einfachen Herstellungsmethode herzustellen. Dies wird erreicht, indem Silica-Kügelchen zunächst mit Lipiddoppelschichtmembranen beschichtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die mit Lipid beschichteten Kügelchen auf das Silikon-Mikrobrunnen-Substrat aufzutragen.
Der dritte Schritt besteht darin, die Perlen, die sich nicht in den Mikrovertiefungen befinden, mithilfe eines Polymethylsuboxan-Rakels zu entfernen. Der letzte Schritt ist die Abbildung der lipidbeschichteten Perlenarrays mittels Fluoreszenzmikroskopie. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um Bindungskonstanten für Toxin-Lipid-Wechselwirkungen unter Anwendung eines Array-Abbildungsansatzes zu bestimmen.
Diese Methode kann verwendet werden, um Arrays sphärischer unterstützter Lipiddoppelschichten und natürlicher Membranpartikel, die aus Zellen stammen, herzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass neben der Herstellung der Mikrowellplatten keine chemische Modifikation weder des Substrats noch der Lipidmembranen erforderlich ist, um räumlich definierte Biomembran-Arrays zu erzeugen. Die Anwendungen dieser Technik können auf die markierungsfreie Detektion von Lipid-Protein-Wechselwirkungen mithilfe der Oberflächenplasmaresonanz auf der Basis nanometrischer Metallloch-Arrays ausgedehnt werden.
Obwohl diese Methode Einblicke in Lipid-Protein-Interaktionen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise Untersuchungen zellulärer fokaler Adhäsionen. Mikro-Well-Anordnungen und Squeegee-Präparationen werden im textbasierten Protokoll ausführlich beschrieben. Dieses Video beginnt mit der Vesikelpräparation. Zunächst werden in einem kleinen Glasfläschchen die Bestandteile der Lipide für die Vesikel gemischt.
Insgesamt eine halbe Milligramm Lipid befinden sich in dieser Lösung; trocknen Sie das Gemisch sechs Stunden lang im Vakuum. Danach stellen Sie eine 0,1-molare Natriumchloridlösung her und geben einen halben Milliliter zu den getrockneten Lipiden hinzu. Lassen Sie das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
Am nächsten Tag das Gemisch vortexen, um die Vesikel zu suspendieren. Anschließend das Gemisch 20 Minuten im Wasserbad bei Raumtemperatur sonizieren. Nach der Sonikation die Suspension durch einen 100 Nanometer großen Polycarbonat-Membranfilter extrudieren.
Lassen Sie die Suspension insgesamt 17 Mal durch den Extrusionsfilter laufen. Danach lagern Sie die extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei vier Grad Celsius. Zunächst unter Verwendung von Siliziumdioxid-Kügelchen mit einem Durchmesser von 700 Nanometern.
Stellen Sie eine Suspension von 15 Milliarden Kügelchen in 0,1 molarer Natriumchloridlösung her. Vortexen Sie die Suspension und zentrifugieren Sie sie anschließend 20 Minuten bei 1700 G, dann entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschung, indem Sie die Kügelchen in einem weiteren Milliliter Salzlösung resuspendieren und erneut 20 Minuten zentrifugieren.
Wiederholen Sie den Vorgang anschließend ein drittes Mal, um die sphärischen, supporteden Lipiddoppelschichten oder SSBs zu bilden. Mischen Sie 25 Mikroliter der Siliziumdioxid-Perlensuspension mit 200 Mikrolitern der Vesikelsuspension aus dem vorherigen Abschnitt. Wirbeln Sie die Mischung und lassen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie danach die Mischung bei 1700 ×g für 20 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet ist rosa und stammt von aufgebrochenen Vesikeln mit Reihen von DPPE auf den Perlen. Resuspendieren Sie es in 225 µL PBS bei pH 7,4.
Wiederholen Sie die Schritte Zentrifugation und Resuspension zweimal, um nicht aufgebrochene Vesikel zu entfernen und die Erstellung der SSBs abzuschließen. Teilen Sie die Wafer der Mikro-Loch-Arrays in rechteckige Stücke mit jeweils vier bis sechs Arrays ein. Vortexen Sie anschließend die SSLB-Suspension aus dem vorherigen Abschnitt und übertragen Sie 10 µL auf jedes Mikro-Loch-Array.
Warten Sie eine Stunde, bis sich die SSBs später abgesetzt haben. Waschen Sie die Array-Chips vorsichtig mit PBS und tauchen Sie den Array in PBS ein, indem Sie den Rakel fünfmal über die Oberfläche der untergetauchten Chips gleiten lassen. Dadurch werden SLPs entfernt, die sich nicht in den Mikrovertiefungen befinden.
Als Nächstes greifen Sie jeden Array-Chip mit einer Pinzette und schütteln vorsichtig das PBS ab. Danach überführen Sie ihn in ein frisches PBS-Bad. Die Oberflächen der Chips müssen stets benetzt bleiben.
Entfernen Sie einen Chip aus dem Bad und wischen Sie ihn vorsichtig ab. Entfernen Sie den größten Teil des PBS mit einem Laborabwischpapier. Lassen Sie genügend PBS zurück, um das Array hydratisiert zu halten.
Jetzt 200 Mikroliter BSA-Lösung auf das Array geben, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Das Array eine Stunde inkubieren lassen. Danach im feuchten Behälter die BSA-Lösung mit einer Mikropipette abnehmen und 200 Mikroliter Cholera-Toxin-Lösung hinzufügen.
Anschließend das Array in die befeuchtete Kammer zurückbringen. Weitere eine Stunde warten, dann das Array mit PBS waschen und überschüssigen PBS mit einem Läppchen abwickeln. Danach das Array-Chip auf einen standardmäßigen Mikroskopie-Objektträger legen, einen 24 mal 40 Millimeter großen quadratischen Deckgläser darauf platzieren und mit der Bildaufnahme fortfahren.
Die Bildanalyse kann mit den automatisierten Partikelanalyse-Funktionen von ImageJ durchgeführt werden. Anschließend werden für jedes Array die mittleren Intensitäten der einzelnen SSBs als Histogramme zusammengefasst. Nach Anwendung der beschriebenen Methoden zeigt ein 100-Mikrometer-Quadratbereich auf einem Array 936 SSBs.
Während die Besetzungsdaten berechnet und ein Histogramm der fluoreszierenden Intensitäten von SSLB nach einer Woche Lagerung erstellt wurde, wurde dasselbe Array erneut auf dieselbe Weise analysiert, wobei keine Veränderung der fluoreszierenden Intensitäten oder der Array-Besetzung festgestellt wurde. Eine sequenzielle Abscheidung verschiedener SSBs mit unterschiedlichen Identifikationsmarkern war ebenfalls mit den beschriebenen Methoden möglich.
Die zweiten SSBs wurden bei einem Zehntel der Konzentration der ersten abgelegten SSBs aufgetragen. Eine Überlagerung beider Marker wird für einen Versuch gezeigt.
Arrays wurden mit SSBs mit verschiedenen Konzentrationen von GM1 hergestellt und einer festen Konzentration von Cholera-Toxin ausgesetzt. Umgekehrt wurde ebenfalls durchgeführt, um die Gleichgewichtsdissoziationskonstante für GM1 zu bestimmen.
Cholera-Toxin-Bindungsarrays können auch aus natürlichen biologischen Membranen hergestellt werden, wie zum Beispiel diesem Array aus Myelinpartikeln. Es ist mit dem lipophilen Fluorophor FM 1 43 markiert. Lipidrafts sind reich an Cholesterin und Gangliosiden wie GM1.
Daher bindet Cholera-Toxin, konjugiert mit Alexa 488, stark an Lipid-Raft-Mikroarrays, während fluoreszenzmarkiertes, abgestreiftes Aden an diese Arrays nicht bindet. Ein Array wurde hergestellt, indem Myelin und Lipid-Rafts mittels eines mikrofluidischen Chips mit 250-Mikron-Kanälen in die Mikrovertiefungen überführt wurden. Es wurde mit anti-Oligodendrozyten-IgM markiert, und das in Myelin enthaltene S-Sulfid wurde detektiert, die Lipid-Rafts hingegen nicht.
Nicht, sobald die Lipid-Bator-beschichteten Kügelchen hergestellt sind. Diese Technik kann verwendet werden, um Arrays innerhalb einer Stunde vorzubereiten, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach der Erstellung von Arrays aus natürlichen Membranpartikeln können andere Methoden wie nanostrukturierte Oberflächen-Plasmonenresonanz für die markierungsfreie Detektion biomolekularer Wechselwirkungen eingesetzt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Biomembran-Anordnungen unter Verwendung von Lipid-Bile-Schicht-beschichteten Kugeln und natürlichen Membranpartikeln herstellt.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Herstellung von Biomembran-Mikroarrays unter Verwendung von unterstützten Lipiddoppelschichten vor. Das Verfahren umfasst das Beschichten von Silicabeads mit Lipiddoppelschichten und deren Ablagerung auf einem Silikon-Mikrobrunnen-Substrat.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Analytische Chemie
Hintergrund
- Unterstützte Lipiddoppelschichten imitieren Eigenschaften von Zellmembranen.
- Natürliche Membranpartikel können in verschiedenen analytischen Strategien verwendet werden.
- Microarrays erleichtern die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen.
- Die Fluoreszenzmikroskopie wird zur Abbildung der Arrays eingesetzt.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer einfachen Methode zur Herstellung von Biomembran-Mikroarrays.
- Möglichmachung der Bestimmung von Bindungskonstanten für Toxin-Lipid-Wechselwirkungen.
- Verbesserung der analytischen Fähigkeiten bei der Untersuchung von Membrandy namik.
Verwendete Methoden
- Beschichten von Silica-Perlen mit Lipiddoppelschichtmembranen.
- Aufbringen von lipidgebeschichteten Perlen auf ein Silikon-Mikrotröpfchen-Substrat.
- Entfernen von Perlen außerhalb der Mikrotröpfchen mittels einer Polymethylsuboxan-Rakel.
- Abbildung der lipidgebeschichteten Perlen-Arrays mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von mit Lipiddoppelschichten beschichteten Mikroarrays.
- Nachgewiesene Bildgebung von mit Lipiden beschichteten Mikrokügelchen-Arrays.
- Mögliche Anwendung bei der Untersuchung von Lipid-Wechselwirkungen mit Toxinen.
- Bereitstellung einer einfachen und effektiven Methodik für Forschende.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht die Herstellung funktioneller biochemischer Membran-Mikroarrays.
- Sie kann für verschiedene analytische Anwendungen in der Neurowissenschaft und Biologie genutzt werden.
- Zukünftige Studien können auf den mit dieser Methode untersuchten Wechselwirkungen aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Herstellung stabiler, hochdichter unterstützter Lipiddoppelschicht-Arrays zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen ohne chemische Modifizierung der Substrate oder Membranen. Sie unterstützt die Target-Validierung und Assay-Entwicklung, indem sie eine reproduzierbare Plattform zur Quantifizierung der Ligand-Rezeptor-Bindung – beispielsweise von Cholera-Toxin an das Gangliosid GM1 – mit langfristiger Stabilität und Multiplex-Fähigkeit bereitstellt. Der Ansatz verringert mechanistische Unschärfen in der frühen Entdeckungsphase, indem er membranspezifische Wechselwirkungen in einem kontrollierten, skalierbaren Format isoliert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen in einem definierten Membranumfeld zur Validierung von Zielstrukturen wie dem Gangliosid GM1.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch quantitative Bindungsmessungen mittels Fluoreszenzintensitäts-Histogrammen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Identifizierung von Leitverbindungen durch die Bestimmung von Bindungskonstanten in einem krankheitsrelevanten Membransystem.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte SLB-Anordnungen mit einer Belegung von über 75 % der Mulden und konsistenten fluoreszierenden Signalen für zuverlässige Wirkstofftests.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet Stabilität des Signals über eine Woche hinweg und ermöglicht damit die Beurteilung des Assayverhaltens über längere Zeiträume sowie den Vergleich zwischen verschiedenen Durchläufen.
- Multiplexfähigkeit: Ermöglicht die serielle Abscheidung unterschiedlicher SSLBs, um mehrere Lipid-Ziele in einem einzigen Array-Format zu charakterisieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet natürliche Membranpartikel (z. B. myelinabgeleitete Lipidrafts), um zellspezifische Membranbestandteile in pathophysiologischen Kontexten zu untersuchen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Forschung, indem sie assays ermöglicht, die auf Biomarkern basieren, wie beispielsweise die Anreicherung von Gangliosiden in Lipidrafts.
- Risikominimierung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie prädiktive Bindungsdaten aus nativ-ähnlichen Membranen bereitstellt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zum präklinischen Profiling, insbesondere für membranassoziierte Targets.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung lipidvermittelter Mechanismen, indem bilärspezifische Eigenschaften von der zellulären Komplexität isoliert werden.
- Screening: Liefert assaysbereite, quantitative Ergebnisse mittels Fluoreszenzintensität einzelner SSLBs zur Bestätigung von Treffern.
- Analytik: Ermöglicht die Bestimmung von Bindungskonstanten durch Histogrammanalyse der SSB-Intensitäten bei variierenden Ligandenkonzentrationen.
- Translationale Forschung: Schließt an die präklinische Validierung an, indem natürliche Membranpartikel verwendet werden, um die krankheitsrelevante Lipidzusammensetzung abzubilden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für mehrere Zielstrukturen durch sequenzielle Abscheidung ohne erneute Funktionalisierung des Substrats.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Target-Ligand-Interaktionen, indem falsch-positive Ergebnisse durch unspezifische Bindung verringert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Skalierbarkeit durch beadbasierte Selbstorganisation und Squeegee-Reinigung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitaleffizienz, indem Hochdurchsatz-Screenings mit minimalem Reagenzverbrauch ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Membran-Targets basierend auf quantitativen Interaktionsdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung von Lipidvesikeln, der Funktionalisierung von Kügelchen und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Hängt vom Zugang zu mikrofabrizierten Mikrowell-Anordnungen und kontrollierter Extrusionsausrüstung für die Vesikelgrößenbestimmung ab.
- Erfordert die Standardisierung von Wasch- und Blockierschritten (z. B. Inkubation mit BSA), um die Signalstörungen zwischen den Arrays zu minimieren.
- Die Anpassung an verschiedene Membransysteme erfordert die Optimierung der Kügelchen-zu-Lipid-Verhältnisse und Inkubationszeiten.
- Praktische Einschränkung: Die Belegung der Arrays liegt typischerweise über 75 %, wodurch einige Wells leer bleiben; dies muss bei der Datenanalyse berücksichtigt werden.
