Name: Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Biomembran-Mikroarrays mit einem Rakel-basierten Verfahren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Toxin-Lipid-Interaktionen und Membrandynamik.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an SHO von den National Institutes of Health (R01 GM092993) unterstützt, der National Science Foundation (NSF Career Award und DBI 0964216), dem Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Programm und die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics. Geräte-Fertigung wurde an der Universität von Minnesota und Nanofabrikation Center (NFC), die Unterstützung von der NSF durch die National Nanotechnology Infrastructure Netzwerk empfängt. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse zu MR von den National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), der Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Stiftungen und der Familie McNeilus unterstützt. Die Autoren möchten Hyungsoon Im für die Unterstützung bei Abbildungen und Shailabh Kumar für die Unterstützung bei der Rasterelektronenmikroskopie danken.

1. Microfabrication von Microwell-Array-Substrat <ol><li> Beginnen mit einem 4-Zoll-Siliziumwafer mit 100 nm thermisch aufgewachsenes Oxid. </li><li> Spin SPR-955 0,7 Photoresist auf dem Wafer bei 4000 Upm für 30 Sekunden. </li><li> Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek. </li><li> Expose Photolack. <ol><li> Verwenden Sie eine Maske, die ein um Löcher in einem sechseckigen Feld mit einer 3 um Zeit, wo das Array umfasst eine 2 mm x 2 mm Bereich angeordnet schaffen wird. </li><li> Aussetzen Wafer in einem i-Linien-Steppers mit einer Schrittweite von 6 mm und einer Belichtung von 200 mJ / cm 2. </li></ol></li><li> Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek. </li><li> Entwickeln Sie mit Hilfe eines Spin-Entwickler zu 2 Pfützen von CD-26 auf dem Wafer für eine Gesamtentwicklungszeit von 90 Sekunden zu hinterlegen. </li><li> Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen. </li><li> Ätzen des Oxids in einer Blind Ionenätzer für 6 min mit 50 sccm Ar, 25 sccm CF 4, und 50 sccm von CHF 3 floFlügel bei einem Druck von 75 mTorr. </li><li> Ätzen der Silizium in einem ICP-Deep-Trench-reaktiven Ionenätzer für 2 min mit 63 sccm C 4 F 8, 27 sccm SF &amp;sub6;, 40 sccm Ar und 10 sccm O 2 bei einem Druck von 14 mTorr fließt. </li><li> Spülen in Aceton, Methanol und Isopropanol zu entfernen, widerstehen. </li><li> In ein Bad aus H 2 SO 4: H 2 O 2 1:1 für 10 min, um die Oberfläche zu reinigen. </li><li> Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen. </li><li> Abzuscheiden 1.080 Å von Al 2 O 3 durch Atomlagenabscheidung bei 250 º C </li></ol> 2. Herstellung von Poly (dimethylsiloxan) Rakel <ol><li> Wenn möglich, arbeiten in einem Reinraum. Ansonsten in der saubersten Umgebung möglich zu arbeiten. </li><li> Besorgen Sie sich eine Kunststoff-Petrischale (oder andere saubere Einweg-Container) mit ≥ 13 mm Seiten. </li><li> In diesem Gericht, gieße 5 g PDMS Härter, gefolgt von 50 g PDMS basE-Agent (oder irgendetwas mit einem Verhältnis von 1:10, die meist füllen wird die Petrischale). Mischen Sie gründlich mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette oder Stange. </li><li> Blasen entfernen, indem man die Misch PDMS in einer Kammer mit einer Vakuumleitung, Anlegen von Vakuum bis Blasen mehr aus Gemisch (ca. 30 min). </li><li> Falls nicht bereits in der Petrischale gießen PDMS in Petrischalen, die Vermeidung Erzeugung von Luftblasen. </li><li> Heilung über Nacht auf einer Heizplatte bei&gt; 50 ° C (höhere Wärme für weniger Zeit geht auch). </li><li> Mit neuen / sauberen Rasierklinge vorsichtig schneiden Sie ein rechteckiges Stück ca. 2,5 x 2,5 cm, halten Oberfläche so sauber wie möglich. Ziehen Sie mit einer sauberen Pinzette. Schneiden Sie eine Kante (bis 1,5 cm), indem Sie unten auf Rasierklinge in einer Bewegung, bis Oberkante so scharf wie möglich zu machen (dies wird der in der Rakelverfahren verwendet Kante sein). </li><li> Reinigen mit Aceton, Methanol, Isopropylalkohol und Reinstwasser DI-Wasser, und dann föhnen mit sauberem Stickstoffgas. Bewahren Sie in einem sauberen Petrischale. </li></ol> 3. Herstellung von Vesikeln <ol><li> Sammeln Lipidstammlösungen von 25 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (PC) und 1 mg / ml 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - (Lissamingrün Rhodamin B sulfonyl) Ammoniumsalz (Rho-DPPE) in Chloroform und eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Monosialogangliosid GM1 in Chloroform / Methanol (2:1 v / v). </li><li> In einem kleinen Glasfläschchen stellen eine Mischung, die 97 Mol-% PC führt, 2 mol% GM1 und 1 Mol-% DPPE-Rho durch Zugabe von 18,9 &amp;mgr; l von 25 mg / ml PC, 39,6 ul 0,5 mg / ml GM1 und 7,9 ul 1 mg / ml Rho-DPPE mit Glasspritzen. </li><li> Hinweis:. Das Zusatzmaterial für Nair et al 25 eine ausgezeichnete anpassbare Excel-Tabelle für die Berechnung der Mengen von Lipiden erforderlich, um Vesikel beliebiger Zusammensetzung erstellen, enthält. </li><li> Zeigen Fläschchen im Vakuumtrockenschrank und das Lösemittel durch Verlassen der Ampulle unter Vakuum für 6 Stunden. </li><li> Stellen einer wässrigen Lösung von 0,1M NaCl. 0,5 ml der 0,1 M NaCl-Lösung in das Fläschchen, das das getrocknete Lipidfilm. </li><li> Lassen Sie die wässrigen Lipid-Mischung über Nacht ruhen. </li><li> Vortexen mischen, um eine Vesikelsuspension schaffen, dann beschallen für 20 min in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur. </li><li> Extrudieren der Vesikel Suspension durch eine Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße. Übergeben Sie die Vesikelsuspension durch den Filter 17x. </li><li> Speichern der extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei 4 ° C </li></ol> 4. Bildung von sphärischen Unterstützte Lipiddoppelschichten <ol><li> Sammeln Sie 700 nm Durchmesser SiO 2-Kugeln. Die Perlen werden in destilliertem Wasser mit einer Stammkonzentration von 1,4 x 10 11 Perlen / ml geliefert. </li><li> In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bereiten eine 1 ml Partikelsuspension mit einer Konzentration von 1,5 x 10 10 Perlen / ml durch Zugabe von 107 ul Wulst Stammlösung auf 893 ul 0,1 M NaCl. </li><li> Mischen Sie den Suspension, um sicherzustellen, es ist gut, mixen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1700 g für 20 min dann den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M NaCl. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal gründlich waschen die Perlen. </li><li> Die SSLBs bilden, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen werden 25 ul der SiO 2-Partikelsuspension zu 200 ul von 1 mg / ml Vesikel-Suspension. Vortex die Mischung und lassen Sie stehen für 1 h bei Raumtemperatur. In dieser Phase sollte die Konzentration SSLB 1,7 x 10 9 SSLBs / ml. </li><li> Zentrifuge bei 1700 g für 20 min, um die SSLBs zu pelletieren. Das Pellet sollte rosa aufgrund der Ruptur der Vesikel mit Rho-DPPE auf den Perlen erscheinen. </li><li> Verwerfen des Überstandes und Resuspension in 225 &amp;mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH = 7,4. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,7 zwei weitere Male, um alle unruptured Vesikel von der SSLB Suspension zu entfernen. </li></ol> 5. Versammlung SSLB Array <ol><li> Cleave Wafer von Mikrowell-Arrays was in rechteckige Stücke mit 4-6 microwell Arrays pro Stück. </li><li> Vortex mischen SSLB Aufhängung, dann legen 10 ul SSLB Suspension auf jede Mikroarrays. Lest Rest für 1 Stunde, damit SSLBs, an die Oberfläche zu begleichen. </li><li> Waschen Sie vorsichtig die Mikrowell-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche, dann in einem PBS-Bad in einer flachen Schale vorbereitet einzutauchen. </li><li> Während untergetaucht ist, setzen die PDMS Rakel bündig auf dem Mikrowell-Array-Chip und ziehen Sie sie vorsichtig entlang der Oberfläche 5x bis SSLBs, die nicht in Mikro immobilisiert sind zu entfernen. </li><li> Fassen Sie die Mikrowell-Array-Chip mit einer Pinzette und schütteln in der PBS-Bad, um überschüssige SSLBs entfernen. </li><li> Schnelles Entfernen des Chips von der Rakel Bad und in ein frisches PBS-Bad bis zur weiteren Verwendung. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Chips, um die nassen SSLBs erhalten bleibt. </li></ol> Hinweis: Die oben beschriebene Montageverfahren kann verwendet werden, um Arrays von natürlichen Membran-Teilchen zu erzeugen, wie Myelin Partikel aus Maushirn oder pho isoliertspholipid Vesikel ohne die SiO 2-Träger Perle. Diese Arbeit wird im Detail in Wittenberg et al. 21 beschrieben und repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt. 6. Cholera Toxin-Bindungsassay <ol><li> Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. </li><li> Es wird eine Lösung mit der gewünschten Konzentration von Alexa 488-konjugierten Choleratoxin B-Untereinheit in PBS mit 2 mg / ml BSA. </li><li> Entfernen Sie die SSLB-Array-Chip aus dem PBS-Bad und Docht meisten der PBS-Lösung entfernt mit einem Labor zu wischen. Lassen Sie gerade genug PBS auf dem Chip zu halten, der SSLB Array mit Feuchtigkeit versorgt. </li><li> Um nichtspezifische Bindung zu verhindern, 200 ul 2 mg / ml BSA Lösung des SSLB Array-Chip. Ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box. </li><li> Mit einer Mikropipette entfernen 200 ul-Lösung von der Spitze der SSLB Array-Chips. </li><li> In 200 ul von Choleratoxin Lösung des SSLB Array Chip und ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box. </li><li> Waschen Sie vorsichtig die SSLB-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche um ungebundenes Cholera-Toxin zu entfernen. </li><li> Wick überschüssige PBS mit einem Labor zu wischen. Vor Bildgebung Abdeckung Chip mit einem 24 mm x 40 mm Deckglas. </li><li> Bild-Arrays mit einem aufrechten Mikroskop mit Filtersätze für die Fluorophore von Interesse angemessen. </li><li> Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner SSLBs in einem Array mit der automatisierten Partikelanalyse-Funktion von ImageJ Software. </li><li> Kompilieren mittleren Fluoreszenzintensitäten von einzelnen SSLBs in Histogramme, die die Intensitäten der SSLBs auf einem bestimmten Array gefunden zusammenzufassen. </li></ol>

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<li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li>
<li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
<li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass monodisperse SiO 2-Kugeln mit unterstützten Lipiddoppelschichten überzogen werden können, ohne die Notwendigkeit von Zielliganden auf den Lipid-Doppelschichten und der Substratoberfläche in Mikrotiterplatten Arrays angeordnet werden, und die Anordnungen können zur Charakterisierung von Toxin-Lipid-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Dissoziationskonstante wir CTx/GM1 Bindung berechnet vergleicht vorteilhaft, da die großen Unterschiede der Werte in der Literatur, mit eine...

Lipid-Doppelschicht-Membranen sind wesentliche Strukturen in der Natur. Zellplasmamembranen und Organellen-Membranen sind aus Lipid-Doppelschichten, die eine Reihe von Molekülen, die für das Leben notwendig sind, zusammengesetzt zu integrieren. Viele lebenserhaltenden Prozesse auf der Oberfläche von Zellen vorkommen oder durch Moleküle mit Lipid-Doppelschichtmembranen assoziiert vermittelt. In der Tat sind viele Arzneimittel Ziel Prozesse oder Moleküle auf oder in Membranen 1,2 gefunden. Es ist daher notwendig, analytisch untersuchen Prozesse wie chemische Reaktionen oder nichtkovalente Bindungsereignisse, die auf Membranoberflächen auftreten. Da die natürlichen Membranen kann schwierig sein, mit Sensoren zu isolieren und / oder eine Schnittstelle sein, viele Forscher beschäftigen vereinfachte Modellmembranen zur Durchführung von analytischen Studien. Eine Anzahl von Modellmembransysteme sind in der Literatur beschrieben, von Riesenvesikeln, die zehn bis hundert Mikrometer im Durchmesser, um Liposomen mit nanoskaligen Abmessungen 3,4 sein kann. Alternverhältnismäßig planaren Lipid-Doppelschichten auf festen Trägern abgeschieden, dh unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), können auf einer Reihe von verschiedenen Oberflächen hergestellt werden und wurden vielfach in der biophysikalischen, biochemischen und analytischen Anwendungen 5 verwendet. Koppeln SLBs mit elektrischen oder optischen Materialien ermöglicht Untersuchung von Membran Biochemie und Biophysik durch die Verwendung von verschiedenen analytischen Techniken. Fluoreszenzmikroskopie 6, 7 der Elektrochemie, optische Spektroskopie 8, 9 der Rastersondenmikroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz 10 und Massenspektrometrie 11 wurden alle verwendet, um die Struktur und Eigenschaften von SLBs zu studieren. SLB-Arrays bieten zusätzliche Flexibilität bei der Gestaltung von Sensoren für die Multiplex-Assays 12,13. Andere Anwendungen verwenden SLB-Arrays, um die Verbindung, die zwischen Immunzellen 14 bildet imitieren. Aufbereitungsmethoden für SLB-Arrays wurden aus microFlu variiertidic nähert sich 15 bis diejenigen, die physikalischen Barrieren zwischen benachbarten SLB-Patches zu verwenden. Andere Gruppen haben 16 Druckverfahren verwendet, 17, 18 und photochemischen Strukturierung verschiedener Nanotechnik nähert sich 19 bis SLB-Arrays erstellen. In diesem Papier und begleitende Video zeigen wir ein Verfahren zur Bildung SLB-Arrays durch Aufbringen von SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln in geordnete Reihen von Vertiefungen 20. Wir verweisen auf die SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln als Kugel unterstützt Lipid-Doppelschichten (SSLBs). Diese Technik ist eine Erweiterung der früheren Arbeit, die Arrays von Phospholipid-Vesikeln und Biomembranen aus natürlichen Quellen, 21, aus dem wir zeigen auch, beispielsweise Ergebnisse abgeleitet erstellt. Andere Methoden zum Ordnen Biomembran Partikel oder Vesikel auf Mustern der spezifischen Targeting-Liganden auf Oberflächen, die mit komplementären Liganden auf der Vesikel-Oberfläche enthalten assoziieren verlassen. Beispiele sind Biotin-Avidin Verein 22,23 und DNA-Hybridisierungssysteme 24. Unser Ansatz erfordert nur eine Mikrowell-Array ohne Targeting oder Erkennungsgruppen erforderlich. Die Größe SSLBs wird durch den Durchmesser der SiO 2-Trägern Wulst, die eine geringe Polydispersität aufweisen definiert. Durch die Abstimmung der Mikrowell-Durchmesser, nur größer als der Durchmesser SSLB, setzt sich nur eine einzige SSLB in jede Vertiefung. Ein Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Rakel entfernt dann von der Oberfläche SSLBs alle, die nicht in Mikro immobilisiert sind. Die Streifen und die daraus resultierende SSLB Arrays hoher Dichte (~ 10 5 SSLBs / mm 2) mit 3 um Mitte-zu-Mitte-Abstand und Sechskant Periodizität. Abscheiden von seriell SSLBs mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen ist es möglich, Mehrkomponenten-Arrays mit zufällig positionierten SSLBs erstellen. Um die Erfassungsfähigkeit SSLB Arrays zeigen, haben wir die Wechselwirkung von Choleratoxin (CTX) mit einem Gangliosid (GM1) in die SSLBs aufgenommen. Mitnatürlichen Membranpartikel, waren wir in der Lage, zellspezifische Lipide im Mehrkomponenten-Arrays enthalten Membranmaterial aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zu detektieren.

<table><tbody><tr><td>4-Zoll-Siliziumwafer</td><td>University Wafer</td><td>425</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>SPR955-CM</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MICROPOSIT CD-26 Entwickler</td><td>MicroChem</td><td>CD-26</td><td></td></tr><tr><td>i-line Stepper</td><td>Canon</td><td>2500 i3 Stepper</td><td></td></tr><tr><td>Vision 320 reaktiver Ionenätzer</td><td>Advanced Vacuum</td><td>Vision 320 RIE</td><td></td></tr><tr><td>Reaktiver Ionenätzer in tiefen Gräben</td><td>Plasma Therm</td><td>SLR-770</td><td></td></tr><tr><td>Atomlagenabscheidungssystem</td><td>Cambridge NanoTech</td><td>Savannah</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Poly(dimethylsiloxan) kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Eiphosphatidylcholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonyl), Ammoniumsalz</td>, <td>Avanti Polare Lipide</td><td>810158C</td><td></td></tr>, <tr><td>Monosialogangliosid GM1</td>, <td>Avanti Polare Lipide</td><td>860065P</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxidkügelchen</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS03N/4666</td><td>Auf der Verpackung auf dem Bead-Behälter ist angegeben, dass die Perlen einen Durchmesser von 900 nm haben. Nach Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie stellten wir jedoch fest, dass die Kügelchen einen Durchmesser von etwa 700 nm haben.</td></tr><tr><td>Choleratoxin B-Untereinheit, Alexa 488-Konjugat</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C-34775</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodentrozyten-Antikörper IgM O4, NorthernLights 557 Konjugat</td><td>R& D Systems</td><td>NL1326R</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Molekulare Sonden</td><td>T-3136</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin Zentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-09</td><td></td></tr></tbody></table>

bildung biomembrane microarrays mit einem rakel-basierten montageverfahren

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid-Doppelschichtmembranen zu bilden, die Plasmamembranen der Zellen und definieren die Grenzen der subzellulären Organellen. In der Natur werden diese Membranen sind heterogene Gemische von vielen Arten von Lipiden, enthalten membrangebundene Proteine ​​und sind dekoriert mit Kohlenhydraten. In einigen Experimenten, ist es wünschenswert, die biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht von denjenigen der natürlichen Membran entkoppeln. Solche Fälle erfordern die Verwendung von Modellsystemen, wie Riesen-Vesikel, Liposomen oder unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs). Arrays von SLBs sind für Sensoranwendungen und imitiert die Zell-Zell-Interaktionen besonders attraktiv. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Bildung SLB-Arrays. Submicron-Durchmesser SiO 2-Kugeln werden zunächst mit Lipid-Doppelschichten beschichtet, um sphärische SLBs (SSLBs) zu bilden. Die Kügelchen werden dann in einer Anordnung von Mikro hergestellt Submikron-Durchmesser Vertiefungen abgeschieden. Die Herstellung Technik verwendet eine &quot;Rakel&quot;, um die Substratoberfläche zu reinigen, während leaving hinter SSLBs, die in Mikrovertiefungen niedergelassen haben. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Modifikation des Mikrovertiefungs Substrat, noch eine besondere Zielliganden auf der SSLB. Mikrowells durch einzelne Perlen besetzt, weil der Durchmesser gut abgestimmt ist, nur größer als der Kugeldurchmesser sein. Typischerweise mehr 75% der Brunnen belegt sind, während der Rest leer bleiben. In Puffer SSLB Arrays anzuzeigen langfristige Stabilität von mehr als einer Woche. Mehrere Arten von SSLBs können in einem Array von seriellen Abscheidung gebracht werden, und die Anordnungen können zum Abtasten verwendet werden, was wir demonstrieren durch Charakterisierung der Wechselwirkung von Choleratoxin mit Gangliosid GM1. Wir zeigen auch, dass die Phospholipid-Vesikel ohne den Wulst Stützen und Biomembranen aus zellulären Quellen kann mit dem gleichen Verfahren angeordnet werden und Zell-spezifischen Membran-Lipide identifiziert werden.

Wenn SiO 2-Kugeln werden mit einer Lösung von Vesikeln aus Phospholipiden, fluoreszierende Lipide und andere Lipide, wie Gangliosiden zusammen gemischt, reißen die Vesikel auf der SiO 2-Oberflächen SSLBs Wulst zu bilden, wie schematisch in Fig. 1a gezeigt. Nach dem Waschen der SSLBs wird ein Tropfen der Lösung SSLB auf einer Mikrowell-Array platziert, und die Perlen dürfen an der Oberfläche absetzen. (Fig. 1B1) Dies kann auch mit einer Suspension von Phospholipid-V...

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biomembran-Mikroarrays mithilfe einer einfachen Herstellungsmethode herzustellen. Dies wird erreicht, indem Silica-Kügelchen zunächst mit Lipiddoppelschichtmembranen beschichtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die mit Lipid beschichteten Kügelchen auf das Silikon-Mikrobrunnen-Substrat aufzutragen.Der dritte Schritt besteht darin, die Perlen, die sich nicht in den Mikrovertiefungen befinden, mithilfe eines Polymethylsuboxan-Rakels zu entfernen. Der letzte Schritt ist die Abbildung der lipidbeschichteten Perlenarrays mittels Fluoreszenzmikroskopie. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um Bindungskonstanten für Toxin-Lipid-Wechselwirkungen unter Anwendung eines Array-Abbildungsansatzes zu bestimmen.Diese Methode kann verwendet werden, um Arrays sphärischer unterstützter Lipiddoppelschichten und natürlicher Membranpartikel, die aus Zellen stammen, herzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass neben der Herstellung der Mikrowellplatten keine chemische Modifikation weder des Substrats noch der Lipidmembranen erforderlich ist, um räumlich definiert

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren zwei Prozesse für die Mikrofabrikation von porösen Polymer-Chips für dreidimensionale Zellkultivierung. Die erste ist Heißprägen mit einem Lösemitteldampf Schweißverfahren kombiniert. Die zweite nutzt ein neu entwickeltes microthermoforming Prozess mit Ionen-Track-Technologie führt zu einer wesentlichen Vereinfachung der Herstellung kombiniert.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Eine Beschreibung der Bildung eines Polymers unter Verwendung eines Mikroarray-on-Chip-Technik Photopolymerisation. Der hohe Durchsatz Oberflächencharakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie, Wasser Randwinkelmessungen, Röntgen-Photoelektronenspektroskopie und Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie und einer Zellanhaftung-Assay wird auch beschrieben.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Untersuchung der Septinorganisation auf einer glasgestützten Lipiddoppelschicht in vitro mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: Eine mikroskopiebasierte In-vitro-Technik zur Untersuchung der Septin-Assemblierung auf biologischen Membranimitatoren

Wir beschreiben experimentellen Details der Synthese von gemusterten und rekonfigurierbare Teilchen von zweidimensionalen (2D) Vorstufen. Diese Methodik kann verwendet werden, um Partikel in einer Vielzahl von Formen, einschließlich Polyeder und Greifvorrichtungen auf Längenskalen Bereich von Mikro-bis Zentimeterbereich erzeugen.

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

Eine geführte Material-Screening Ansatz zur Sol-Gel abgeleiteten Protein-Microarrays mit dotierten eine aufstrebende Pin-Druckverfahren der Fertigung entwickeln beschrieben. Diese Methodik wird durch die Entwicklung von Acetylcholinesterase-und Multi-Kinase-Microarrays, die für eine kostengünstige Screening kleiner Moleküle verwendet werden aufgezeigt.

A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich Umweltarchitektur, Mitgliedshäufigkeit, Züge und Wechselwirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine synthetische, mikrogefertigte Umgebung für die gleichzeitige Verfolgung von Tausenden von Gemeinschaften, die in Femtoliter-Vertiefungen enthalten sind, wo Schlüsselfaktoren wie Nischengröße und Einschluss angenähert werden können.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die beschreibt die Herstellung von dehnbar, dual Channel, Orgel Chip mikrofluidischen Zelle Kultur Geräte zur Rekapitulation ORGANEBENE Funktionalität in Vitro.

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

Wir stellen eine Technologie vor, die kapillaritätsunterstützte Montage in einer mikrofluidischen Plattform verwendet, um in einer Flüssigkeit suspendierte Objekte in Mikrogröße, wie Bakterien und Kolloide, in vorgeschriebene Arrays auf einem Polydimethylsiloxansubstrat zu strukturieren.

Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Lernen Sie die Herstellung von Biomembran-Mikroarrays mit einem Rakel-basierten Verfahren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Toxin-Lipid-Interaktionen und Membrandynamik.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

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