Mikrofluidische Strukturierung und fluoreszenzbasierte Verfolgung des einzelligen Bakterienwachstums

Beginnen Sie mit einer fluoreszenzmarkierten Bakterienkultur, die zu einem kohlenstofffreien Puffer hinzugefügt wird.

Zentrifugieren Sie, um die Bakterien zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem frischen kohlenstofffreien Puffer, der ein mildes Reinigungsmittel enthält.

Das Fehlen einer Kohlenstoffquelle stoppt das Wachstum, während das Reinigungsmittel das Verklumpen verhindert und die Zellen in der Schwebe hält.

Laden Sie die Bakteriensuspension in eine Spritze und schließen Sie sie an eine Pumpe an.

Injizieren Sie die Suspension in den Einlass eines mikrofluidischen Chips, der einen Kanal mit in den Boden eingebetteten Fallen enthält.

Ziehen Sie die Flüssigkeit langsam aus dem Kanalauslass heraus.

Wenn die Flüssigkeit zurückweicht, leiten Kapillarkräfte die Bakterien zum Auslass.

Bei diesem Prozess siedeln sich einzelne Bakterienzellen in den Fallen an, was zu einer bakteriellen Musterbildung führt.

Spülen Sie den Kanal kontinuierlich mit einer vorgewärmten, nährstoffreichen Brühe.

Die Bakterien nehmen ihr Wachstum wieder auf und bilden Mikrokolonien in den Fallen.

Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um Zeitrafferbilder aufzunehmen und das Bakterienwachstum in einer kontrollierten Umgebung zu analysieren.

Pipettieren Sie einen Milliliter MOPS-Medium in ein Zentrifugenfläschchen und fügen Sie 10 Mikroliter 0,132 molares Kaliumphosphat hinzu.

Aliquotieren Sie 100 Mikroliter der Übernachtkultur in das Zentrifugenfläschchen und zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.300 mal g für zwei Minuten. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, um das Pellet in einem Milliliter frischem MOPS-Medium mit 0,015 % Tween 20 und 0,01 % Kaliumphosphat zu resuspendieren, und laden Sie die Bakteriensuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze. Um die Spritze und den Schlauchanschluss zu sichern, führen Sie direkt eine Nadel in den Schlauch ein.

Montieren Sie nun die Spritze auf die Spritzenpumpe und injizieren Sie die Suspension durch den Einlass im stromaufwärts gelegenen Teil des Kanals in den Mikrofluidik-Chip, bis die Suspension den Template-Bereich mit Fallen bedeckt. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 0,07 bis 0,2 Mikrolitern pro Minute ein, um die Bakteriensuspension zu entnehmen und den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware zu überwachen. Sobald die Schablone mit Zellen strukturiert wurde, erhöhen Sie die Entnahmeflussrate, um den mikrofluidischen Kanal schnell zu entleeren und ihn mit frischem LB zu spülen, das zuvor mindestens 30 Minuten lang entgast und auf 30 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Stellen Sie nun die Spritzenpumpe auf eine Durchflussmenge von zwei Mikrolitern pro Minute ein, um den Kanal schonend zu spülen. Sobald der Kanal gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussmenge erneut. Nehmen Sie Bilder von wachsenden Bakterien in der gewünschten Vergrößerung und im gewünschten Zeitintervall auf.