Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da wir jetzt auf der Nanoskala Echtzeitprozesse visualisieren können. Verbessertes Wissen über diese flexiblen Strukturen kann uns helfen, neuartige Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 zu entwickeln. Die Betrachtung von Proteinen in einer flüssigen Umgebung hilft, biologische Systeme nachzuahmen und gibt uns die Möglichkeit, die Proteine dynamischer zu betrachten.

Und dieses Experiment zeigt Ihnen neue Techniken, wie Sie Proteine sowohl in Glaseis als auch in flüssigen Umgebungen verwenden und visualisieren können. Zu den jüngsten Ergebnissen gehören dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten in Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet werden. Korrelative Flüssigkeits- und Kryo-EM-Anwendungen verbessern unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für die menschliche Gesundheit und Krankheit.

Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Implementierung flüssiger EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise zu ermöglichen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt. Handelsübliche Flüssigkeits-EM-Systeme können Durchfluss, Mischen, elektrochemische Stimuli und Temperaturregelung bereitstellen, die für viele Echtzeit-Bildgebungsanwendungen unerlässlich sind. Die hier vorgestellte Mikrochip-Sandwich-Methode beschreibt eine einfache Einstiegsmöglichkeit, Proben zunächst in Flüssigkeit zu betrachten, bevor der Sprung zu einem komplexeren kommerziellen System für In-situ-Experimente erfolgt.

Reinigen Sie zunächst die Siliziumnitrid-Mikrochips, indem Sie jeden Chip zwei Minuten lang in 150 Milliliter Aceton inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 Milliliter Methanol für zwei Minuten. Lassen Sie die Späne in einem laminaren Luftstrom trocknen. Plasmareinigen Sie die getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen 45 Sekunden lang mit Argongas betrieben wird.

Als nächstes laden Sie einen trockenen Basis-Mikrochip in die Spitze des Probenhalters und fügen dem Basischip etwa 0,2 Mikroliter der Probe hinzu. Nach einer Inkubation von ein bis zwei Minuten legen Sie den oberen Chip auf den nassen Basischip, der die Probe enthält. Setzen Sie die Baugruppe zu einem hermetisch abgeschlossenen Gehäuse zusammen, das mechanisch von drei Messingschrauben gehalten wird.

Pumpen Sie die Spitze mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10 auf minus sechs Torr. Die Halterung ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Plasma reinigt die Mikrochips und Kohlenstoffgitter mit einem Glimmentladungsinstrument für 45 Sekunden.

Und fügen Sie etwa zwei Mikroliter Probe zu einem Glow-entladenen Mikrochip hinzu, der auf einer Gelpackung platziert ist. Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier oder einer Pipette und inkubieren Sie für ein bis zwei Minuten. Fügen Sie dann das glühend entladene Kohlenstoffgitter zu dem nassen Mikrochip hinzu, der die Probe enthält.

Setzen Sie die Baugruppe mit einem einzigen Kippprobenhalter bei Raumtemperatur zusammen, um ein hermetisch abgeschlossenes Gehäuse zu bilden. Alternativ können Sie Autoloader-Rasterclips verwenden und die Sandwichbaugruppe auf den unteren C-Clip legen. Legen Sie den oberen Clip auf die Baugruppe und verwenden Sie das Standardspannwerkzeug, um die Baugruppe zusammenzuschließen.

Die Probe ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Untersuchen Sie Proben, die in Autoladern unter Kryobedingungen oder bei Raumtemperatur platziert werden. Für die Flüssigkeits-EM-Bildgebung laden Sie den Probenhalter in den TEM, der mit einer Feldemissionspistole ausgestattet ist, und arbeiten mit 200 Kilovolt.

Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches in Bezug auf die Probe ein, indem Sie die Wobbler-Funktion verwenden, wobei die Probe von minus 15 Grad auf plus 15 Grad in der Säule geneigt wird. Dieses Verfahren passt den Tisch in Z-Richtung an die Probendicke an und trägt zu einer genauen Vergrößerung während der Bildaufnahme bei. Nehmen Sie Bilder als lange gerahmte Filme oder einzelne Bilder mit dem Softwarepaket zur seriellen Datenerfassung auf und implementieren Sie automatisierte Bildbearbeitungsroutinen.

Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit Vergrößerungen von 28, 000X bis 92, 000X und 40 Bildern pro Sekunde auf. Passen Sie die Belichtungszeiten an, um Strahlschäden an der Probe zu minimieren, und verwenden Sie einen Unschärfebereich von minus ein bis vier Mikrometern bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird, verwenden Sie höhere Defokussierungswerte oder wählen Sie einen anderen Bereich von Interesse aus.

Stellen Sie sicher, dass die Lösung während der gesamten Bildgebungssitzung in den Proben vorhanden ist, indem Sie den Elektronenstrahl auf einen Opferbereich fokussieren, der nicht für die Datenerfassung verwendet wird, bis Blasen gebildet werden. Analysieren Sie Filme auf SARS-CoV-2-Partikel mit dem Programm RELION-3.0.8 oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware. Führen Sie die Bewegungskorrektur mit dem Programm MotionCor2 durch.

Nach der Korrektur extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool im Programmsoftwarepaket. Typische Kartongrößen sind 330 Pixel für flüssige Proben und 350 Pixel für Eisproben. Berechnen Sie die anfänglichen Rekonstruktionen unter Verwendung der C1-Symmetrie mit der 3D-Anfangsmodellroutine des Programms und den ab initio-Modelloptionen im Datenverarbeitungssoftwarepaket.

Führen Sie dann Verfeinerungsprotokolle in der Datenverarbeitungssoftware durch. Untersuchen Sie die Ergebnisse mit einem Softwarepaket für die Molekularstrukturanalyse und bewerten Sie dynamische Veränderungen. Ein Vergleich von Flüssig-EM- und Kryo-EM-Strukturen im adeno-assoziierten Virussubtyp drei oder AAV wird hier gezeigt.

Die repräsentativen Bilder zeigen die Struktur von AAV in der Lösung und im Eis. Die Rotationsansichten der AAV VP1-Untereinheit, die aus den Flüssigkeits- und Eisstrukturen extrahiert wird, sind hier dargestellt. Diese Bilder stellen die dynamischen Werte in den flüssigen Strukturen dar, die mit der Morph-Map-Funktion in der Molekularstrukturanalyse-Software erzeugt werden.

Die durchschnittlichen Strukturen aus mehreren Virusanordnungen zeigen Konformationsänderungen mit einer Durchmesseränderung von fast 5%, gemessen anhand von EM-Daten. Ein Bild von subviralen SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus Serumfraktionen von COVID-19-Patienten isoliert wurden, ist hier gezeigt. Diese weißen Blasen zeigen das Vorhandensein von Flüssigkeit in der Probe an.

Eine EM-Rekonstruktion dieser subviralen Anordnungen ist hier mit farbigen radialen Dichten bei fünf Nanometerscheiben durch die Karte dargestellt. Das repräsentative Bild beschreibt die Analyse von Rotavirus-Doppelschichtpartikeln, die in Glaseis mit der Mikrochip-Sandwich-Technik hergestellt wurden. Die Verwendung von Reinigungsmitteln, Glycerin, Polyethylen, Glykolen und hohem Zuckergehalt sollte für die Flüssig-EM-Bildgebung minimiert oder vermieden werden.

Diese Reagenzien können Artefakte einführen, übermäßiges Sprudeln, Hydrolyseprodukte und freie Radikale aufgrund von Strahlschäden erzeugen. Die Verwendung dieser Protokolle wird es Wissenschaftlern ermöglichen, dynamische Prozesse im atomaren Detail zu untersuchen. Und dies erstreckt sich über mehrere Bereiche der Wissenschaft, einschließlich Medizin, Biowissenschaften und Materialforschung.

Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben, wie modernste Werkzeuge ein spannendes Mittel darstellen können, um biologische Makromoleküle mit neuen Augen sichtbar zu machen. Das Feld der Flüssigelektronenmikroskopie könnte die Untersuchung dieser neuartigen Viren, die eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen, verbessern und vielleicht sogar zu unseren Pandemievorsorgemaßnahmen beitragen.