Röntgenvisualisierung einer intraduktalen ethanolbasierten ablativen Behandlung zur Prävention von Brustkrebs in Rattenmodellen

Brustkrebs ist eine weit verbreitete und tödliche Krankheit mit begrenzten Präventionsstrategien, die mit schweren negativen Nebenwirkungen einhergehen. Um eine Methode mit reduzierten Nebenwirkungen bereitzustellen, haben wir eine Technik zur intraduktalen Injektion einer ethanolbasierten ablativen Lösung in den Milchbaum der Ratte entwickelt, die eine gleichzeitige In-vivo-Bildgebung und Brustkrebsprävention ermöglicht. Dies baut auf früheren Arbeiten an Mäusen auf, bei denen die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung es ermöglicht, Brustepithelzellen mit minimalen Kollateralgewebeschäden anzugreifen.

Sowohl Mäuse als auch Ratten haben Brustdrüsen, die einen einzigen duktalen Baum enthalten, der aus der Brustwarzenöffnung stammt. Ratten sind größer als Mäuse und ermöglichen die Injektion einer größeren Menge Ethanol zur Untersuchung des Ablationserfolgs, um die Skalierbarkeit des Modells zu beweisen. Eine weitere Verfeinerung dieser Methode ist die Zugabe von Ethylcellulose zur ablativen Lösung.

Ethylcellulose wurde zuvor in anderen klinischen Ansätzen verwendet, um die Ausbreitung von Ethanol außerhalb des Zielbereichs zu reduzieren. Dies wird durch die Art der Verbindung erreicht, die dazu führt, dass sie geliert, wenn sie Flüssigkeit im Gewebe berührt. Es gibt fünf wichtige Schritte in dieser Methode der bildverifizierten Brustkrebsprävention.

Wir müssen zuerst beginnen, Tiere mit Carprofen oral zu dosieren, indem wir im Labor hergestellte Sucralose-Gelbecher verwenden. Diese erweiterte entzündungshemmende Behandlung wird prä- und postprozedural aufrechterhalten. Als nächstes entfernen wir das Fell aus dem Bereich um die Brustwarzen, um mit Enthaarungscreme injiziert zu werden, um das Tier für Injektionen vorzubereiten.

Intraduktale Injektionen werden dann mit einem Stereoskop durchgeführt, das die Visualisierung der Brustwarzenöffnung für das Einführen der Nadel unterstützt. Die Tiere werden nach der Injektion gescannt oder mittels MikroCT oder Durchleuchtung beurteilt, um den Erfolg der Injektionen zu bestimmen. microCT-Scans können dann verarbeitet werden, um 3D-Rekonstruktionen des injizierten Brustduktalbaums zur weiteren Analyse der erfolgreichen Füllung zu erstellen.

Stock Carprofen wird zunächst in PVS auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Steriler Lebensmittelfarbstoff kann der Mischung zugesetzt werden, um das vollständige Mischen des Arzneimittels in die Sucralose des Bechers besser zu bestätigen. Tassen werden dann in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius für 15 Minuten erhitzt.

Das Trocknen der Becher nach dem Entfernen und das Reinigen des Becherdeckels mit 70% Ethanol reduziert das Risiko einer Kontamination. Carprofen-Lösung kann mit einer Spritze direkt in den Becher injiziert werden, um den Deckel zu durchstechen. In diesem Fall müssen wir 500 Mikroliter für das gewünschte Ergebnis injizieren.

Verschließen Sie das Loch mit einem Aufkleber, bevor Sie den Becher 15 Sekunden lang schütteln und dann weitere 15 Sekunden lang wirbeln. Eine homogene Durchmischung kann beurteilt werden, indem nach dunkelblauen Klumpen gesucht wird. Becher können dann gekühlt werden, bis sie benötigt werden.

Die Tiere sollten zwei bis drei Tage vor der Injektion vorbereitet werden. Betäuben Sie das Tier mit dem Inhalationsmittel Isofluran. Übertragen Sie die betäubte Ratte auf einen Nasenkegel auf einem Wärmekissen.

Tragen Sie Augenschmiermittel auf die Ratte auf, während Sie sich am Nasenzapfen befinden, und positionieren Sie das Tier dann auf dem Rücken. Enthaarungscreme kann auf den Bereich der Brustwarzen aufgetragen werden, den Sie mit einem Baumwollapplikator injizieren möchten. Eine schnellere Lockerung des Fells kann erreicht werden, indem der Applikator im gewünschten Bereich über die Haut des Tieres auf und ab gerieben wird.

Es ist wichtig, die Creme so wenig Zeit wie möglich auf der Ratte zu lassen, um eine Verbrennung der Haut zu vermeiden. Ratten reagieren noch empfindlicher auf dieses Verfahren als Mäuse. Verwenden Sie nach 10 bis 30 Sekunden Anwendung warmes Wasser auf Gaze, um die Creme vollständig zu entfernen.

Verwenden Sie drei bis vier Spülungen, um eine vollständige Entfernung zu gewährleisten, bevor Sie die Haut mit sauberer Gaze trocknen. Bestätigen Sie gute Sicht und Zugang zu den Brustwarzen in den Bereichen der Fellentfernung. Wiederholen Sie den Enthaarungsvorgang, falls erforderlich.

Setzen Sie die Ratte in einen sauberen Erholungskäfig auf einem Wärmekissen, um sich von der Narkose zu erholen. Geben Sie einen Carprofen-Becher an vorbereitete Ratten in ihrem Heimkäfig nach der Genesung. Sie beginnen mit der Anästhesie des Tieres mit der inhalativen Isoflurananästhesie und bewegen die Ratte zu einem Nasenkegel, sobald sie vollständig induziert wurde.

Augengleitmittel sollte aufgetragen werden, bevor das Tier für Injektionen auf den Rücken gelegt wird. Es kann hilfreich sein, die Beine in der Nähe der Brustwarzen abzukleben, die injiziert werden, aber nicht notwendig sind. Nachdem Sie die Spritze mit dem gewünschten Volumen der Injektionslösung vorbereitet haben, bereiten Sie die Brustwarze vor, indem Sie sichtbare abgestorbene Haut nach Möglichkeit mit einer feinen Pinzette entfernen.

Der häufigste Problembereich ist die Nippelöffnung selbst. Ratten haben oft einen Pfropfen, der aus der Öffnung herausragt. Das Entfernen dieses Plugs kann zu einer besseren Kanülierung beitragen.

Wenn die Abschrägung der Nadel sichtbar ist, führen Sie die Nadel mit Hilfe von feinspitzen Pinzetten in die Spitze des Nippels ein. Achten Sie darauf, dem Weg der Brustwarzenöffnung zu folgen. Rattennippel neigen dazu, mehr Fett um die Öffnung herum zu haben, was es einfacher macht, in dieses Fett einzudringen und fälschlicherweise zu glauben, dass Sie aufgrund des Vorrückens der Nadel eine Kanülierung erreicht haben.

Sobald die Nadelabschrägung vollständig von der Brustwarze umgeben ist, beginnen Sie langsam mit der Injektion der Lösung. Die gewünschte Rate beträgt bei Ratten etwa 100 Mikroliter pro Minute. Vermeiden Sie eine schnellere Injektion, um mögliche Schäden am duktalen Baum zu vermeiden.

Warten Sie nach vollständiger Injektion 30 Sekunden, bevor Sie die Nadel mit Hilfe der Pinzette aus der Brustwarze entfernen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit eines Auslaufens aus der Brustwarze. Wenn eine Leckage auftritt, verwenden Sie angefeuchtete Gaze oder ein Ethanoltuch, um die Lösung zu reinigen.

Kontrast und verschüttete Lösung können die aufgenommenen Bilder verzerren. Hier sehen wir ein vergrößertes Video der Injektionssequenz, die gerade angezeigt wurde. Beachten Sie, dass die Atmung des Tieres es schwierig macht, die Brustwarze in einer einzigen Fokusebene zu halten.

Dies kann die Injektion erschweren, da die Brustwarze nicht an einer konstanten Stelle verbleibt. Dieses Problem wird durch die Nähe zum Brustkorb und den oberen drei Drüsenpaaren verschärft. Der Stopfen in der Nippelöffnung wurde nun zur besseren Kanülierung entfernt.

Die Nadel kann nun abgeschrägt ausgerichtet werden, um mit Hilfe der Pinzette in den Nippel vorgeschoben zu werden. Sobald die Fase vollständig eingesetzt ist, kann die Injektion beginnen. Wenn Sie sorgfältig auf die linke Seite der Brustwarze schauen, bemerken Sie möglicherweise eine Zunahme der Blautönung, bei der die Injektionslösung leicht sichtbar ist und sich durch den duktalen Baum ausbreitet.

Dies ist bei der Ratte aufgrund der dickeren Haut viel weniger sichtbar. Hier können wir sehen, wie die Nadel 30 Sekunden nach Abschluss der Injektion entfernt wird und die resultierende Lösung aus der Brustwarze austritt. Die zusätzliche Lösung wird gereinigt, so dass der Bereich beurteilt werden kann, in dem wir kein Trauma an der Brustwarze oder dem Doming des Bereichs sehen, was auf eine Fettpolsterinjektion hinweisen würde.

Bei der Injektion einer Lösung, die Ethanol enthält, muss darauf geachtet werden, eine Alkoholvergiftung zu vermeiden. Dies erfordert zu wissen, wie viel Ethanol in einer Sitzung injiziert werden kann, und die Verabreichung von Saccharose-haltiger Lösung IP während des Verfahrens, um den Auswirkungen entgegenzuwirken. Nach der Injektion können die Tiere in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen geborgen oder zur Bildgebung des Injektionserfolgs in die MikroCT gebracht werden.

Nachdem Sie das injizierte Tier in das microCT-Instrument gebracht haben, fahren Sie mit der Verabreichung von Isofluran fort, um die Anästhesie während der Bildgebung aufrechtzuerhalten. Die vergrößerte Größe der Ratte erfordert eine zusätzliche Positionsmanipulation, um ein gutes Bild zu erzielen. Das Begradigen der Wirbelsäule vor dem Abkleben der Beine in der Nähe der zu fotografierenden Stelle ist hilfreich, um konsistente Bilder zu erzeugen.

Das Tapen von Beinen in einer ausgestreckten Position kann verhindern, dass Knochen zum Brennpunkt des Bildes werden. Wir haben auch festgestellt, dass das Tapen über den Bauch der Ratte bei der Reduzierung des Atemartefakts für die unteren Drüsen helfen kann. Mehrere Scanparameter sind für die Visualisierung der duktalen Behandlung akzeptabel.

Bei der Auswahl der Parameter sollte jedoch immer die Strahlendosis berücksichtigt werden. Die Strahlendosis, die sich aus diesen Scans ergibt, sollte die Strahlengrenzwerte für einen bestimmten Rattenstamm nicht überschreiten. Die Durchleuchtungsanalyse anstelle der Bildaufnahme kann die Gesamtstrahlenbelastung erheblich reduzieren.

Sobald alle Scans oder Bewertungen durchgeführt wurden, kann das Tier in einen sauberen Erholungskäfig auf einem Wärmekissen zurückgebracht werden. Das Tier sollte überwacht werden, bis es vollständig genesen und in den heimischen Käfig zurückgebracht wird. Carprofen-Becher sollten bis mindestens sieben Tage nach der Injektion zur Verfügung gestellt werden.

Die Software des von uns verwendeten microCT-Instruments ermöglicht die Erstellung schneller Wiedergaben, um den Erfolg der Injektion ohne formale Analyse zu bewerten. Diese Funktion verfügt über einen einfachen Kontrastschieberegler, der eine angemessene Signal-Rausch-Reduzierung ermöglicht. Der Hauptfehler bei diesen Wiedergaben besteht darin, dass das gesamte Bild gleichzeitig mit einem Schwellenwert versehen werden muss.

Dadurch können helle Signale, die eindeutig nicht Teil des duktalen Baumes sind, wie Eisen in der Nahrung, im Bild verbleiben. In einigen Fällen ist das wahre Signal, wie es hier zu sehen ist, so schwach wie der Hintergrund und kann leicht aus dem Bild herausgeschoben werden. Bessere formale Wiedergaben können mit einer ausgefeilteren Analysesoftware erstellt werden, die eine Segmentierung des Interessenbereichs ermöglicht.

Es ist am besten, das Brustfettpolster für die weitere Bildverarbeitung zu segmentieren, um die beste Wiedergabe des injizierten duktalen Baumes zu erhalten. Die dunkle Grenze des Brustfettpolsters kann über die gesamte Dicke des Tieres gezogen werden, um diese Segmentierung zu erreichen. Die Verfolgung jeder dritten Scheibe und die Ausbreitung des Objekts reicht unserer Erfahrung nach aus, um den gesamten Kanal zu erfassen.

An diesem Punkt ist es möglich, die Wiedergabe mit einer bestimmten Wut zu schwellen, um nur den Kontrast anzuzeigen, der im Brustfettpolster enthalten ist. Dies sollte die Lösung innerhalb des duktalen Baumes sowie jede Leckage in unmittelbarer Nähe umfassen. Tantaloxidlösungen werden im Allgemeinen in einem Bereich von 300 bis 3000 HU gut dargestellt. Weitere Analysen können erstellt werden, sobald Sie eine Rekonstruktion des duktalen Baumes erstellt haben.

Wenn keine longitudinale Bildgebung gewünscht wird, können Bilder mit höherer Auflösung aufgenommen werden, die die komplexe Architektur des duktalen Baumes besser erfassen. Unterschiede zwischen Tieren können die Injektion mehr oder weniger schwierig machen. Wir können nicht von Stamm-zu-Stamm-Variabilität sprechen, da wir derzeit ausschließlich mit Sprague-Dawley-Ratten arbeiten.

Einige Tiere haben Brustwarzen mit niedrigem Profil, wie die hier abgebildete, was es schwierig macht, sie zu manipulieren und eine erfolgreiche Kanülierung zu erreichen. Andere werden Brustwarzen mit einem höheren Profil haben, wie die hier gezeigte, die für eine Kanülierung zugänglicher sind. Eine erfolgreich kanülierte Brustwarze ist hier dargestellt.

Schwierigkeiten bei der Kanülierung können zu einem Trauma der Brustwarze führen, wie hier gezeigt. Die Aufnahme von MikroCT-Bildern unmittelbar nach der Injektion kann Forscher besser über den Erfolg einer Injektion informieren und helfen, die Füllungseigenschaften bestimmter Lösungen zu identifizieren. Hier sehen wir verschiedene Aspekte der Bauchdrüsen derselben Ratte, die mit dem gleichen Volumen einer ablativen Lösung injiziert werden, die 70% Ethanol enthält, mit Kontrast von 100 Millimolar Tantaloxid.

Die in der gezeigten oberen Drüse verwendete Lösung enthielt ebenfalls 1% Ethylcellulose. Wir sehen wandartige Strukturen an den Enden der duktalen Äste. Dies sind endständige Endknospen, die mit der Lösung gefüllt sind und nicht überlaufen.

In der unteren Reihe sehen wir weniger definierte duktale Enden, die das Entweichen der Lösung aus dem duktalen Baum anzeigen. Dies, zusammen mit begrenzteren Kollateralschäden in der histologischen Untersuchung. scheint auf eine bessere Retention von Lösungen, die Ethylcellulose enthalten, im duktalen Baum hinzuweisen.

Diese Methode bietet einen Schritt in Richtung Skalierbarkeit einer weniger invasiven Methode der Brustkrebsprävention, um eine Alternative für die prophylaktische Mastektomie zu bieten. Eine erfolgreiche Epithelablation in einem größeren Nagetiermodell wurde mit minimalen Nebenwirkungen für das Tier nachgewiesen. Die Zugabe von Ethylcellulose zur ablativen Lösung ermöglicht eine bessere Retention der Lösung im Injektionsbereich, was zu reduzierten Kollateralschäden führt.

Der neuartige Einsatz klinisch erprobter Lösungen und die zusätzliche Fähigkeit, den Liefererfolg mit gängigen Bildgebungsmodalitäten zu visualisieren, ermöglichen eine schnelle Übersetzung in die Klinik.