Name: Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen sowie Stromazellen im murinen Knochenmark. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung endostaler und zentraler Knochenmarkregionen.

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LM wurde durch einen Zuschuss des Lady Tata Memorial Trust unterstützt. JR wurde durch ein Promotionsstipendium der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-Stipendium UI/BD/150833/2021). ML wurde durch ein PhD-Stipendium der FCT (FCT-Stipendium 2021.04773.BD) unterstützt. DD wurde durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) und der Portugiesischen Gesellschaft für Hämatologie unterstützt. Wir danken Dr. Catarina Meireles und Emilia Cardoso von der TRACY-Einrichtung bei i3s für die Unterstützung.

Die Tiere, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden in der i3S-Tiereinrichtung unter spezifischen, erregerfreien Bedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und einer temperaturkontrollierten Umgebung untergebracht. Freier Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser wurde zur Verfügung gestellt. Alle Tiere wurden nach den Kriterien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations für die Pflege und den Umgang mit Versuchstieren (EU-Richtlinie 2010/63/EU) artgerecht versorgt. Das an den Tieren durchgeführte Versuchsverfahren (Euthanasie) wurde von der i3S-Tierethikkommission (Ref. DD_2019_15) und der Direção-Geral de Alimentação e Veterinária genehmigt. Einzelheiten zu den Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle.
1. Zubereitung von Lösungen und Färbecocktails
<ol><li>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): Lösen Sie fünf PBS-Tabletten in 1 l destilliertem Wasser auf. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.</li>
	<li>PBS 2% fetales Kälberserum (FBS): Fügen Sie 10 ml FBS zu 500 ml PBS hinzu. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Lysepuffer für rote Blutkörperchen (1x): Fügen Sie 50 ml 10x RBC-Lysepuffer zu 450 ml deionisiertem Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Kollagenase IV und Dispase II-Lösung: Lösen Sie 30 mg Kollagenase IV und 60 mg Dispase II in 30 ml HBSS für eine 1 mg/ml Kollagenase IV und 2 mg/ml Dispase II-Lösung. Vor Gebrauch frisch zubereiten.</li>
	<li>Fc-Rezeptor-blockierende Lösung: Fügen Sie 10 μl gereinigten Anti-Maus-CD16/32-Antikörper zu 490 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Färbelösung für fluoreszierende Zellviabilitätsfarbstoffe: Fügen Sie 2 μl fluoreszierenden Zellviabilitätsfarbstoff zu 1 ml PBS hinzu. Vor Gebrauch frisch zubereiten.</li>
	<li>Biotin-Abstammungscocktail: Mischen Sie 100 μl von jedem der folgenden Antikörper: Biotin-Anti-Maus-CD3ε, Biotin-Anti-Maus-CD4, Biotin-Anti-Maus-CD8a, Biotin-Anti-Maus/Human-CD11b, Biotin-Anti-Maus/Human-CD45R/B220, Biotin-Anti-Maus-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) und Biotin-Anti-Maus-TER-119/erythroide Zellen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	<li>HSCs primärer Färbecocktail: Fügen Sie 10 μl Biotin-Lineage-Cocktail, 10 μl immunfluoreszenzmarkiertes 510 Anti-Maus-CD150 (SLAM), 10 μl Phycoerythrin (PE) Anti-Maus-Flk2 (CD135), 10 μl Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP) Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/Cyanin-7-Anti-Maus-CD48 und 10 μl Allophycocyanin (APC)/Cyanin-7-Anti-Maus-CD117 (c-kit) zu 940 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.</li>
	<li>Stromaler Primärfärbecocktail: Fügen Sie 5 μl Mäuse-Leptin-R-Biotinylierungsantikörper, 6,7 μl PE-Anti-Maus-Endomuzin-Antikörper, 10 μl PerCP-Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 4 μl PE/Cyanin7-Anti-Maus-CD31, 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-CD45 und 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-TER-119/erythroid-Zellen zu 954 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.</li>
	<li>HSCs/stromale Sekundärfärbelösung: 1 μl APC-Streptavidin zu 1 ml PBS 2% FBS geben. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.</li>
	<li>ECs-Färbecocktail: Fügen Sie 10 μl PE-Anti-Maus-Endomucin-Antikörper, 10 μl PerCP-Anti-Maus-Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/Cyanin7-Anti-Maus-CD31, 10 μl Alexa Fluor 647 Anti-Maus-CD54/ICAM-1, 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-CD45 und 10 μl APC/Cyanin7-Anti-Maus-TER-119/erythroide Zellen zu 940 μl PBS 2% FBS hinzu. Frisch oder am Vortag zubereiten. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lichtgeschützt lagern.</li>
	<li>DAPI-Färbelösung: Geben Sie 1 Tropfen DAPI-Reagenz auf 500 μl PBS. Vor Gebrauch frisch zubereiten.</li>
</ol>2. Probenentnahme
<ol><li>Euthanasieren Sie das Tier durch Zervixluxation (Einzelheiten zu den Tieren, die zur Herstellung der in dieser Studie vorgelegten Daten verwendet wurden, finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1). Legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben auf eine Petrischale und besprühen Sie es mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Bauch und ziehen Sie die Haut bis zu den Knöcheln weg.</li>
	<li>Fassen Sie ein Bein und schneiden Sie es mit einer Schere unten (wo sich das Gelenk zwischen Bein und Hüfte befindet) ab, um es vom Tier zu trennen. Dieser Schritt wird auch als sekundäre Bestätigungsmethode der Euthanasie dienen. Entfernen Sie den Fuß vom Bein, indem Sie am Knöchel schneiden. Legen Sie das Bein in eiskaltes PBS 2% FBS. Wiederholen Sie den Schritt bei Bedarf mit dem anderen Bein.</li>
	<li>Fassen Sie den Hüftknochen und trennen Sie ihn mit einer Schere dahinter vom Tier. Legen Sie den Hüftknochen in eiskaltes PBS 2% FBS. Wiederholen Sie den Schritt bei Bedarf mit dem anderen Hüftknochen.</li>
	<li>Legen Sie die Beine und Hüftknochen in eine Petrischale und reinigen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell. Trennen Sie Schien- und Oberschenkelknochen, indem Sie mit dem Skalpell am Knie schneiden. Legen Sie die sauberen Knochen in eiskaltes PBS 2% FBS.</li>
</ol>3. Probenaufbereitung zur Analyse hämatopoetischer Zellpopulationen im gesamten Knochenmark
<ol><li>Legen Sie einen Oberschenkelknochen oder ein Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken. BM-Zellen werden in die im Mörtel enthaltene Lösung freigesetzt.</li>
	<li>Die resultierende Zellsuspension wird mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettiert, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-μm-Zellsieb, das auf das Röhrchen gelegt wird, in ein 50-ml-Röhrchen zu überführen.</li>
	<li>Wenn die zerkleinerten Knochen zu diesem Zeitpunkt nicht weiß aussehen, geben Sie mehr PBS 2% FBS in den Mörser und wiederholen Sie das Zerkleinern, pipettieren Sie dann auf und ab und übertragen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.</li>
	<li>Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2% FBS ab und geben Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen durch dasselbe 40-μm-Zellsieb. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer (1x) bei RT durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Nach einer 2-minütigen Inkubation bei RT werden 15 ml PBS 2% FBS hinzugefügt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Wenn das Zellpellet immer noch rötlich aussieht, fahren Sie mit Schritt 3.5 fort. Wenn nicht, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 200 μl fluoreszierender Farbstofffärbelösung resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Zentrifugenplatte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet zum Waschen in 200 μl PBS 2% FBS resuspendieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl Fc-Rezeptor-Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 4 °C vor Licht geschützt.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl HSCs primärem Färbecocktail. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl HSCs sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren. HINWEIS: Wenn Sie daran interessiert sind, die absolute Anzahl der hämatopoetischen Zellpopulationen zu bestimmen, fügen Sie den Polystyrolröhrchen vor der Analyse im Zytometer Calibrite Beads hinzu16.</li>
</ol>4. Probenaufbereitung zur Analyse von Stromazellpopulationen im gesamten Knochenmark
<ol><li>Legen Sie einen Oberschenkelknochen oder ein Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken. Schneiden Sie die Spitze einer P1000-Spitze mit einer Schere ab und füllen Sie damit den gesamten Inhalt des Mörtels in ein 50-ml-Röhrchen (nicht durch ein Zellensieb passieren).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Kollagenase IV und Dispase II-Lösung. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 40 min.</li>
	<li>Füllen Sie das Röhrchen auf 25 ml mit PBS 2% FBS auf und wirbeln Sie es zum Mischen. Übertragen Sie den Inhalt des 50-ml-Röhrchens durch ein 100-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 15 ml PBS 2% FBS in das alte 50-ml-Röhrchen und übertragen Sie die Lösung durch dasselbe Zellsieb in dasselbe neue 50-ml-Röhrchen. Bei 500 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer (1x) bei RT durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Nach einer 2-minütigen Inkubation bei RT werden 15 ml PBS 2% FBS hinzugefügt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Wenn das Zellpellet immer noch rötlich aussieht, fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Wenn nicht, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS 2% FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Wenn Sie eine Stromafärbung durchführen, fahren Sie mit Schritt 4.7 fort. Wenn Sie eine EC-Färbung durchführen, fahren Sie mit Schritt 4.12 fort.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 100 μl stromalen primären Färbecocktail resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl stromaler sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller auf saugfähiges Papier werfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Auf dem Eis lichtgeschützt aufbewahren.</li>
	<li>Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das Röhrchen mit der Zellsuspension für die Durchflusszytometrieanalyse und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen und das Pellet in 100 μl ECs-Färbecocktail resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller auf saugfähiges Papier werfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Auf dem Eis lichtgeschützt aufbewahren.</li>
	<li>Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das Röhrchen mit der Zellsuspension für die Durchflusszytometrieanalyse und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren. HINWEIS: Wenn Sie daran interessiert sind, die absolute Anzahl der Stroma- und Endothelzellpopulationen zu bestimmen, fügen Sie den Polystyrolröhrchen vor der Analyse im Zytometer Calibrite Beads hinzu16.</li>
</ol>5. Probenaufbereitung zur Analyse hämatopoetischer Zellpopulationen in zerkleinerter und gespülter BM
<ol><li>Legen Sie einen Oberschenkelknochen auf eine Petrischale und schneiden Sie die Knochenenden mit einem sterilen Skalpell ab.</li>
	<li>Spülen Sie den zentralen Teil des Knochens (Diaphyse), indem Sie 100 μl PBS 2% FBS einmal von jeder Seite mit einer 0,5-ml-Insulinspritze ohne Totvolumen durch das Innere des Knochens führen und die Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS 2% FBS auffangen. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen überführt, das als gespültes BM gekennzeichnet ist und 4 ml PBS 2% FBS enthält. Auf Eis bleiben.</li>
	<li>Die Enden des Knochens in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2% FBS geben und mit dem Stößel leicht gegen die Mörserwand drücken. Die resultierende Zellsuspension wird mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettiert, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen zu überführen, das als zerkleinerte BM gekennzeichnet ist.</li>
	<li>Wenn der zerkleinerte Knochen zu diesem Zeitpunkt nicht weiß aussieht, geben Sie mehr PBS 2% FBS in den Mörser und wiederholen Sie das Zerkleinern. Pipettieren Sie dann auf und ab und übertragen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen (zerkleinerter BM) durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.</li>
	<li>Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2% FBS ab und überführen Sie die Lösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen (zerkleinerte BM) durch dasselbe 40-μm-Zellsieb.</li>
	<li>Die 50-ml-Röhrchen, die den gespülten und zerkleinerten Proben entsprechen, werden bei 500 x g 3 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 3.5 bis 3.13 (Abschnitt 3) mit den gespülten und zerkleinerten BM-Proben.</li>
</ol>6. Vorbereitung von Einfarbenkontrollen (SCCs) für die durchflusszytometrische Analyse
<ol><li>Befolgen Sie die Schritte 3.1 bis 3.6 (Abschnitt 3) mit einem zusätzlichen Knochen von einem der Tiere, die nicht für die Hauptanalyse verwendet wurden, und übertragen Sie die endgültige Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml PBS 2% FBS enthält, anstatt in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspension in 8 Vertiefungen einer 96-Well-V-Bodenplatte, 100 μl in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 100 μl PBS 2 % FBS, das als DAPI-SCC gekennzeichnet ist, und die verbleibende Zellsuspension in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 100 μl PBS 2 % FBS, das als ungefärbt gekennzeichnet ist. Bewahren Sie die Röhren auf Eis lichtgeschützt auf.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Überstände, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie ein Pellet in 100 μl Fluoreszenzfarbstoff-Färbelösung und die restlichen in 100 μl PBS 2% FBS.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 μl der folgenden Antikörper hinzu, mit Ausnahme des Lineage-Cocktails von Antikörpern, für die 2 μl hinzugefügt werden, und des PECy7 CD31-Antikörpers, für den 0,3 μl hinzugefügt werden, zu jedem der Wells mit Zellsuspension in PBS 2% FBS (ein Antikörper pro Well, dieselben Antikörper, die in den Hauptanalysepanels verwendet werden, oder dieselben Fluorophor-Antikörper mit ähnlicher Fluoreszenzintensität und Epitophäufigkeit): Biotin-Lineage-Cocktail, immunfluoreszenzmarkiert 510 Anti-Maus CD150 (SLAM), PE Anti-Maus Flk2 (CD135), PerCP Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1), immunfluoreszenzmarkiert 647 Anti-Maus CD54/ICAM-1, PE/Cyanin7 Anti-Maus CD48 und APC/Cyanine7 Anti-Maus CD117 (c-kit). Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl PBS 2% FBS in jede Vertiefung und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um sie zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Überstände, indem Sie die Platte auf saugfähiges Papier drehen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie alle Pellets mit Ausnahme des Pellets, das den Zellen entspricht, die mit dem Lineage-Cocktail von Antikörpern in 180 μl PBS 2% FBS inkubiert wurden, und überführen Sie die Zellsuspensionen in 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen durch 40-μm-Zellsiebe. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die mit dem Lineage-Cocktail von Antikörpern inkubierten Zellen in 100 μl HSCs/stromaler sekundärer Färbelösung. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl PBS 2% FBS hinzu und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um es zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 180 μl PBS 2% FBS und überführen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Bis zur Analyse der Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
	<li>Kurz bevor Sie zum Zytometer gehen, geben Sie 35 μl DAPI-Färbelösung in das DAPI-SCC-Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 5 Minuten im Dunkeln. Nach dieser Inkubation bis zur durchflusszytometrischen Analyse lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Während das beschriebene Protokoll einfach und leicht durchzuführen ist, sollte besonderen Wert auf bestimmte Schritte gelegt werden. Beispielsweise sollte bei der Gewinnung von gespültem BM (Schritt 5.2) das Volumen oder die Anzahl der Male, die angegeben sind, um PBS 2% FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens zu passieren, nicht überschritten werden, da dies zu einer erheblichen Kontamination der gespülten Probe durch endosteale Zellpopulationen führen kann.
Änderungen am Proto...

Die Durchflusszytometrie ist eine unschätzbare Methode zur Charakterisierung und prospektiven Isolierung von Immun- und hämatopoetischen Zellen. Es wird auch zunehmend zur Analyse von Stroma- und Epithelpopulationen verschiedener Gewebe eingesetzt. Die hämatopoetische Stammzelle (HSC) hat einzigartige Eigenschaften der Selbsterneuerung und Multipotenz. Bei erwachsenen Säugetieren befinden sich HSZ hauptsächlich im Knochenmark (BM), wo sie Ruhe- und Überlebenssignale aus der umgebenden Mikroumgebung oder Nische1 erhalten. HSCs werden formal nach funktionellen Assays2 definiert. Nichtsdestotrotz haben mehrere wegweisende Arbeiten die Nützlichkeit der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von HSZ gezeigt. Durch die Verwendung von begrenzten Zelloberflächenmarkern ist es möglich, hämatopoetische Populationen zu unterscheiden, die stark an HSZ angereichert sind3. Die Durchflusszytometrie ist daher eine zentrale Methode im Stammzellbereich. Es wurde ausgiebig verwendet, um den Einfluss von vermeintlichen Nischenzelltypen und Nischenfaktoren auf HSZ zu bewerten. Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit Bildgebung und funktionellen Assays konnte gezeigt werden, dass HSZ entscheidend durch perivaskuläre mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Endothelzellen (ECs) unterstützt werden. BM-MSCs sind eine heterogene Gruppe und haben unterschiedliche Zytokinbeiträge4, aber es ist allgemein bekannt, dass Leptinrezeptoren (LepR)+ MSCs wichtige Nischenzellen sind1. BM ECs sind ebenfalls sehr heterogen und können Teil von Sinusoiden, Arteriolen und Typ H/Übergangsgefäßensein 5. Verschiedene Studien haben den nuancierten Beitrag dieser verschiedenen ECs gezeigt. Zum Beispiel befinden sich endosteale sinusoidale ECs räumlich näher an ruhenden HSCs6, während nicht-migratorische HSCs mit geringeren Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in der Nähe von arteriolären ECs7 lokalisiert sind. Die endosteale versus zentrale Lage von Nischen ist ebenfalls sehr wichtig. Endosteale Typ-H-Gefäße sind mit perivaskulären Stromazellen assoziiert, die mit zunehmendem Alter verloren gehen, was zum Verlust von HSZ führt8. Bei der akuten myeloischen Leukämie sind zentrale ECs erweitert, während endosteale Gefäße und endosteale HSZ verloren gehen9.
Die meisten Studien auf diesem Gebiet haben sich auf die Hämatopoese selbst und auf die extrinsische Regulation von HSZ durch die Zelle konzentriert. Es wurde jedoch zunehmend erkannt, dass es notwendig ist, die Nischen, die andere Vorläuferzellen regulieren, nämlich die multipotenten Vorläuferzellen (MPPs), besser zu charakterisieren, insbesondere wenn man bedenkt, dass sie die Haupttreiber der Hämatopoese im stationären Zustand sind10. Im Gegensatz zu einer festen hierarchischen Struktur haben neuere Studien gezeigt, dass die Hämatopoese ein Kontinuum ist, in dem sich HSZ in einem frühen Stadium zu verzerrten MPPs differenzieren11. MPPs wurden nach verschiedenen Klassifikationsschemata benannt12, aber ein kürzlich veröffentlichtes Konsensuspapier der Internationalen Gesellschaft für experimentelle Hämatologie (ISEH) schlug vor, MPPs als frühe MPPs und nach ihrer lymphoiden (MPP-Ly), megakaryozytären und erythroiden (MPP-Mk/E) und myeloischen (MPP-G/M) Bias zu unterscheiden13. Der Einsatz der Durchflusszytometrie wird entscheidend sein, um die Bedeutung von BM-Nischen für die Regulation dieser Populationen weiter zu untersuchen. Aktuelle Methoden der Durchflusszytometrie verwenden variable Gating-Strategien, um HSPCs zu differenzieren und Stromazellen, nämlich ECs, anhand inkonsistenter Marker zu identifizieren. Das Ziel der aktuellen Methode ist es, einen einfachen und reproduzierbaren Workflow der BM-Färbung zur Identifizierung von HSPC-Subpopulationen, heterogenen Gruppen von ECs und LepR+ MSCs zu präsentieren. Wir glauben, dass diese Technik, obwohl sie mit den zuvor beschriebenen Methoden vergleichbar ist (siehe z.B. Referenz 14), ein aktualisiertes und einfach zu implementierendes Protokoll für die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen in den beiden funktionellen Knochenmarkbereichen, endosteal und zentralem BM 8,15, sowie von BM-Stromanischenzellen bietet.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD54/ICAM-1 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>116114</td><td></td></tr><tr><td>APC Streptavidin</td><td>BioLegend</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 Anti-Maus CD117 (c-kit) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanin7 Anti-Maus CD45 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanin7 Anti-Maus TER-119/erythroide Zellen Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus CD3&epsilon; Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus CD4 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus CD8a Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus TER-119/Erythroid Zellen Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus/Mensch CD11b Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus/Mensch CD45R/B220 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Anti-Maus CD150 (SLAM) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>115929</td><td></td></tr><tr><td>Calibrite 2 Color Beads</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>349502</tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Merck Life Science</td><td>C1889</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Merck Life Science</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert, EU-zugelassen, Südamerika Herkunft</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Maus Leptin R biotinylierter Antikörper</td><td>R& D systems</td><td>BAF497</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Reagenz mit festen Zellen (DAPI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37606</td><td>DAPI Reagenz</td></tr><tr><td>PE Anti-Maus-Endomucin-Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5851-82</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Maus Flk2 (CD135)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanin7 Anti-Maus CD31 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>102524</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanin7 Anti-Maus CD48 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>108122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten</td><td>Merck Life Science</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigter Anti-Maus CD16/32 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer 10x</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>fluoreszierender Farbstoff</td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrische analyse von hämatopoetischen stamm- und vorläuferzellen des murinen knochenmarks und stromalen nischenzellen

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Das Knochenmark (BM) ist das Weichgewebe in den Knochen, in dem hauptsächlich die Hämatopoese stattfindet, der Prozess, durch den neue Blutzellen gebildet werden. Als solches enthält es hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sowie unterstützende Stromazellen, die zur Aufrechterhaltung und Regulierung von HSPCs beitragen. Hämatologische und andere BM-Erkrankungen stören die Hämatopoese, indem sie hämatopoetische Zellen direkt und/oder durch die Veränderung der BM-Nische betreffen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Hämatopoese in Gesundheit und Malignität durch die phänotypische Analyse von murinen BM-HSPCs und stromalen Nischenpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Unsere Methode beschreibt die erforderlichen Schritte zur Anreicherung von BM-Zellen in endostealen und zentralen BM-Fraktionen sowie die geeigneten Gating-Strategien zur Identifizierung der beiden wichtigsten Nischenzelltypen, die an der HSPC-Regulation beteiligt sind, Endothelzellen und mesenchymale Stammzellen. Die hier vorgeschlagene phänotypische Analyse kann mit Mausmutanten, Krankheitsmodellen und funktionellen Assays kombiniert werden, um das HSPC-Kompartiment und seine Nische zu charakterisieren.

Repräsentative Diagramme der durchflusszytometrischen Analyse von HSCs und MPPs in einer gesunden C57Bl/6-Maus eines jungen Erwachsenen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Gating-Strategie folgt der neuesten harmonisierenden Nomenklatur, die von der ISEH13 vorgeschlagen wurde. Bei der Analyse der Auswirkungen einer Störung, wie z. B. einer Infektion oder einer Krebserkrankung, ist es wichtig, eine Kontrollmaus als Referenz für normale Gates zu verwenden. Fluoreszenz-...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks sowie von Knochenmarkstromazellen. Es kann verwendet werden, um Störungen dieser Populationen in verschiedenen Umgebungen zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen bisher beschriebenen Methoden ermöglicht diese Technik die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen, insbesondere in den beiden funktionellen Markbereichen, endostealem und zentralem Knochenmark, sowie Knochenmarkstromazellen.Legen Sie das eingeschläferte Tier zunächst mit dem Bauch nach oben auf eine Petrischale und besprühen Sie es mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Bauch und ziehen Sie die Haut bis zu den Knöcheln weg. Greifen Sie eines der Beine und schneiden Sie es unten ab, um es mit einer Schere vom Tier zu trennen.Entfernen Sie dann den Fuß vom Bein, indem Sie am Knöchel schneiden, und legen Sie das Bein in eiskaltes PBS 2%FBS. Als nächstes greifst du den Hüftknochen mit einer Pinzette und schneidest ihn mit einer Schere dahinter, um ihn vom Tier zu trennen. Legen Sie den Hüftknochen in eiskaltes PBS 2%FBS.Nachdem Sie das Bein und den Hüftknochen in eine Petrischale gelegt haben, reinigen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell. Trennen Sie dann Schien- und Oberschenkelknochen, indem Sie mit dem Skalpell am Knie schneiden und die sauberen Knochen in eiskaltes PBS 2%FBS legen. Legen Sie den Oberschenkelknochen oder das Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.Als nächstes pipettieren Sie die resultierende Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette auf und ab, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, das auf das Röhrchen gelegt wird, in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS ab und füllen Sie die Lösung in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen durch dasselbe 40-Mikrometer-Zellensieb. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer bei Raumtemperatur durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 15 Milliliter PBS 2%FBS hinzugefügt und das 50-Milliliter-Röhrchen zentrifugiert. Wenn das Zellpellet nicht rötlich aussieht, entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.Nachdem Sie den Knochen wie zuvor gezeigt zerkleinert haben, schneiden Sie die Spitze einer P1000-Pipette mit einer Schere ab und füllen Sie damit den gesamten Inhalt des Mörtels in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Kollagenase IV und dieser Dispase-II-Lösung.Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Füllen Sie das Röhrchen auf 25 Milliliter mit PBS 2%FBS auf und wirbeln Sie es aus. Anschließend wird der Inhalt durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.Geben Sie dann 15 Milliliter PBS 2%FBS in das alte 50-Milliliter-Röhrchen und überführen Sie die Lösung durch das 100-Mikrometer-Zellensieb in das neue 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert, indem man mit einer Pipette mehrmals auf und ab pipettiert. Nach der zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 15 Milliliter PBS 2%FBS zugeben.Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut, und wenn das Zellpellet nach dem Verwerfen des Überstandes nicht rötlich aussieht, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Anschließend wird die Platte bei 500 G drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Legen Sie den Oberschenkelknochen auf eine Petrischale und schneiden Sie die Knochenenden mit einem sterilen Skalpell ab.Spülen Sie dann den zentralen Teil des Knochens, indem Sie 100 Mikroliter PBS 2%FBS einmal von jeder Seite mit einer 0,5-Milliliter-Insulinspritze ohne Totvolumen durch das Innere des Knochens führen und die Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter PBS 2%FBS auffangen. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als gespültes Knochenmark bezeichnet wird und vier Milliliter PBS 2%FBS enthält. Zerstoßen Sie die Enden des Knochens in einem Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS, indem Sie sie mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.Sobald die Zellsuspension homogenisiert ist, wird sie durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als zerkleinertes Knochenmark gekennzeichnet ist. Zum Schluss spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS aus und geben Sie die Lösung in dasselbe Röhrchen. Die Durchflusszytometrie von hämatopoetischen Stammzellen und multipotenten Vorläuferzellen wurde im gesamten Knochenmark einer gesunden jungen erwachsenen C57BL6J-Maus durchgeführt.Bei der Analyse von Stromazellen, Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen im gesamten Knochenmark können mesenchymale Stammzellen anhand der Leptinrezeptorexpression und Endothelzellen anhand der Expression von CD31 und SCA-1 identifiziert werden. Durchflusszytometrische Analyse von Endothelzellen im Gesamtknochenmark zeigt die Unterscheidung zwischen arteriolären und sinusoidalen Endothelzellen auf der Grundlage von ICAM1. Die Quantifizierung von arteriellen und sinusoidalen Knochenmarkendothelzellen im zentralen und endostealen Knochenmarkgewebe zeigt, dass arterielle Knochenmarkendothelzellen häufiger in endostealen Regionen vorkommen, während Sinusoide häufiger in zentralen Knochenmarkbereichen vorkommen.Bei der Entnahme von gespültem Knochenmark sollte das Volumen oder die Anzahl der Male, die für die Verabreichung von PBS 2%FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens angegeben sind, nicht überschritten werden. Die Kombination der beschriebenen Methode mit funktionellen Assays der phänotypisch analysierten Zellpopulationen würde weitere wertvolle Informationen über die möglichen Störungen dieser Populationen liefern, die unter den untersuchten Bedingungen auftreten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen im endostealen und zentralen Knochenmark, so dass die Forscher Störungen der Hämatopie untersuchen können, die möglicherweise spezifisch in diesen Knochenmarkslokalisationen auftreten.

flow-cytometry-analysis-murine-bone-marrow-hematopoietic-stem

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Reinigung, Erweiterung und Charakterisierung von hochhomogenen mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Mäusen. Dieser Ansatz ermöglicht die Gewinnung großer Mengen von BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial, unterstützt Mausmodelle und fördert die präklinische Forschung.

Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen sowie Stromazellen im murinen Knochenmark. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung endostaler und zentraler Knochenmarkregionen.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen (Video) | JoVE Journal

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

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