Name: Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark von Mäusen. Diese Methode liefert bis zu 2 x 10^7 ungestimulierte Zellen pro Tier für Forschung in Immunologie und Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), durch Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) und Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16) sowie des brasilianischen Nationalen Rates für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) unterstützt.

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit dem Nationalen Rat für die Kontrolle von Tierversuchen (Concea) und mit Genehmigung des Ethik- und Verwendungsausschusses für Tiere (CEUA) erstellt. C57BL/6-Mäuse wurden vom Biotério Central der Federal University of Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasilien, gekauft. Persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz sollten bei allen in diesem Protokoll beschriebenen Schritten verwendet werden.
1. Vorbereitung des Überstands der Fibroblasten-L-929-Linie als Quelle für M-CSF
<ol><li>Tauen Sie Zellen der L-929-Fibroblastenlinie auf (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) und beginnen Sie sofort mit dem Kulturprozess, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
	<li>In einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank werden die Zellen der L-929-Fibroblastenlinie mit einer 1.000-μl-Pipette aus dem Fläschchen in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzuzufügen, die frei von Kalzium und Magnesium ist.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 300 x g, 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium-F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 ml Penicillin/Streptomycin (P/S) (DMEM/F12-10) unter Verwendung einer serologischen Pipette.</li>
	<li>Die resuspendierten Zellen werden in einen T75-Zellkulturkolben überführt.</li>
	<li>In einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator bis zur vollständigen Konfluenz inkubieren. HINWEIS: Achten Sie bei der Handhabung des Kolbens darauf, dass der Deckel nicht mit Lösung benetzt wird, da dies eine Kontaminationsquelle sein kann. Um eine geeignete Menge an Überstand zu erhalten, ist es notwendig, die Zellen zu replizieren, nachdem sie die gesamte Oberfläche des Zellkulturkolbens bedeckt haben. L-929-Zellen werden durch Kontakt gehemmt. Erwärmen Sie die Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung, DMEM/F12-10, und steriles PBS auf 37 °C, um die Zellkulturerweiterung zu starten, wie in den folgenden Schritten beschrieben.</li>
	<li>Sobald die vollständige Konfluenz erreicht ist, entsorgen Sie den Überstand aus dem Zellkulturkolben in der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank.</li>
	<li>Waschen Sie den Zellkulturkolben mit 20 ml sterilem PBS mit einer serologischen Pipette und verwerfen Sie die Lösung.</li>
	<li>10 ml Trypsin/EDTA (0,05%ige Lösung) in den Zellkulturkolben geben, der die anhaftenden Zellen enthält.</li>
	<li>Den Zellkulturkolben von der laminaren Strömung in einen 37°C-Inkubator mit 5 % CO2 überführen und 3 Minuten lang inkubieren.</li>
	<li>Schütteln Sie den Zellkulturkolben, um die Zellen von der Oberfläche des Kulturkolbens zu trennen, und stellen Sie mit einem Mikroskop sicher, dass alle Zellen dissoziiert wurden.</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Trypsin/EDTA (0,05%ige Lösung) mit 10 mL DMEM/F12-10 Medium.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lösung mit einer serologischen Pipette in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Bei 300 x g bei 4 °C 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL DMEM/F12-10 Medium.</li>
	<li>1 ml der Zellsuspension in einen T175-Zellkulturkolben (1:10-Kultur) geben.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang, um zehn T175-Zellkulturflaschen zu erhalten.</li>
	<li>Geben Sie 50 ml DMEM/F12-10 in jeden Zellkulturkolben.</li>
	<li>In einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator bis zur vollständigen Konfluenz inkubieren. HINWEIS: Diese Schritte garantieren 500 ml L-929-Zellüberstand. Am Tag 5, nachdem die Zellen die Oberfläche des T175-Zellkulturkolbens bedeckt haben, wird der Überstand mit M-CSF angereichert und muss entnommen werden14.</li>
	<li>Nehmen Sie den Zellkulturkolben am 5. Tag nach der Kontakthemmung aus dem Inkubator.</li>
	<li>Übertragen Sie das Medium in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 3.200 x g, bei 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Der mit M-CSF angereicherte Überstand wird aufgefangen und die Lösung in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Im Gefrierschrank bei -20 °C lagern. HINWEIS: Die Zentrifugation ist äußerst wichtig, um Zellen und Ablagerungen aus den Überständen zu entfernen.</li>
	<li>Der Überstand L-929 ist eine praktische und kostengünstige Quelle für den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und enthält typischerweise 5 bis 10 ng/ml M-CSF8. Diese Überstände enthalten auch Spuren anderer Zytokine und Wachstumsfaktoren, üben aber keinen tiefgreifenden Einfluss auf die Makrophagenphysiologie aus15. Gereinigtes M-CSF kann jedoch als Alternative zu L-929-Überständen in Konzentrationen von 1 bis 2 ng/mL8 erworben und verwendet werden.</li>
</ol>2. Entfernung des Oberschenkelknochens und des Schienbeins
<ol><li>Fahren Sie fort mit der Euthanasie der 8 Wochen alten männlichen Wildtyp-Maus C57BL-6 durch Gebärmutterhalsdislokation nach Kohlendioxid-Erstickung, in Übereinstimmung mit der normativen Resolution Nr. 18 des Nationalen Rates für Tierversuche (Concea) und mit Genehmigung des Ethik- und Verwendungsausschusses für Tiere (CEUA).</li>
	<li>Tränken Sie die Maus mit 70%iger Ethanollösung und verwenden Sie eine sterile Schere, um einen 1 cm langen Schnitt entlang des Bauches zu machen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut, bis der Muskel der Hinterbeine vollständig freigelegt ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hinterbeine auf Hüfthöhe und achten Sie darauf, den Oberschenkelknochen und das Schienbein nicht zu brechen.</li>
	<li>Legen Sie die Hinterbeine in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit 70%iger Ethanollösung. HINWEIS: Verwenden Sie immer pathogenfreie Mäuse. Achten Sie darauf, beide Beine zu sammeln, um eine größere Anzahl von Zellen zu erreichen. Schritt 2 wird in einer unsterilen Umgebung (Benchtop) durchgeführt. Daher ist es wichtig, den Oberschenkelknochen und das Schienbein vorsichtig zu entfernen, damit sie intakt bleiben und eine bakterielle Kontamination vermieden werden. Die restlichen Schritte dieses Verfahrens werden in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Die Zeit, in der die Beine einer 70%igen Ethanollösung ausgesetzt sind, sollte auf 10 Minuten begrenzt werden. Ist die Zeit länger, können Vorläuferzellen des Knochenmarks betroffen sein.</li>
</ol>3. Gewinnung von Knochenmarkvorläuferzellen aus dem Lumen der Tibia und des Femurs
<ol><li>Entfernen Sie die Beine aus der 70%igen Ethanollösung und geben Sie sie in steriles PBS.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette und Desinfektionstücher, um alle Muskeln und Faszien zu entfernen. Der Knochen sollte nach diesem Schritt sauber sein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile chirurgische Skalpellklinge, um die Knochenepiphyse an beiden Enden zu durchtrennen, um das Knochenmark freizulegen.</li>
	<li>Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit 10 mL sterilem PBS, ergänzt mit 2%iger Penicillin/Streptomycin-Lösung, und schließen Sie eine 26-g-Nadel an.</li>
	<li>Halten Sie den Knochen mit einer anatomischen Dissektionezange mit einer Hand fest und führen Sie die Nadel mit der anderen Hand in die Knochenhöhle ein. Achte darauf, dass du den Knochen nicht mit der Pinzette zerquetschst.</li>
	<li>Waschen Sie das Innere des Knochens mit dem PBS aus und sammeln Sie das Knochenmark in einem sterilen konischen Zentrifugenröhrchen. Nach diesem Schritt sollte die Knochenhöhle weiß erscheinen.</li>
	<li>Die gesammelten Zellen 10 min bei 300 x g bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 1 ml DMEM/F12-10 resuspendieren.</li>
	<li>Homogenisieren Sie und fügen Sie weitere 9 mL DMEM/F12-10 Medium hinzu, um die Zellen auf insgesamt 10 mL zu bringen.</li>
</ol>4. Makrophagen-Kultur
<ol><li>Geben Sie 1 ml Zellvorläuferzellen in jede der 100 mm x 20 mm großen runden Petrischalen aus Kunststoff (insgesamt 10 Schale) und verteilen Sie die Zellen mit einer Pipette auf den Platten, um eine gleichmäßige Verteilung zu erhalten. Verwenden Sie kein mit Gewebekulturen behandeltes Geschirr.</li>
	<li>9 ml DMEM/F12-10, ergänzt mit 20 % des L-929-Zellüberstandes, in jede Schale geben.</li>
	<li>Inkubieren Sie in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 .</li>
	<li>Am 3. Tag geben Sie 10 ml DMEM/F12-10-Medium, ergänzt mit 20 % des Überstands an L-929-Zellen, in jede Schale. Auf diese Weise stehen den Kulturschalen nun insgesamt 20 mL Kulturmedium zur Verfügung, ausreichend für das Wachstum der Zellen bis zum Ende ihrer Reifung. HINWEISE: Mit Gewebekulturen behandelte Schalen dürfen nicht verwendet werden, da Makrophagen als natürliche adhärente Zellen, die durch starke Wechselwirkungen mit Oberflächen gekennzeichnet sind, später nicht leicht von der Schale dissoziieren. Normalerweise können Zellvorläuferzellen einer Maus (zwei Femure) in 10 Kulturschalen ausgesät werden. Zellvorläuferzellen verwandeln sich in Makrophagen, die vom 7. bis 10. Inkubationstag verwendet werden können. Die Reifungsbestätigung wird durch Veränderungen an der Morphologie der Makrophagen identifiziert. Reife Makrophagen sind adhärent und zeigen eine heterogene Morphologie, die durch die Emission von Pseudopodien in verschiedene Richtungen erklärt wird. Beispiele für diese reifen Zellen sind in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt.</li>
</ol>5. Ernte von Makrophagen
<ol><li>Entsorgen Sie die Überstände aus allen Kulturschalen.</li>
	<li>Waschen Sie jede Kulturschale mit 10 ml warmem (37 °C) sterilem Mg2+ und Ca2+ freiem PBS.</li>
	<li>Entsorge die Lösung aus jeder Schale.</li>
	<li>Die nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung auf 37 °C vorwärmen und 3 ml in jede Schale geben. 10 min in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um zu visualisieren, ob sich die Makrophagen von den Kulturschalen dissoziieren. HINWEIS: Die Verwendung von Kunststoffplatten, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurden, sollte eine einfache Dissoziation der Zellen ermöglichen und die Notwendigkeit vermeiden, die Zellen von der Platte abzukratzen.</li>
	<li>Spülen Sie das Geschirr mit einer serologischen Pipette immer wieder mit der nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung und führen Sie kreisende Bewegungen aus, um zu bestätigen, dass alle Makrophagen von der Schale dissoziiert sind.</li>
	<li>Sammeln Sie die Lösung aller Kulturschalen zusammen in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 10 mL steriles, vorgewärmtes PBS in die leeren Kulturschalen und gehen Sie wie in Schritt 5.4 vor. Dieses Verfahren ist eine Wiederholung von Schritt 5.4 und soll gewährleisten, dass alle Makrophagen gesammelt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 300 x g, 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 1 ml DMEM/F12-10 resuspendieren. Homogenisieren Sie langsam und vorsichtig mit der Pipette auf und ab, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Aliquot von 10 μl Makrophagenlösung vor, die mit 10 μl Trypanblau verdünnt ist, um die Zellen mit dem Hämozytometer zu zählen. HINWEIS: An Tag 7 produziert jede Schale ca. 2 x 106 Makrophagen. Das bedeutet, dass eine Maus etwa 2 x 107 primäre Makrophagen produzieren kann, wenn sie in zehn Platten geerntet wird. Da M-CSF nur die Reifung von Makrophagen antreibt, garantiert das Verfahren eine Population von Zellen, die im Wesentlichen nur aus Makrophagen besteht und frei von anderen kontaminierenden Leukozytenist 16.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die Herstellung einer Population von Makrophagen aus dem Knochenmark ist ein grundlegender Schritt in vielen zellbiologischen Versuchsmodellen, insbesondere wenn es wichtig ist, eine homogene Population von Primärzellen zu erreichen. Wie bereits erwähnt, können sich Zellvorläuferzellen nur in Gegenwart von M-CSF in Makrophagen verwandeln. L-929-Zellüberstände können als Hauptquelle für M-CSF verwendet werden. Abgesehen von den Kosten gibt es kein Problem, rekombinantes M-CSF selbstzu verwenden <su...

Monozyten und Makrophagen sind mononukleäre Fresszellen, die aus Vorläuferzellen im Knochenmark gewonnen werden können. Neuere Studien haben berichtet, dass Makrophagen auch von erythro-myeloischen Vorläuferzellen aus Dottersäcken stammen1. Unabhängig von ihrer Herkunft haben diese Leukozyten wichtige Effektorfunktionen bei der Homöostase und Entzündung 2,3. Monozyten sind Zellen aus dem peripheren Blut, die sich im Gewebe weiter zu Makrophagen differenzieren können 2,4, während Makrophagen heterogene Zellen sind, die Phänotypen und Funktionen aufweisen, die durch die lokale Exposition von Wachstumsfaktoren und Zytokinen reguliert werden5. Da Makrophagen eine solche funktionelle Vielfalt aufweisen, wurden sie in vielen Krankheitsmodellen untersucht. So ist die In-vitro-Kultur von Makrophagen zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um ihre Physiologie und ihre Rolle bei verschiedenen Krankheiten zu verstehen. Das Knochenmark ist eine wichtige Quelle für Vorläuferzellen, einschließlich Makrophagen-Vorläuferzellen, die isoliert und vermehrt werden können, wodurch die Anzahl der erhaltenen Makrophagen exponentiell erhöht wird. Darüber hinaus sind aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen besonders wichtig, um die Auswirkungen der Gewebemikroumgebung zu vermeiden, da Makrophagen ihren Phänotyp als Reaktion auf verschiedene Reize im Gewebe ändern 6,7. Knochenmarkvorläuferzellen verwandeln sich in Makrophagen, wenn sie dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) ausgesetzt werden8. Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen können nicht durch biochemische Marker im Gewebe von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen unterschieden werden. Diese Zellen stellen eine sehr homogene Population von Primärzellen dar, die in vielerlei Hinsicht mit den Peritonealmakrophagen vergleichbar sind 6,9.
Aufgrund ihrer heterogenen zellulären Funktionen wurden Makrophagen von Forschern lange Zeit gründlich untersucht. Diese Zellen können in verschiedenen experimentellen Modellen verwendet werden, einschließlich Infektions- und Entzündungskrankheiten, da sie in diesen Prozessen eine Rolle spielen10,11. Sie können auch nützlich sein, um die Polarisation von Makrophagen als Reaktion auf verschiedene Mikroumgebungsreize zu untersuchen12,13. Somit wird hier ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Verfügung gestellt, um eine hohe Anzahl primärer Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus zu gewinnen.

<table><tbody><tr><td>20-cm³-Spritze</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Sterile Spritze</td></tr><tr><td>26-G-Nadeln</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Sterile Nadeln</td></tr><tr><td>50-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Konische Kunststoffröhrchen für die Zentrifugation</td></tr><tr><td>70%ige Ethanollösung</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Ethanollösung für die Esterilisation</td></tr><tr><td>Anatomische Dissektion Pinzette</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>Aufbewahrung in einem sterilen Becherglas mit 70%iger Ethanollösung</td></tr><tr><td>C57Bl/6 Wildtyp-Maus</td><td>Gekauft bei Biot&eacute; rio Central an der Federal University of Minas Gerais</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Mäuse müssen frei von spezifischen Krankheitserregern sein und zwischen 6 und 10 Wochen alt sein. Die Mäuse müssen mindestens eine Woche früher untergebracht werden, um sich von den Belastungen des Transports zu erholen</td></tr><tr><td>Zellkulturkolben T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>T-175 Kolben, schräger Hals, Oberfläche 75 cm2, mit Filterkappe, DNasefrei, RNasefrei</td></tr><tr><td>Zellkulturkolben T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>T-75 Kolben, schräger Hals, Oberfläche 75 cm2, mit Filterkappe, DNasefrei, RNase free</td></tr><tr><td>Desinfektionsmittel oder Babytücher?</td><td>CLOROX</td><td>Nicht anwendbar</td><td>Es hilft bei der Reinigung des Knochens</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Steriles destilliertes Wasser</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Nicht zutreffend Nicht zutreffend</td> Geben <td>Sie 10 ml fötales Rinderserum (FBS) und 1 ml Penicillin/Streptomycin (P/S) zu DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10 + Überstand von L-929-Zellen</td><td>Nicht zutreffend</td> Nicht <td>zutreffend</td><td>Zugabe von 20 % des Überstands der L929-Zellkultur auf DMEM/F-12-10</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s modifizierter Eagle&prime; s Medium - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium enthält 2,5 mM L-Glutamin, 15 mM HEPES, 0,5 mM Natriumpyruvat und 1200 mg/L Natriumbicarbonat. Das Pulver auf 1 Liter destilliertes Wasser resuspendieren und 3,7 g Natriumbicarbonat hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein und filtern Sie mit 0,22 μm. Lagerung bei 2 - 8 μm; C Gefrierschrank</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, USA (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10082147</td><td>Anreicherung für DMEM-F12</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>Wird zur Zählung von Makrophagen in der Mikroskopie</td></tr><tr><td>verwendet L-929-Zellen</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 ist eine Abstammungslinie von Maus-Fibroblastenzellen, die als Quelle für den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF)</td></tr> <tr><td>verwendet werdenNikon TI Eclipse&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>Nicht anwendbar</td><td>Nikon TI Eclipse ist ein Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskop</td></tr><tr><td>Nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Nicht-enzimatische Zelldissoziationslösung, um Makrophagen von der Platte zu entfernen, ohne sie zu beschädigen</td></tr><tr><td>Unbehandelte runde Kulturschalen 100 & 20&ndash; mm</td><td>CORNING</td><td>CLS430591</td><td>Verwenden Sie keine mit Gewebekulturen behandelten Petrischalen oder mit Gewebekulturen behandelte Platten</td></tr><tr><td>P3199 Penicillin G Kaliumsalz</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin (P/S) Lösung</td><td></td><td></td><td>Verwenden Sie 0,26 g Penicillin und 0,40 g Streptomycin. Mit 40 ml sterilem PBS mischen. Verwenden Sie in einem horizontalen Laminar-Flow-Schrank einen 0,22 &micro; M filtrieren und lagern Sie Aliquots von 1,0 mL in 1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen im Gefrierschrank (-20 ° G; C)</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, frei von Calcium und Magnesium (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>Steril</td></tr><tr><td>S7975 Streptomycinsulfat, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten von 10 ml oder 25 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>Serologische Pipetten werden mit Volumina von mehr als 1 ml</td></tr><tr><td>verwendet Natriumbicarbonat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>pH-Korrektur für DMEM-F12</td></tr><tr><td>Software Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>Nicht zutreffend</td><td>NIS-Elements Viewer ist ein kostenloses, eigenständiges Programm zum Anzeigen von Bilddateien und Datensätzen</td></tr><tr><td>Steriles PBS und 2% P/S-Lösung</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>Fügen Sie 1 mL P/S in 40 mL sterile PBS-Irisschere</td></tr><tr><td></td><td>hinzu KATENA</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Bewahren Sie es in einem sterilen Becherglas mit 70% Ethanollösung</td> auf</tr><tr><td>Überstand von L-929-Zellen</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Nicht zutreffend</td><td>L-929 ist eine Abstammungslinie von Maus-Fibroblastenzellen, die als Quelle für den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) verwendet werden. Der Überstand L-929 wurde aus dem Protokoll gewonnen</td></tr><tr><td>Chirurgische Skalpellklinge Nr. 24 Edelstahl</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Wird zur Freilegung der Epiphyse aus Knochen verwendet</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %, wird routinemäßig als Zellfärbung zur Beurteilung der Zellviabilität unter Verwendung des Farbstoffausschlusstests verwendet</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-Lösung 0,05 %</td><td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>Zur Dissoziation von Zellen aus der Kulturflasche</td></tr><tr><td>Wasser für Injektionszwecke (WFI) für die Zellkultur</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Steriles und endotoxinfreies Wasser</td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von makrophagen aus dem knochenmark aus mäusen

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Makrophagen haben wichtige Effektorfunktionen bei der Homöostase und Entzündung. Diese Zellen sind in jedem Gewebe des Körpers vorhanden und haben die wichtige Fähigkeit, ihr Profil entsprechend den in der Mikroumgebung vorhandenen Reizen zu ändern. Zytokine können die Physiologie von Makrophagen tiefgreifend beeinflussen, insbesondere IFN-γ und Interleukin 4 und erzeugen M1- bzw. M2-Typen. Aufgrund der Vielseitigkeit dieser Zellen kann die Produktion einer Population von Makrophagen aus dem Knochenmark ein grundlegender Schritt in vielen experimentellen Modellen der Zellbiologie sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern bei der Isolierung und Kultivierung von Makrophagen zu helfen, die aus Knochenmarkvorläufern gewonnen werden. Knochenmarkvorläuferzellen von pathogenfreien C57BL/6-Mäusen werden in Makrophagen umgewandelt, wenn sie dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) ausgesetzt werden, der in diesem Protokoll aus dem Überstand der murinen Fibroblastenlinie L-929 gewonnen wird. Nach der Inkubation stehen reife Makrophagen zur Verfügung, die vom 7. bis zum 10. Tag verwendet werden können. Ein einzelnes Tier kann die Quelle von etwa 2 x 107 Makrophagen sein. Daher ist es ein ideales Protokoll für die Gewinnung großer Mengen primärer Makrophagen mit grundlegenden Methoden der Zellkultur.

Makrophagen sind große und anhaftende Zellen mit besonderen physiologischen Eigenschaften. Sie zeigen eine Vielfalt morphologischer Erscheinungsformen in Kultur, da sie an Glas und Kunststoff haften können, und ihre typische Ausbreitungsmorphologie hängt mit der Emission zytoplasmatischer Fortsätze zusammen (Abbildung 1). Sobald die Vorläuferzellen des Knochenmarks M-CSF aus dem L-929-Zellüberstand ausgesetzt sind und die Umwandlung in reife Makrophagen beginnen, haften sie an der Petriplatt...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, große Mengen an unstimulierten Makrophagen zu erhalten, die aus dem Knochenmark gewonnen wurden und niemals Gewebefaktoren oder Zytokinen ausgesetzt waren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anzahl der Zellen, die von einem einzigen Tier gewonnen werden. Mit dem richtigen Verfahren kann ungefähr 2 mal 10 hoch 7 Makrophagen erhalten werden.Diese Methode könnte Forschern aus verschiedenen Bereichen helfen, Makrophagen zu untersuchen, wie z. B. Zellbiologie, Pathologie, Immunologie und Parasitologie. Da Zellen immer anfällig für Kontaminationen sind, ist es notwendig, bei allen sterilen Schritten vorsichtig zu sein und eine Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank zu verwenden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Das Verfahren wird von Izabela Aparecida de Souza vorgeführt. Ein Masterstudent aus unserem Labor.Um den Eingriff an der ordnungsgemäß eingeschläferten, acht Wochen alten männlichen C57BL/6-Wildtyp-Maus zu beginnen, tränken Sie die Maus mit 70%iger Ethanollösung. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen einen Zentimeter langen Schnitt entlang des Bauches und entfernen Sie die Haut, bis der Muskel der Hinterbeine vollständig freig

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-Stromazellen aus den langen Knochen von Mäusen. Die isolierten adhärenten BMSCs können für die weitere Analyse verwendet werden.

Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-Stromazellen aus einem Schienbein der Maus

In diesem Video demonstrieren wir die Aktivierung von aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen als Reaktion auf bakterielle Lipopolysaccharide und intravenöses Immunglobulin.

Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Dieses Protokoll wurde für die Kultur von Tetrahydrobiopterin (BH4)- und induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS)-defizienten primären murinen Makrophagen etabliert, um die NO-Redox-Biologie zu untersuchen. Die Studie konzentriert sich auf die Verringerung der potenziellen Kontamination von BH4 und anderen Artefakten, die in traditionellen Isolations- und Kulturmethoden gefunden werden, die experimentelle Ergebnisse und die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen können.

Isolierung und In vitro Kultur von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen für das Studium der NO-Redox-Biologie

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark von Mäusen. Diese Methode liefert bis zu 2 x 10^7 ungestimulierte Zellen pro Tier für Forschung in Immunologie und Zellbiologie.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

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