Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben
3. Februar 2023
Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.
Dieses Protokoll ist relevant für die Isolierung von Endothelzellen aus Gewebeproben oder sehr kleinen Stücken von Blutgefäßen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in jedem Forschungslabor reproduziert werden kann und es ermöglicht, auch aus sehr kleinen Proben eine gute Reinheit der Endothelzellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Lungenparenchymprobe, indem Sie die gesammelten Proben in einem 50-Milliliter-Röhrchen waschen, das PBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid oder PBS minus minus enthält.
Übertragen Sie die Proben in eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie sie manuell mit einer chirurgischen Schere in kleine Fragmente von etwa drei bis vier Millimetern. Für den Arterienabschnitt werden die gesammelten Proben in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit PBS minus minus minus gewaschen und ohne Zerkleinern in eine sterile Petrischale überführt. Um den größten Teil des Restblutes zu entfernen, geben Sie zwei Waschungen PBS minus minus auf das gewürfelte Lungenparenchym oder das Pulmonalarteriensegment.
Anschließend werden die Proben in 15-Milliliter-Röhrchen gegeben und mit fünf Millilitern Kollagenase Typ II 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Um die großen Bruchstücke zu entfernen, legen Sie ein steriles Sieb von einem Millimeter Maschenweite auf die Oberseite des 50-Milliliter-Auffangröhrchens und gießen Sie den gesamten Inhalt aus dem 15-Milliliter-Röhrchen auf das Sieb. Massieren Sie anschließend das verdaute Gewebe vorsichtig mit einem Spatel, bevor Sie die Probe mit PBS minus minus spülen, bis das Sammelröhrchen gefüllt ist.
Um nicht-vaskuläre Endothelzellen zu entfernen, filtern Sie den Abfluss aus verdauten Zellen in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Zellsieb von 70 Mikrometern Maschenweite. Sammeln Sie dann mit einem 40-Mikrometer-Sieb den Abfluss in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen, das als Röhrchen 1 gekennzeichnet ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 30 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellcluster zu sedimentieren.
Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Überstand in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen, das als Röhrchen 2 gekennzeichnet ist. Suspendieren Sie das Pellet in Röhrchen 1 und füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit PBS minus Minus. Füllen Sie Tube 2 ebenfalls bis zu 50 Milliliter mit PBS minus minus.
Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Pellets mit zwei Millilitern Wachstumsmedium und säen Sie die Suspension in zwei separate Vertiefungen einer vorcodierten Sechs-Well-Platte. Es wurde beobachtet, dass ein Teil der behandelten Zellaggregate, einschließlich der glatten Muskelzellen oder SMCs und Fibroblasten, an lange Fasern gebunden war.
Außerdem stellten SMCs die Mehrheit der Nicht-Blutzell-Singuletts dar. Kleine, kompakte Zellhaufen mit Durchmessern von nicht mehr als 10 bis 20 Mikrometern waren ohne Elemente, die auf Fragmente von Stromagewebe zurückzuführen waren. Es wurden etwa 70 % reine humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge, kurz HLMVEC, Einzelzellen erhalten.
Bei der Gewinnung reiner HLMVEC-Präparate nahmen die sortierten Zellen die charakteristische endotheliale Form an. Die fokale Mikroskopie zeigte, dass fast 100% der gereinigten Zellen des Fettes positiv für Endothelzellantigene, nämlich CD31 und den spezifischeren von-Willebrand-Faktor, gefärbt wurden. Wenn diese Zellen in Matrigel saßen, erzeugten sie röhrenförmige Strukturen und HUVECs, was ihren endothelialen Phänotyp bestätigte.
Aufgrund der kurzen Inkubationszeit während des enzymatischen Aufschlusses ist es wichtig, die Kollagenase vorzuwärmen. Ein weiterer Punkt ist, dass es bei der Sedimentation von Zellclustern darauf ankommt, den Überstand schonend zu entfernen, ohne die Zellaggregate in der Palette zu berühren. Dieses Verfahren basiert auf dem Einsatz von Zentrifugation und Filtration und könnte daher neue Erkenntnisse liefern, um andere Zelltypen anhand ihrer Eigenschaften wie Größe und Clusterbildung zu unterscheiden.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Isolierung pulmonaler endothelialer Zellen, das für die Untersuchung von Lungentzündungen entscheidend ist. Die Methode liefert endotheliale Zellen mit hoher Reinheit sowohl aus makrovaskulären als auch aus mikrovaskulären Quellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Gefäßbiologie
- Forschung zur Lungentzündung
Hintergrund
- Endothelzellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entzündung der Lunge.
- Die Effizienz und Reinheit von Isolationsmethoden kann variieren.
- Eine hohe Reproduzierbarkeit in Laborumgebungen ist entscheidend für konsistente Ergebnisse.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung mit Kollagenase Typ II
- Menschliche lungenspezifische mikrovaskuläre Endothelzellen (HLMVEC)
- Zentrifugations- und Filtrationsverfahren
Hauptergebnisse
- Es wurde eine hohe Ausbeute von etwa 70 % gereinigten HLMVEC erzielt.
- Die gereinigten Zellen wiesen eine typische endotheliale Morphologie auf und färbten sich positiv für endotheliale Marker.
- Die Technik ermöglicht die Isolierung reiner endothelialer Zellen und bietet potenzielle Erkenntnisse zur Zellseparation basierend auf Größe und Aggregation.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert das Verständnis der Biologie endothelialer Zellen in der Lungensforschung.
- Es ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von Lungenerkrankungen und der vaskulären Gesundheit.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Zuverlässige Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären endothelialen Zellen aus Lungengewebe ermöglicht die Entwicklung krankheitsrelevanter Modelle und die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung&D. Der Zugang zu hochreinen, ortspezifischen endothelialen Zellen erhöht die Vorhersagegenauigkeit in Studien zur Gefäßbiologie und in der translationsmedizinischen Forschung. Diese Möglichkeit schließt Lücken im Forschungsportfolio, wo kommerzielle oder Biobank-Zellquellen für genotyp- oder krankheitsspezifische Untersuchungen unzureichend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung&D
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Endothelzellfunktion in krankheitsrelevanten Kontexten.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem sie reine Zellpopulationen für die Pfadanalyse bereitstellt.
- Erleichtert die Target-Validierung, indem sie die direkte Untersuchung standortspezifischer endothelialer Phänotypen ermöglicht.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte primäre Zellen für die robuste Entwicklung von Assays und die Screening von Wirkstoffen.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays, indem die Kontamination mit nicht-endothelialen Zellen minimiert wird.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung endothelialer Reaktionen auf potenzielle Therapeutika.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt In-vitro-Modelle an die krankheitsrelevante humane vaskuläre Biologie an.
- Unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung, indem Studien an primären humanen endothelialen Zellen ermöglicht werden.
- Erleichtert die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in der vaskulären und entzündlichen Krankheitsforschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Isolationsprotokoll eignet sich für den Übergangsbereich zwischen der frühen Entdeckung und der Entwicklung präklinischer Modelle und ermöglicht nachgeschaltete Screening- und translationsmedizinische Studien.
- Entdeckungsbiologie: Stellt reine endotheliale Zellen für Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen bereit.
- Screening: Bereitstellung standardisierter Zellpopulationen für reproduzierbare Testplattformen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Reinheit, Markerexpression und funktionelle Röhrenbildung.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen unter Verwendung von krankheits- und genotypspezifischen Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein reproduzierbares, skalierbares Verfahren, das an verschiedene Anforderungen der Gefäßforschung angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in Gefäßstudien.
- Operativer Wert: Standardisiert die Zellisolierung und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem bereits früh im Entwicklungsprozess relevante biologische Modelle bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Lücken bei der Verfügbarkeit von krankheitsspezifischen und genotypspezifischen Zellen geschlossen werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Geweben und Zellkultivierungstechniken.
- Benötigt Zugang zu grundlegenden Instrumenten der Zellbiologie wie Zentrifugen und sterilen Arbeitsplätzen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um eine gleichbleibende Zellreinheit und ein konsistentes Phänotyp zu gewährleisten.
- Kann an verschiedene Gewebequellen angepasst werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung des Protokolls für andere Organe.
- Kurze enzymatische Verdauungszeiten und sorgfältiges Vorgehen sind entscheidend für die Zellviabilität und -reinheit.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Sample Preparation and Enzymatic Digestion
1:47
Recovery of the Digested Cells and Removal of Non-Endothelial Cells (EC) by Filtration
2:32
Sedimentation of Cell Clusters and Cell Seeding
3:16
Results: Purification and Characterization of Freshly Isolated HLMVECs
4:30
Conclusion
