Name: Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Endothelrohren aus der oberen Epigastrikarterie der Maus zur Untersuchung von Calcium-Signalwegen in nativem Mikrovaskularendothel. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung intakter Zellstrukturen.

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Die Autoren danken Dr. Pooneh Bagher und Dr. Erika Westcott für redaktionelle Kommentare bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unter preisNummern R37-R01-und HL041026 HL086483 SSS und F32-HL107050 zu MJS unterstützt. Dieser Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Vorbereitung der Ausrüstung: Flusskammer, Pipetten und Lösungen <ol><li> Flusskammer: Verwenden Sie eine Strömungskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas auf dem Boden, die isolierten Endothelzellen Rohre (siehe Abbildung 1A) superfuse. Vor der Montage der Kammer, waschen Sie die Deckgläser mit beiden 3% HCl und 70% Ethanol gründlich mit Reinstwasser und trocken mit Stickstoffgas. </li><li> Pipetten: Drei verschiedene Arten von Pipetten werden in der Protokoll: Zugänge, Zerreiben und Pinning. Sowohl der Kanülierung und Pinning Pipetten vor dem Tag des Experiments werden, aber das Verreiben Pipette sollte der Tag, wie es die Kenntnis der Durchmesser des Behälters erfordert, um die Größe des Lumens geeignet gemacht werden. <ol><li> Kanülierung Pipetten: Um rote Blutzellen aus dem Lumen spülen, Borosilikatglas Kapillaren mit einer Mikropipette Puller, lange, sich verjüngende Enden zu ziehen. Brechen die Enden mit einer Pinzette an einem Außendurchmesser ca. 30% less als die der Arterien (~ 50-80 um), und Feuerpolitur die Spitze glatt zu sein (siehe Abbildung 1B). Es ist hilfreich, auch Winkel der Spitzen der Pipetten auf etwa 45 °. </li><li> Verreiben Pipetten: Um mechanisch distanzieren die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von den Endothelzellen Rohre, stellen Verreiben Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren. Bereiten Kapillaren, wie oben, und brechen Sie das Ende mit einer Pinzette. Tipp: Verwenden Sie ein Glas Scoring-Gerät zu erleichtern, um die dickere Wand der Glaspipette Verreiben sauber brechen. Brechen die Pipette an den Innendurchmesser am Tag des Experiments etwa 10-20 um größer als die des äußeren Durchmessers des Gefäßes aus dem Endothel-Röhrchen isoliert werden bestimmt. Feuerpolitur die Bruchenden bis glatt (siehe Abbildung 1C). </li><li> Pinning Pipetten: Zur Stabilisierung der endothelialen Rohr innerhalb der Durchflusskammer, stellen Pinning Pipetten, um die endotheliale t sichernUBE gegen das Deckglas Boden der Kammer. Ziehen Glaskapillaren in der gleichen Weise wie die Kanülierung Pipetten. Dann brechen die Enden mit einer Zange zu einem Durchmesser von ~ 100 um, und Feuerpolitur bis die Spitzen versiegelt sind, rund und glatt (siehe Abbildung 1D). Hinweis: Wenn die Spitze des Pinning Pipette nicht vollständig abgedichtet ist, wird Flüssigkeit in das Lumen eingeben kann und auch experimentelle Ergebnisse zu verwechseln. </li></ol></li><li> Lösungen: Alle Lösungen in hochreinem (18,2 M &amp;OHgr;) H 2 O und sterilisieren durch einen 0,2 &amp;mgr; m Filter. Stellen Sie sicher, die Osmolalität der Lösungen liegt zwischen 285-300 mOsm. Lösungen gut bleiben für etwa zwei Wochen bei 4 ° C gelagert <ol><li> Dissection Lösung: Die bei der Präparation der A. epigastrica superior verwendet Salzlösung wird von (in mmol / L) zusammen: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure ( HEPES), 10 Glucose, 0,01 Natriumnitroprussid (SNP), eind 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) mit einem pH-Wert von 7,4. Der NO-Donor SNP ist eingeschlossen, um zu entspannen glatten Muskelzellen, wodurch sie leichter, um die Arterie kanülieren und glatte Muskelzelle Entfernung während Verreiben erleichtern. </li><li> Dissoziation Lösung: Das bei der Spaltung des endothelialer Gefäße verwendet Salzlösung von (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose, 2 CaCl 2 und 0,1% BSA, mit ein pH-Wert von 7,4. In ein 1 ml-Aliquot dieser Puffer hinzuzufügen: 0,62 mg / ml Papain, 1,5 mg / ml Kollagenase und 1,0 mg / ml Dithioerythritol. Da Enzyme, die von verschiedenen Lieferanten unterschiedlichem enzymatische Aktivität haben, sind die Produktnummern der für diese Arbeit verwendet als Referenz in der Tabelle von Materialien enthalten. Hinweis: Während der Protokoll sowohl Dissoziationspuffer und Dissoziationspuffer mit Enzymen an verschiedenen Schritten verwendet. </li><li> Superfusion Lösung: Die physiologische Salzlösung (PSS) für superfusin verwendetg der isolierten Endothelzellen Rohr aus (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 2 CaCl 2, mit einem pH-Wert von 7,4. </li><li> Bereiten Puffer und Lösungen vor Beginn der chirurgischen Eingriffen. Entfernen Sie die Lösungen von 4 ° C und 50 ml Aliquot Dissection Puffer in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben und legen Sie es auf Eis. Zusätzlich aliquote 50 ml Dissoziationspuffer ohne Enzyme und auf der Tischplatte auf Raumtemperatur kommen. Entfernen Sie die Superfusionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur auf der Bank oben ins Gleichgewicht. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren und Protokolle mit Tieren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität bestätigtMissouri. <ol><li> Verwenden männlichen oder weiblichen Mäusen mindestens 9 Wochen alt und studieren jeweils einzeln. Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Spitze: Verdünnen der Pentobarbital 10 mg / ml in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion verringert die Möglichkeit einer Überdosierung. </li><li> Anästhesie beeinträchtigt Temperaturregelung, so halten Sie die Maus erwärmen unmittelbar nach der ersten Injektion von Pentobarbital. Mit einem Metallträger (belüftet Aluminium-Korb) auf einer Heizplatte (auf ~ 37 ° C kalibriert) funktioniert gut, um die Temperatur der Maus stabil zu halten. Alternativ können Sie auch eine Wärmelampe, kümmert sich um sie in einem angemessenen Abstand von der Maus zu positionieren. Überwachen Sie die Maus alle 5-10 Minuten, bis die entsprechende Ebene der Narkose erreicht ist (Mangel an Rücktritt bis Fuß oder Schwanz Prise). Nach 15-20 min kann eine Zusatzdosis erforderlich sein. Am besten ist es, langsam und mit Vorsicht vorgehen, um Überdosierung zu vermeiden, vor allem bei übergewichtigen, gealtert, oder Tiers anders betont. </li><li> Entfernen Sie die Haare von der Bauchseite nach der Rasur sorgfältig mit kleinen Tierhaarschneidemaschinen. Besondere Aufmerksamkeit sollte getroffen werden, um ein Trauma des Tieres zu vermeiden. Es ist hilfreich, alle Haare aus einem Gebiet stammen aus den Achselhöhlen bis zum Schambereich zu entfernen. Entfernen Sie lose anhaftende Haare mit einem frischen Alkoholtupfer. </li><li> Positionieren Sie die Maus auf den Rücken, wobei sowohl Vorder-und Hinterbeine verteilt, so viel von der Bauchwand wie möglich aussetzen liegt. Falls erforderlich, verwenden Labor Klebeband, um die Beine in einem Spread-Eagle Weise zu sichern. </li></ol> 3. Die Isolierung der A. epigastrica superior <ol><li> Einen kleinen Einschnitt durch die Haut unmittelbar über dem Bereich der Schamgegend. Stellen Sie sicher, dass nur die Haut wird geschnitten, während Vermeidung von Schäden an der zugrunde liegenden Bauchmuskeln, erweitern den Schnitt seitlich in jede Richtung aus, um entsprechende Hinterbeine. Weiterhin den Einschnitt rostral entlang der ventralen Mittellinie auf der Oberseite des Brustkorbs und dern verlängern den Schnitt seitlich in jede Richtung zu den jeweiligen Vorderbeine. </li><li> Heben Sie die Haut und mit einer Schere durchtrennen das Bindegewebe hält die Haut an die darunter liegende Muskulatur, wodurch die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur ausgesetzt (siehe Abbildung 3A). Spülen Sie die freiliegende Muskel mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Aufgrund der geringen Größe der SEA, positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop für weitere Verfahren. Heben Sie die Fettpolster an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette entfernt und einen Einschnitt durch. Setzen Sie den Schnitt entlang der unteren Rippe, dabei nicht zu tief in das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Die SEA sollte sichtbar sein, darauf achten, nicht zu beschädigen. Nachdem der Schnitt fertig ist, bewässern die freiliegende Gewebe mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Nachdem die oberste Schicht der Skelettmuskulatur eingefahren hat, sind das Meer und die darunter liegende Muskulatur leicht zu erkennen. Tipp: Beachten Sie die Länge derdie SEA in vivo vor Isolierung zu endothelialen Rohre (die sich entlang ihrer Achse nach der Isolierung zu verkürzen) sich auf ihre ursprüngliche Länge nähern. Mit einer Pinzette und Schere, auszuschneiden sorgfältig die dünne Muskelschicht unter der SEA. </li><li> Mit abgewinkelten Pinzette, passieren eine Länge von 6-0 Seidenfaden unter der SEA und Ligation der Arterie und den angrenzenden Vene, um es unter Druck und Blut in das Gefäßlumen zurückgehalten, um die Visualisierung während der nachfolgenden Isolierung und Reinigung zu erleichtern halten. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang SEA-Ligation auf der kontralateralen Seite. </li><li> Sobald beide SUP wurden ligiert, einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskulatur zu den jeweiligen Seiten zu trennen. </li><li> Erweitern der Einschnitt seitlich in jede Richtung, wie für die Haut durchgeführt, dann weiter der Schnitt vertikal entlang der Außenkante, um die Bauchmuskeln vollständig getrennt von dem Körper. Schäden an Gefäßen von der SEA zugeführt, um den Druck aufrecht zu erhalten Lumen vermeiden. </li><li> Cut die SEA über der Ligation, um das Siegel zu erhalten, und legen Sie den isolierten Muskel und Arterie in einem 50 ml-Becherglas mit 10 ml 4 ° C Dissektion Puffer. </li><li> Vorgang für die andere Seite des Bauches und Inkubation der Gewebe in der Präparation Puffer für 10 min. </li><li> Legen Sie die Bauchmuskulatur, die die SEA in einem gekühlten (4 ° C) Präparation Kammer, die Dissektion Puffer (siehe Abbildung 3B). Die Präparation Kammer aus einer Petrischale mit einer Schicht aus Sylgard (Polydimethylsiloxan [PDMS]) an der Unterseite. </li><li> Mit Insektenstifte (0,15 mm), strecken die isoliert SEA-und Bauchmuskel aus, um in vivo Längen (siehe oben) annähernd und befestigen Sie sie am Sylgard. Tipp: Orientieren den Muskel, so dass die dünne Schicht mit Blick auf das Bauchfell ist oben macht mit Durchleuchtung der SEA gut sichtbar. </li><li> Mit Hilfe feiner Mikrodissektion Instrumente und Arbeits von der stromaufwärts Ligationsstelle in Richtung derstromabwärts gelegenen Ende, deaktivieren Sie das Meer von seiner gepaart Vene und dem umgebenden Gewebe, bis der erste große Zweigstelle (1-2 cm). Dann auszuschneiden die SEA, indem es direkt über der Zweigstelle und knapp unterhalb der Ligation. </li><li> Um Blut in das Gefäßlumen beibehalten entfernen, kanülieren das Meer und spülen Sie es mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit einem Stück Silasticschlauch, befestigen Sie das hintere Ende einer Kanülisier Pipette auf eine 5 ml Spritze mit eiskaltem Puffer Dissektion und sichern die Mikropipette in einem Mikromanipulator zu ihrer Spitze innerhalb der Dissektion Kammer zu positionieren, um die SEA kanülieren. </li><li> Sobald alle Erythrozyten werden ausgespült, entfernen Sie das Meer von der Kanülierung Pipette, und heben Sie die Pipette aus der Dissektion Gericht. </li><li> Schneiden Sie die SEA in kleinere Segmente jeweils 1-3 mm in der Länge. Diese kürzere Segmente ermöglichen die Isolierung von Endothelzellen Röhren. </li></ol> 4. Isolierung des Endothelrohr <ol><li> Füllen Sie eine 12 mm x 75 mm Glas KultAbbildung Rohr halb mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit abgewinkelten Pinzette, übertragen Sie die Arterienstücke in die Kulturröhrchen und legen auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die Verdauungsenzyme mit Dissoziationspuffers auf ein Endvolumen von 1 ml in einem separaten 12 mm x 75 mm Kulturröhrchen (siehe 1.3.2 Solutions) vorzuwärmen und die Lösung auf 37 ° C mit einem Heizblock. </li><li> Während die Dissoziation Puffer und Enzyme werden aufgewärmt, sorgfältig absaugen Dissektion Puffer aus dem Kulturröhrchen so dass eine kleine Band mit den Gefäßsegmente. </li><li> Hinzufügen vorsichtig Raumtemperatur Dissoziationspuffer ohne Enzyme abzuwaschen restlichen Dissektion Puffer. Tipp: Fügen Sie die Dissoziation Puffer langsam, so dass die Arterienstücke bleiben auf dem Boden der Kulturrohr um Zeit zu sparen warten, bis sie umzusiedeln. Heben die Puffer Temperaturen über mehrere Schritte von Eis (4 ° C), auf Raumtemperatur (~ 24 ° C), auf 37 ° C bis Schock zu minimieren. </li><li> Die dissoc vorsichtig absaugenausstrahle Puffer aus dem Kulturröhrchen, wieder sicher zu sein, eine kleine Band mit den Gefäßsegmente zu verlassen. </li><li> Entfernen Sie die Vorwärmung Dissoziationspuffer mit Enzymen aus dem Heizblock, übertragen Sie die 1 ml Enzymlösung zu dem Kulturröhrchen, das die Gefäßsegmente und legen Sie die Kulturröhrchen wieder in den Thermoblock. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Während der Inkubation mit Enzymen, bereiten Sie das Verreiben Pipette verfüllen es mit Mineralöl und sichern Sie sie auf einer Mikro, die in einem Mikromanipulator montiert ist. Dann Einfahren der Kolben, um die Mikropipette mit 2 nl der Dissoziation Puffer zu füllen und die Position der Pipettenspitze über die Flusskammer. </li><li> Am Ende der 30 min Inkubation entfernen Kulturröhrchen aus dem Heizblock und sorgfältig absaugen Puffer wie oben. </li><li> Mit 4 ml Raumtemperatur Dissoziationspuffers waschen Arteriensegmente. Anmerkung: Es ist nicht mehr notwendig, den Behälter zu halten segmenten am Boden des Kulturröhrchen, Störung der arteriellen Stücke tatsächlich dazu beiträgt, sicherzustellen, daß restliche Enzyme wirksam entfernt werden. </li><li> Übertragung eines Gefäßsegments zu der Strömungskammer durch vorsichtiges Ansaugen mit einer 1 ml-Mikropipette, und sie in der Durchflusskammer mit 1 ml der Spaltpuffer. </li><li> Mit Hilfe der Mikromanipulator, der die Mikro, positionieren Sie die Spitze der Pipette in der Nähe von Verreiben ein Ende des Gefäßsegments. </li><li> Saugen Sie den Gefäßsegment (500 nl zurückgezogen) in das Verreiben Pipette langsam (225 nl / s), um nicht zu mechanischen Belastungen an den ECs verursachen, und werfen Sie sie in die Kammer zurück. Wenn die Verdauung erfolgreich war, werden die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von der endothelialen Rohr getrennt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Verreiben, bis alle Zellen der glatten Muskulatur dissoziiert. Seien Sie sich bewusst, dass die übermäßige Verreiben (4x oder mehr) können die ECs beschädigen und sie reagieren nicht auf Agonisten. Tipp:Verreiben mit der Pipette, bewegen Sie die Adventitia von der endothelialen Röhre so schnell wie möglich, um es von verwickelten den Schlauch halten. Anmerkung: Mit dem Verreiben Pipette kann das isolierte Endothelzellen Rohr angesaugt und in eine separate Kammer überführt werden. </li><li> Positionieren Sie den Endothelzellen Rohr in der Mitte des Flusskammer, entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet ist, und entfernen Sie das Verreiben Pipette. </li><li> Sichere Pinning Pipetten Mikromanipulatoren an jedem Ende der Durchflusskammer angeordnet ist, und die Position ihrer Spitze an den jeweiligen Enden der endothelialen Rohr. </li><li> Absenken eines Pinning Pipette über ein Ende des Rohrs, um es gegen die Unterseite der Kammer zu drücken. Positionieren der zweiten Pinning-Pipette in gleicher Weise an dem gegenüberliegenden Ende des Rohres. Hinweis: Die Platzierung der Pipetten Pinning ist ein Trade-off zwischen dem Befestigungsrohr (indem sie weiter von dem Ende des Rohrs) und sorgt für mehr Imaging / Versuchsfläche (indem sie näher an dem Ende des Rohrs). Auffinden tSaum ~ 50 &amp;mgr; m von jedem Ende des Rohrs funktioniert gut. So wie der Pinning-Pipette das Rohr berührt, langsam zurückzuziehen entlang der Achse des Rohres, wodurch Ausdehnung auf in vivo Länge nähern; drücken Sie dann die Pipette gegen den Kammerboden, um das Rohr zu sichern. </li><li> Beginnen Sie den Fluss der Superfusionslösung und damit der endothelialen Rohr, für mindestens 20 Minuten ruhen und ins Gleichgewicht zu halten (siehe Abbildung 3C). Nutzen Sie eine peristaltische Pumpe, um konstante Fluidstrom (Superfusion) durch die endotheliale Rohr zu halten. Hinweis: Pinning Pipetten entfernt werden kann, sobald der endothelialen Rohr auf den Boden der Strömungskammer (~ 25 min) verklebt oder an Ort und Stelle gelassen, um sicherzustellen, dass die endotheliale Rohr nicht wegrutschen. </li></ol> 5. Farbstoffbeladung und Calcium Imaging <ol><li> Um intrazellulären Calcium-Antworten zu visualisieren, laden Sie die endotheliale Rohr mit Fluo-04.00 Farbstoff bei Raumtemperatur (~ 24 ° C). Stopp-Fluidströmung in der Wanne, und fügen Fluo-4Uhr mit der Kammer mit einer Endkonzentration von 10 uM. Warten Sie 10 Minuten, damit der Farbstoff in die Zellen eindringen, dann superfuse die endotheliale Rohr mit frischen PSS für 20 Minuten, um sicherzustellen, extrazellulären Farbstoff entfernt wird und dass die intrazelluläre Farbstoff vollständig entes worden. </li><li> Führen Kalzium-Imaging. Für diese Arbeit eine aufrechte Mikroskop (siehe Fig. 2) mit einer drehenden Scheibe konfokalen Abbildungssystem ausgestattet war, bei Raumtemperatur verwendet. Excite das fluoreszierende Kalzium-Farbstoff mit einem 491-nm-Laser und Bilder zu erwerben (bei 500-550 nm Emission) unter Verwendung einer Digitalkamera intensiviert. </li></ol>

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<li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li>
</ol>

Hier beschreiben wir die Isolierung von Endothel-Röhrchen aus dem Meer und die Verwendung dieser Zubereitung zu visualisieren Ca 2 + Signalereignisse innerhalb seiner konstituierenden ECs. Dieses Verfahren wurde von einem ursprünglich entwickelt, um Rohre von endothelialen Arteriolen der Hamstercremaster-Muskel zu isolieren 8 angepasst. Feed Arterien des Hamsters Aufroller Muskel-und Backentasche Arteriolen 10, Maus A. epigastrica superior 6,7,9, Maus mesenterialen und zerebralen: Verwendung geringfügige Variationen der Techniken, die hier vorgestellten, haben wir endothelialen Rohre aus einer Vielzahl von Gefäßbetten, einschließlich getrennt Arterien und lymphatischen Mikrogefäßen (unveröffentlichte Beobachtungen; Referenzen werden zur Isolierung Mesenterialgefäße 12 und Hirngefäße 13 enthalten). Isolieren von endothelialen Rohre von neuen Gefäßbetten kann Veränderungen an der ursprünglichen Protokoll. Wenn Trennung nicht erfolgreich ist, ist es am besten, durch Änderung Aufschlusszeiten beginnen:Erhöhen Sie die Zeit, wenn die Verdauung endothelialen Röhren sind schwer von glatten Muskelzellen und Adventitia isolieren und reduzieren Verdauungszeit, wenn die Endothelzellen Rohr nicht intakt bleiben. Wenn eine Änderung der Verdauung mal nicht erfolgreich ist, die Konzentration der Verdauung Enzyme oder die Verdauung Temperatur sollte versucht werden. Eine weitere Option ist es, den Innendurchmesser der Pipette Verreiben, die Scherkraft bei der Beseitigung von Zellen der glatten Muskulatur erhöht reduzieren. Erhöhung der Geschwindigkeit der Fluidausstoß können auch für den gleichen Effekt versucht werden, ist aber eher die Herstellung beschädigen. Es sollte erkannt werden, dass es nicht möglich sein, intakten Endothelzellen Rohre von Gefäßen, in denen Endothelzellen nicht gut miteinander durch Junction-Proteinen verbunden isolieren. Die Dissoziation von glatten Muskelzellen folgende enzymatische Verdauung wurde zunächst unter Verwendung eines Hand-style-Pipette 8. Wir haben das Verfahren verfeinert Verreiben mit einem microsyringe System, das konsequent Isolierung von Endothelzellen mehr Rohre (bis zu 3 mm) 6 ermöglicht hat. Bei Verwendung dieses Systems wird die Pipette Verreiben mit Mineralöl aufgefüllt, um eine kontinuierliche Flüssigkeitssäule zwischen dem Kolben Steuern der Fluidbewegung und PSS-Segment enthält, das Gefäß zu liefern. Die Inkompressibilität des Fluids zusammen mit dem konstanten Antriebskraft der Mikrokolben Ergebnisse in konstanten Scher wie der Behälter wird durch die Pipettenspitze gedrückt. Demgegenüber Handtechniken oft zum Dissoziieren von Zellen (z. B. Quetschen Gummidichtung am Ende einer Pasteur-Pipette) beinhaltet die Kompression der Luft, die Variabilität in der Antriebsdruck führt und dadurch an der Pipettenspitze ausgeübte Scher. Es gibt mehrere Vorteile für die Rohrvorbereitung für das Studium endotheliale Funktion in Mikrogefäßen. Die erste ist, dass die Isolationsprozess bietet verschiedene homogene nativen Zellpopulationen von ECs und glatt muscle Zellen. Da die ECs bleiben physisch als Rohre verbunden, sind sie sich von einzelnen Zellen der glatten Muskulatur, die ein &quot;C&quot;-Konfiguration beibehalten, wenn sie während Verreiben entspannt bleiben. Somit jeweiligen Zelltypen leicht unterscheiden, z. B. bei Erhalt einer Probe zur molekularen Techniken, wie Echtzeit-PCR und Immunhistochemie 10. Da mehrere Rohre aus einem einzelnen Behälter (oder von bilateralen Gefäße für das SEA gemacht) isoliert, können molekulare Daten und Funktionsdaten aus den gleichen Gefäßen von einem bestimmten Tier erhalten werden. So Molekular Ausdruck kann mit der Funktionsverhalten von mikrovaskulären Endothelzellen korreliert werden. Weiterhin können sowohl intra-und interzellulären Signalereignisse intrinsische mikrovaskulären Endothel unabhängig vom Einfluss der hämodynamischen Kräfte (Druck, Durchfluss), vasoaktiven Substanzen in die Blutbahn (zB Hormone) durchgeführt aufgelöst werden kann, oder aus den umliegenden Zellen der glatten Muskulatur (z. B.60; über myoendothelial Kupplung 14-16), Nerven 17, 18 oder Gewebe Parenchym. Wichtig ist, da das Endothel von frisch isolierten Mikrogefäßen bezeichnet, gibt es keine Veränderung des Phänotyps, die sonst mit Kultivierungs ECs 19-21 zugeordnet ist. Zum Beispiel, kultivierte ECs verlieren Muscarin-Rezeptor-Expression und dadurch ihre Calcium-Signal-Profile zu ändern. Weiterhin können elektrophysiologischen Eigenschaften von ECs in Kultur 22 ändern. Da in den einzelnen ECs bleiben durch funktionelle Gap Junction Kanälen verbunden ist, stellt die endotheliale Rohr ein ideales Modell für die Untersuchung die Leitung der elektrischen und Ca 2 +-Signale zwischen den Zellen 6,7. Es sollte auch erkannt, dass die dissoziiert glatten Muskelzellen sind leicht mit Patch-Clamp-Techniken für komplementäre Datenmikrovaskulären Funktion 23 zugrunde liegenden sucht werden. Ein Schlüssel Beschränkung auf die endotheliale Rohr modell ist die Instabilität der Herstellung mit zunehmender Temperatur. Während die Vorbereitungen von der SEA haben bei Raumtemperatur (~ 24 ° C) und für mehrere Stunden bei 32 ° C stabil und gesund erwiesen, treten morphologische und funktionelle Abbau in weniger als einer Stunde bei 37 ° C 9. Eine zweite wichtige Einschränkung der endothelialen Rohr ist der Verlust der myoendothelial Kreuzungen und ihre inhärente Signaldomänen, die integral mit EC-Funktion in intakten Gefäßwand 14-16 sind. Es sollte auch erkannt werden, dass, während längere Rohre ermöglichen interzellularen Signalisierung über relativ große Entfernungen 6 Herstellung von Rohren ist kompliziert zu untersuchen, da sie länger werden, weil es schwieriger wird, vollständig dissoziieren umgebenden glatten Muskelzellen und Adventitia. Wir haben festgestellt, dass Rohre länger als 1-2 mm sind auch schwieriger zu positionieren und zu sichern in der Strömungskammer. Im Gegensatz dazu, während kürzere Rohre (z. B. &lt;1 mm) ENABLE Ca 2 + und elektrische Signale zu unter 8 sind, sind sie schwierig während der Superfusion in der Strömungskammer aufrechtzuerhalten. Schließlich, auch mit optimaler Isolierung von Rohren bilateral, gibt es genügend Material für die traditionellen Quantifizierung der Proteinexpression mittels Western Blots, obwohl Immunomarkierung liefert einen Index von Protein-Expression und Lokalisation. Trotz dieser Einschränkungen stellt die endotheliale Rohr eine neue Vorbereitung für die Bereitstellung neuer Einblick in die Mechanismen der mikrovaskulären Endothelzellen Funktion in vivo.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung von Endothelzellen Rohre von der Maus SEA. Die SEA ergibt sich aus der Brustwandarterie und liefert sauerstoffreiches Blut in der vorderen Bauchmuskulatur. Unsere Zusammenarbeit mit der SEA als Modell ist auf die Bereitstellung es relativ lange, unverzweigte Mikrogefäßsegmente, die für das Studium interzellulären Signalwege, die Rolle des Endothels bei der Steuerung und Koordination der Muskelzelle Entspannung der glatten zugrunde liegenden gut geeignet sind. Für diejenigen, die an anderen als Skelettmuskel Gewebe haben wir diese Technik, um ohne weiteres für den Erhalt von endothelialen Rohre von Mikrogefäße von Gehirn-, Darm und das lymphatische System angepasst werden gefunden. Die wesentlichen Merkmale dieser Methode sind, dass intakte Längen (1-3 mm) der mikrovaskulären Endothel isoliert, vor einem Deckglas in einer Durchflusskammer, in der sie mit PSS strömt gesichert, und für die Ca 2 + Signal abgebildet 7-9 oderfür die elektrische Anzeige 6,8 aufgespießt. Innerhalb der Durchflusskammer, ist die obere Hälfte eines Rohres zum Superfusionslösung ausgesetzt und reagiert auf experimentelle Eingriffe, während die untere Hälfte (in Kontakt mit dem Deckglas) wird geschützt und bleibt ruhig. Neben dem Studium sowohl intra-und interzellulären Ca 2 + Signal Veranstaltungen können Endothelzellen Rohre für die quantitative Echtzeit-PCR verwendet werden, um die Genexpression 6,10, Immunhistochemie bewerten, um die Proteinexpression 6,10 untersuchen und elektrophysiologische Untersuchungen zur biophysikalischen Eigenschaften definieren der elektrische Leitungs 6,11. Es gibt mehrere Vorteile für die endotheliale Rohrvorbereitung für das Studium der endothelialen Funktion. Zunächst erhält der Isolationsprozess bietet eine einfache Unterscheidung zwischen zwei Zellpopulationen: Endothelzellen (die Röhrenbildung bleiben) und glatten Muskelzellen (einzeln dissoziiert; normalerweise &quot;C&quot;-förmig ist, wennentspannt). Dies ermöglicht eine gezielte Probenahme und Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften Beitrag jeweiligen Zellen auf Gefäßfunktion zugrunde liegen. Zweitens, dieses Modell ermöglicht die Auflösung der Signalereignisse Eigen an das Endothel, unabhängig vom Einfluss des Blutflusses, die umliegenden glatten Muskulatur, Nerven und Parenchym. Drittens wird das Endothel untersucht, während frisch isolierten, wodurch jedoch Veränderungen in der Gen-oder Protein-Expression mit der Zellkultur.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitroprussid</td><td>Sigma</td><td>431451</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>USB-Produkte</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P-4762</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma</td><td>C-8051</td><td></td></tr><tr><td>Dithioerythritol</td><td></td><td>Sigma D-8255</td><td></td></tr><tr><td>Boroscilicate-Glas (Kanülen- und Pinning-Pipetten)</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-4</td><td></td></tr><tr><td>Boroscilicate-Glas (Verreibpipetten)</td><td>World Precision Instruments</td><td>4897</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter-Injektor-Mikrospritze</td><td>World Precision Instruments</td><td>B203MC4</td><td>aktualisiert auf Nanoliter 2010 von Nanoliter 2000</td></tr><tr><td>Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Kulturröhrchen</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>3-Achsen-Mikromanipulator</td><td>Siskiyou Corp</td><td>DT3-100</td><td>Halten und Positionieren der Pinning-Pipetten</td></tr><tr><td>Durchflusskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 & Mikro; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td>Zum Übertragen des aufgeschlossenen Gefäßsegments in die Durchflusskammer</td></tr><tr><td>1 ml Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>02-707-405</td><td>Zum Übertragen des verdauten Gefäßsegments in die Durchflusskammer</td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td>Das eigentliche Mikroskop bleibt dem Benutzer</td></tr> überlassen <tr><td>Spinning Disc Konfokales System</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Konfokale Bildgebung ist optional</td></tr><tr><td>XR/TURBO EX Kamera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR/TURBO EX</td><td>Ideal für unsere Bedürfnisse; kann je nach Benutzer</td></tr><tr><td>variieren Piper Control Software</td><td>Stanford Photonics</td><td></td><td>Imaging Software für TURBO EX Kamera</td></tr><tr><td>Stereomikroskopie</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>kann je nach Benutzer variieren</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Minutiens Insektenstifte</td><td>Austerlitz</td><td>M Größe 0,15 mm</td><td></td></tr><tr><td>GP Millipore Express PLUS Membran</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-Ritzgerät</td><td>Austin Flameworks</td><td>Kleines Hand-Schneidewerkzeug</td><td>austinflameworks.com</td></tr><tr><td>Kompakter Haustiertrimmer</td><td>Wahl Clipper Corp.</td><td>Modell 9966</td><td>Nach jedem Gebrauch gut reinigen, um das Leben zu erhalten</td></tr></tbody></table>

microvascular endothelial isolierung von rohren aus maus widerstand arterien

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Die Steuerung des Blutflusses durch den Widerstand Gefäß regelt die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, gleichzeitig mit der Entfernung von Stoffwechselprodukten, wie durch die Ausübung Skelettmuskel veranschaulicht. Endothelzellen (ECs) säumen die Intima aller Widerstandsgefäße dienen und eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Durchmesser (zB Endothel-abhängige Vasodilatation) und damit die Größe und Verteilung der Gewebedurchblutung. Die Regulierung der Gefäßwiderstand durch ECs wird durch intrazelluläre Ca 2 +-Signalisierung, die die Produktion von diffusionsfähigen Autacoide (z. B. Stickstoffmonoxid und Arachidonsäure-Metaboliten) führt 1-3 und Hyperpolarisation bewirkt 4,5, die Entspannung der glatten Muskelzellen zu entlocken. So das Verständnis der Dynamik der endothelialen Ca 2 +-Signal ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis Mechanismen, die Blutflusskontrolle. Isolieren von endothelialen Rohre beseitigt Störvariablen mit bl verbundenenOOD im Gefäßlumen und mit umgebenden glatten Muskelzellen und perivaskuläre Nerven, die sonst EG Struktur und Funktion zu beeinflussen. Hier präsentieren wir die Isolierung von Endothel-Rohre von der A. epigastrica superior (SEA) mit einem Protokoll für dieses Schiff optimiert. Um endothelialen Rohre von einer narkotisierten Maus zu isolieren, wird die SEA in situ ligiert, um Blut in das Gefäßlumen zu halten (zur Erleichterung bei der Präparation visualisieren), und das gesamte Blatt Bauchmuskel wird ausgeschnitten. Das Meer ist frei von umgebenden Skelettmuskulatur und Bindegewebe seziert, wird Blut aus dem Lumen gespült und milde enzymatische Verdauung wird durchgeführt, um die Entfernung der Adventitia, Nerven und Zellen der glatten Muskulatur mit sanften Verreiben zu ermöglichen. Diese frisch isoliert Vorbereitungen von intakten Endothel behalten ihre Mutter Morphologie, mit individuellen ECs bleibt funktionell miteinander gekoppelt sind, in der Lage, chemische und elektrische si übertragengnale interzellulär durch gap junctions 6,7. Neben der Bereitstellung von neuen Einblick in Calcium-Signal-und Membranbiophysik, diese Präparate ermöglichen molekulare Untersuchungen der Genexpression und Proteinlokalisierung in nativen mikrovaskulären Endothel.

Calcium Antworten können in frisch isolierten Endothelzellen Rohre mit Acetylcholin (ACh) eingeleitet werden. In diesem Film wird eine endotheliale Rohr mit 10 uM Fluo-04.00 beladen mit Superfusion von 1 uM ACh (Movie 1) stimuliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> . Der Farbstoff wird bei 491 nm angeregt und Emission von 500 bis 550 nm unter Verwendung eines verstärkten ladungsgekoppelte Vorrichtung Kamera aufgezeichnet. Bild Stapel werden mit 120 Bildern / s für eine 25 Sekunden Zeitraum erfasst und können dann gemittelt werden (zB zu 40 Bilder / s). Repräsentative Fluoreszenzbilder im Laufe der Zeit sind in Abbildung 4 dargestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Flusskammer und Pipetten bei der Isolierung von Endothel-Rohre verwendet. </strong&gt; A) Die Flusskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas als Basis. B montiert) Beispiele für eine gezogen (links) und einer gezogen, gebrochen, polierte und abgewinkelte (rechts) Kanülierung Pipette. Diese Pipette wird verwendet, um Erythrozyten aus dem Lumen der Arterie zu spülen folgenden Dissektion. Maßstabsbalken = 200 um. C) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Verreiben Pipette. Der Innendurchmesser dieser Pipette wird der Außendurchmesser der Arterie bestimmt. Maßstabsbalken = 200 um. D) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Pinning Pipette. Die Spitze dieses Pipette wird abgerundet und vollständig abgedichtet, um die Endothel-Röhre in der Strömungskammer zu sichern. Maßstabsbalken = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> 2. Spinning Disc-Konfokalmikroskop für die Bildgebung von Ca 2 +-Signale. A) Upright-Mikroskop für Calcium-Bildgebung verwendet. B) (a) Die konfokale Spinning Disc-Einheit mit einem (b) intensiviert charge coupled device Kamera. C) Immersionsobjektive (a) 63X ( NA = 1) und (b) 20x (NA = 0,5) für die Bildgebung verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> 3. Isolation der Bauchmuskulatur und A. epigastrica superior. A </strong&gt;) anästhesiert Maus mit Bauchmuskel freigelegt und mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung gespült. Rote Pfeile markieren die Standorte unter Fettpolster, an dem jeweiligen SUP geben Sie jeden geraden Bauchmuskel (also dort, wo Schiffe sollten ligiert werden). Maßstabsbalken = 1 cm. B) Isolierte Bauchmuskel (unilateral) und SEA in einer Dissektion Kammer für die Mikrodissektion merken. Rote Pfeil zeigt die erste große Verzweigungsstelle der SEA (dh der Punkt, an dem die Reinigung der Behälter wird gestoppt). Maßstabsbalken = 1 cm. C) Isolierte Endothelzellen Rohr von einer SUP. Differential-Interferenz-Kontrast-Bild eines Endothelrohr folgenden 1 h Inkubation bei Raumtemperatur. Die Endothelzellen Rohr wurde mit Superfusion-Puffer bei 3 ml / min überspült. Maßstabsbalken = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . 4. Calcium-Fluoreszenz in einer Endothelzelle Rohr. Repräsentative Fluoreszenzbildern eines endothelialer Gefäße in Reaktion auf die Stimulierung mit 1 uM Acetylcholin. A) Fluoreszenz vor der Stimulation. B) Endothelrohr Fluoreszenz bei der Verabreichung von Acetylcholin, t = 0 sek. C) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 5 Sekunden. D) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 10 Sekunden. E) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 15 Sekunden. F) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 20 Sekunden. Maßstabsbalken = 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Wir präsentieren eine Vorbereitung für die Visualisierung und Manipulation von Calcium-Signal in nativer, intakte mikrovaskulären Endothel. Endothelial Rohre frisch aus Maus Widerstand Arterien Skelettmuskel in vivo behalten Morphologie und dynamische Signalisierung innerhalb und zwischen benachbarten Zellen isoliert. Endothelzellen Rohre können aus Mikrogefäßen anderer Gewebe und Organe hergestellt werden.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Endothelzellschläuche aus der oberen epigastrischen Arterie der Maus oder SEA zu isolieren, um die intra- und interzellulären Signalisierungsdynamiken eines nativen, intakten mikrovaskulären Endothels zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die SEA aus der Bauchmuskulatur der Maus isoliert wird. Im zweiten Schritt wird das Gefäß vorsichtig und selektiv verdaut und anschließend sorgfältig TAT-bearbeitet, um die glatten Muskelzellen und die Adventitia von der Endothelzellschläuche zu lösen.Im letzten Schritt wird das Röhrchen in einer Durchflusskammer befestigt und mit einer physiologischen Kochsalzlösung überströmt. Abschließend kann die konfokale Bildgebung verwendet werden, um die Kalziumsignalisierung in dem intakten mikrovaskulären endothelialen Röhrchen im ursprünglichen Zustand zu visualisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kultivierung endothelialer Zellen liegt darin, dass die endothelialen Zellen, aus denen das Röhrchen besteht, ihre native Morphologie, Proteinausprägung und Reaktionsfähigkeit beibehalten. Das Endothel spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Blutflusses im gesamten Körper.Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es uns, die zellulären Signalübertragungsereignisse zu untersuchen, die die Durchblutungsregulation vermitteln, und zu analysieren, wie diese bei vaskulärer Dysfunktion gestört werden können. Um zunächst die SEA zu isolieren, führen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut direkt oberhalb der Schamgegend einer anästhesierten Maus durch, verlängern den Schnitt beidseitig lateral in Richtung der jeweiligen Hintergliedmaßen und setzen den Schnitt dann entlang der ventralen Mittellinie bis zum oberen Rand des Brustkorbs fort, wobei Sie den Schnitt weiter beidseitig lateral zu den jeweiligen vier Gliedmaßen verlängern. Heben Sie nun vorsichtig die Haut an und durchtrennen Sie das Bindegewebe, das die Haut mit der darunterliegenden Muskulatur verbindet, um die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur freizulegen.Bewässern Sie den freigelegten Muskel mit einer Salzlösung bei Raumtemperatur. Heben Sie dann unter einem Stereomikroskop das am unteren Ende des Brustbeins gelegene Fettgewebe an. Führen Sie einen Schnitt durch das Fettgewebe und entlang der untersten Rippe.Die SEA sollte nun sichtbar sein; achten Sie darauf, die Arterie nicht zu beschädigen, und spülen Sie das freigelegte Gewebe mit weiterer isotonischer Kochsalzlösung bei Raumtemperatur aus. Nachdem die oberste Schicht der Skelettmuskulatur zurückgeklappt wurde, beachten Sie die Länge der SEA und entfernen Sie dann vorsichtig die dünne Muskelschicht unterhalb der Arterie. Verwenden Sie danach gebogene Pinzette, um ein Stück Seidennaht (6-0) unter der SCA hindurchzuführen.Anschießend die Arterie und die angrenzende Vene ligieren, um den Druck aufrechtzuerhalten und das Blut im Lumina des Gefäßes zu halten. Nach der Ligatur der SCA auf der kontralateralen Seite einen Schnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskulatur durchführen, um die entsprechenden Seiten zu trennen, und den Schnitt dann lateral in beide Richtungen wie bereits bei der Haut erweitern. Den Schnitt vertikal entlang der äußeren Kante fortsetzen, um die Bauchmuskulatur vollständig vom Körper zu lösen.Schneiden Sie dann den SEA oberhalb der Ligatur durch, um die Dichtung beizubehalten, und legen Sie den isolierten Muskel und die Arterie in einen 50-Milliliter-Becher, der 10 Milliliter Pufferlösung zur Dissektion mit einer Temperatur von vier Grad Celsius enthält. Nach der Isolation des Muskels von der anderen Seite des Abdomens werden die Gewebe 10 Minuten lang in der Dissektionspufferlösung inkubiert. Legen Sie nun den Bauchmuskel mit dem SEA in eine mit einer Schicht aus Cyl-Guard beschichtete Petrischale mit einer Temperatur von vier Grad Celsius, die Dissektionspuffer enthält. Verwenden Sie Insektenspitzen mit 0,15 Millimeter Durchmesser, um den SEA und den Muskel auf ihre zuvor notierten, ungefähren in-vivo-Längen zu spannen.Befestigen Sie die SEA am Zylindergitter, sodass der Muskel so ausgerichtet ist, dass die dünne Schicht, die der Peritonealhöhle zugewandt ist, oben liegt. Gehen Sie dann vom proximalen Ligationsort in Richtung distales Ende vor und freilegen etwa ein bis zwei Zentimeter der SEA von ihrem begleitenden Venenpaar und dem umgebenden Gewebe, bis zur ersten größeren Seitenaststelle. Durchtrennen Sie die SEA direkt oberhalb der Aststelle und direkt unterhalb der Ligatur.Verwenden Sie anschließend ein Stück Gummischlauch, um das hintere Ende einer Pipette an eine Fünf-Milliliter-Spritze anzuschließen, die eiskaltes Dissektionspuffer enthält. Befestigen Sie die Kanüllierpipettenspitze innerhalb der Dissektionskammer und kanülieren Sie die SEA. Sobald alle Erythrozyten ausgespült wurden, nehmen Sie die SEA von der Kanüllierpipette ab und entfernen Sie die Pipette aus der Dissektionschale, um die endothelialen Röhrchen zu isolieren.Füllen Sie zunächst ein 12 × 75 mm großes Glas-Kulturgefäß zur Hälfte mit eiskaltem Dissektionspuffer. Nachdem Sie die A. mesenterica superior in Stücke von ein bis drei Millimeter Länge geschnitten haben, überführen Sie die arteriellen Stücke mit einer gebogenen Pinzette in das Kulturgefäß und stellen das Gefäß auf Eis. Geben Sie anschließend Digestionsenzyme in einen separaten 12 × 75 mm großen Kulturschlauch und ergänzen Sie den Dissoziationspuffer auf ein Endvolumen von einem Milliliter. Erwärmen Sie die Enzymlösung in einem Heizblock auf 37 Grad Celsius vor. Entfernen Sie das Kulturgefäß mit den Arterienstücken von vier Grad Celsius und stellen Sie es bei Raumtemperatur ab, um es aufzuwärmen, während die Enzymlösung auf 37 Grad Celsius erwärmt wird. Aspirieren Sie vorsichtig den nun auf Raumtemperatur gebrachten Dissektionspuffer aus dem Kulturgefäß, wobei ein kleines Volumen, das die Gefäßsegmente enthält, zurückbleibt. Geben Sie nun langsam enzymfreien, auf Raumtemperatur gebrachten Dissoziationspuffer zu den Gefäßsegmenten, sodass die Arterienstücke am Boden des Kulturgefäßes verbleiben, um verbleibenden Dissektionspuffer wegzuspülen.Sobald die Enzymlösung 37 Grad Celsius erreicht hat, aspirations die Dissoziationspufferlösung erneut aus dem Kulturgefäß mit den Gefäßsegmenten, wobei ein kleines Volumen mit den Gefäßsegmenten zurückbleibt. Übertragen Sie nun die 37-Grad-Enzymlösung in das Kulturgefäß und inkubieren Sie das Kulturgefäß 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Heizblock. Während der Inkubation bereiten Sie eine Litrierpipette vor, die mit Mineralöl rückgefüllt wurde, ritzen Sie die Pipette an, führen Sie einen sauberen Bruch durch, brechen Sie die Pipette mit einer feuererhitzten Pinzette und polieren Sie die Spitze der Pipette, bevor Sie sie an einer Mikrospritze befestigen, die in einem Mikromanipulator montiert ist.Ziehen Sie dann den Mikrospritzenkolben zurück, um die Pipette mit zwei Nanolitern Dissoziationspuffer zu füllen, und positionieren Sie die Pipettenspitze über der Durchflusskammer am Ende der Inkubation. Nachdem der Puffer, wie zuvor gezeigt, vorsichtig aspiriert wurde, spülen Sie die arteriellen Segmente mit vier Milliliter Dissoziationspuffer bei Raumtemperatur aus. Aspirieren Sie anschließend vorsichtig ein Gefäßsegment mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette und geben Sie das Gefäß in eine Durchflusskammer mit einem Milliliter des Dissoziationspuffers.Platzieren Sie die Spitze der Pipette nahe einem Ende des Gefäßsegments und saugen Sie das Gefäßsegment dann mit etwa 225 Nanolitern pro Sekunde in die Pipette auf, um mechanische Belastungen der endothelialen Zellen zu vermeiden. Drücken Sie das Gefäß anschließend wieder in die Kammer zurück. War die Verdauung erfolgreich, werden die glatten Muskelzellen und die Adventitia vom endothelialen Gefäßröhren isoliert. Entfernen Sie die Adventitia so schnell wie möglich vom endothelialen Gefäß, um eine Verflechtung mit diesem zu verhindern, und wiederholen Sie den Vorgang wie gerade gezeigt, bis alle glatten Muskelzellen abgetrennt sind.Nach der letzten Wiederholung wurde die isolierte endotheliale Röhre mittig in die Durchflusskammer platziert, entlang der Flussrichtung ausgerichtet, und die Auslösepipette entfernt. Sichern Sie die Fixierpipetten in Mikromanipulatoren, die an beiden Enden der Durchflusskammer befestigt sind, und positionieren Sie deren Spitzen jeweils an den gegenüberliegenden Enden der endothelialen Röhre. Senken Sie die Fixierpipetten nacheinander über die beiden Enden der Röhre, wodurch die Röhre etwa 50 Mikrometer von jedem Ende entfernt gegen den Boden der Kammer gedrückt wird.Während die Fixierpipette das Gefäß berührt, ziehen Sie sie langsam entlang der Achse des Gefäßes zurück und dehnen Sie es auf seine ungefähre in-vivo-Länge aus. Drücken Sie die Pipette gegen den Boden der Kammer, um das Gefäß zu fixieren, und beginnen Sie anschließend mit dem Fluss der Überströmungslösung mithilfe einer peristaltischen Pumpe, um einen konstanten Durchfluss der Überströmungslösung über das endotheliale Gefäß aufrechtzuerhalten. Auf diesem differentiellen Interferenzkontrastbild ist ein isoliertes endotheliales Zellgefäß aus einem SEA nach einer einstündigen Überströmung mit Überströmungspuffer bei drei Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur dargestellt.Dieses Video zeigt die Kalziumantworten eines mit Fluo-4 beladenen endothelialen Zellgefäßes nach Stimulation mit einer Einwirkung von einem Mikromolar Acetylcholin. Diese repräsentativen Fluoreszenzbilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation der endothelialen Gefäße mit Acetylcholin aufgenommen. Beachten Sie, wie sich das intrazelluläre Kalzium im Zeitverlauf verändert.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, den endothelialen Schlauch während der Dreipunkt-Positionierung und Fixierung nicht mechanisch zu beschädigen, da die Endothelzellen äußerst empfindlich und leicht schädigbar sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man endotheliale Schläuche aus der oberen epigastrischen Arterie der Maus isoliert und dadurch das native, intakte mikrovaskuläre Endothel untersuchen kann.

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Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung der Endothelröhren aus dem Hirnparenchym der Maus. Durch eine Kombination aus enzymatischem Verdau und mechanischer Dissoziation entsteht eine intakte Röhre mit Endothelzellen.

Präparation von zerebralen Endotheltuben aus parenchymalen Arteriolen der Maus

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung.  Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Erfahren Sie die Isolierung von Endothelrohren aus der oberen Epigastrikarterie der Maus zur Untersuchung von Calcium-Signalwegen in nativem Mikrovaskularendothel. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung intakter Zellstrukturen.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

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