Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Endothelzellröhrchen aus der oberen epigastrischen Arterie (SEA) der Maus zu isolieren, um die intra- und interzelluläre Signaldynamik eines nativen intakten mikrovaskulären Endothels zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst das SEA von der Bauchskelettmuskelwand der Maus isoliert wird. Im zweiten Schritt wird das Gefäß schonend und somatisch verdaut und anschließend schonend TATisiert, um die glatten Muskelzellen und Adventitia von der Endothelzellröhre zu dissoziieren.

Im letzten Schritt wird das Röhrchen in einer Durchflusskammer fixiert und mit einer physiologischen Kochsalzlösung überfusioniert. Letztendlich kann die konfokale Bildgebung verwendet werden, um die Kalziumsignalübertragung in der nativen intakten mikrovaskulären Endothelröhre sichtbar zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kultivierung von Endothelzellen besteht darin, dass die Endothelzellen, aus denen die Röhre besteht, ihre native Morphologie, Proteinexpression und Reaktionsfähigkeit beibehalten. Das Endothel ist ein wesentlicher Bestandteil der Blutflusskontrolle im gesamten Körper.

Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es uns, die Signalereignisse von Zelle zu Zelle zu untersuchen, die die Kontrolle des Blutflusses vermitteln, und wie sie bei vaskulärer Dysfunktion schief gehen können. Um die SEA zuerst zu isolieren, machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut knapp über dem Bereich der Schamregion einer anästhesierten Maus, verlängern Sie den Schnitt lateral in jede Richtung zu den jeweiligen Hintergliedmaßen und setzen Sie dann den Schnitt entlang der ventralen Mittellinie bis zur Spitze des Brustkorbs fort, wobei Sie den Schnitt weiter seitlich in jede Richtung zu den jeweiligen vier Gliedmaßen verlängern. Heben Sie nun die Haut sanft an und durchtrennen Sie das Bindegewebe, das die Haut mit dem darunter liegenden Muskel verbindet, wodurch die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur freigelegt wird.

Spülen Sie den freiliegenden Muskel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur. Heben Sie dann unter einem Stereomikroskop das Fettpolster an, das sich an der Unterseite des Brustbeins befindet. Machen Sie einen Schnitt durch das Fettpolster und entlang der unteren Rippe.

Das SEA sollte jetzt sichtbar sein, wobei darauf zu achten ist, dass die Arterie nicht beschädigt wird, und das freiliegende Gewebe mit einer Kochsalzlösung mit mehr Raumtemperatur bewässert wird. Nachdem die oberste Schicht des Skelettmuskels zurückgezogen wurde, notieren Sie die Länge des SEA und schneiden Sie dann vorsichtig die dünne Muskelschicht unter der Arterie heraus. Führen Sie als Nächstes mit einer abgewinkelten Pinzette eine Länge von sechs Oh Seidennaht unter die SCA hindurch.

Ligattieren Sie dann die Arterie und die angrenzende Vene, um sie unter Druck zu halten und das Blut im Gefäßlumen zu halten. Nachdem Sie die SCA auf der kontralateralen Seite ligiert haben, machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskeln, um die jeweiligen Seiten zu trennen, und verlängern Sie dann den Schnitt seitlich in jede Richtung, wie es für die Haut getan wird. Setze den Schnitt senkrecht entlang der Außenkante fort, um den Bauchmuskel vollständig vom Körper zu trennen.

Schneiden Sie dann die SEA oberhalb der Ligatur ab, um die Abdichtung zu erhalten, und legen Sie den isolierten Muskel und die Arterie in ein 50-Milliliter-Becherglas mit 10 Millilitern vier Grad Celsius Dissektionspuffer. Nachdem Sie den Muskel von der anderen Seite des Bauches isoliert haben, inkubieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang in Dissektionspuffer. Platzieren Sie nun den Bauchmuskel, der das SEA enthält, in einer vier Grad Celsius heißen Petrischale, die mit einer Schicht aus Zylinderschutz beschichtet ist und Dissektionspuffer enthält. Verwenden Sie 0,15 Millimeter Insektenstifte, um das SEA und den Muskel auf ihre zuvor notierte ungefähre In-vivo-Länge zu dehnen.

Befestigen Sie das SEA am Zylinderschutz und richten Sie den Muskel so aus, dass die dünne Schicht zum Peritoneum hin darauf liegt. Dann wird von der oberen Stelle der Ligatur zum stromabwärts gelegenen Ende etwa ein bis zwei Zentimeter der SEA von ihrer paarigen Vene und dem umgebenden Gewebe bis zur ersten großen Verzweigungsstelle entfernt. Schneiden Sie die SEA direkt über der Aststelle und direkt unter der Ligatur.

Befestigen Sie als Nächstes mit einem Stück elastischem Schlauch das Backend einer Pipette an einer Fünf-Milliliter-Spritze mit eiskaltem Dissektionspuffer. Befestigen Sie die Kanülenpipettenspitze in der Dissektionskammer und kanülieren Sie die SEA. Sobald alle Erythrozyten ausgespült wurden, entfernen Sie das SEA aus der Kanülenpipette und nehmen Sie die Pipette aus der Sezierschale, um die Endothelröhrchen zu isolieren.

Füllen Sie zunächst ein 12 x 75 Millimeter großes Glaskulturröhrchen zur Hälfte mit eiskaltem Dissektionspuffer. Nachdem Sie das SEA in ein bis drei Millimeter große Stücke geschnitten haben, übertragen Sie die arteriellen Stücke mit einer abgewinkelten Pinzette in das Kulturröhrchen und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Anschließend werden die Verdauungsenzyme mit dem Dissoziationspuffer in einem separaten 12 x 75 Millimeter großen Kulturröhrchen auf ein Endvolumen von einem Milliliter vermischt und die Enzymlösung mit einem Heizblock auf 37 Grad Celsius vorgewärmt.

Entfernen Sie das Kulturröhrchen mit den arteriellen Stücken aus einer Temperatur von vier Grad Celsius und stellen Sie es zum Erwärmen bei Raumtemperatur auf, während sich die Enzymlösung auf 37 Grad Celsius erwärmt. Der jetzt bei Raumtemperatur hergestellte Dissektionspuffer wird vorsichtig aus dem Kulturröhrchen aspiriert, wobei ein kleines Volumen mit den Gefäßsegmenten verbleibt. Geben Sie nun langsam Dissoziationspuffer bei Raumtemperatur ohne Enzyme in die Gefäßsegmente, so dass die arteriellen Stücke am Boden des Kulturröhrchens verbleiben, um den verbleibenden Dissektionspuffer wegzuspülen.

Sobald die Enzymlösung 37 Grad Celsius erreicht hat, aspirieren Sie den Dissoziationspuffer wieder aus dem Kulturröhrchen, das die Gefäßsegmente enthält, und lassen Sie ein kleines Volumen mit den Gefäßsegmenten übrig. Gib nun die 37 Grad heiße Enzymlösung in das Kulturröhrchen und inkubiere das Kulturröhrchen im Heizblock für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie während der Inkubation eine mit Mineralöl verfüllte Literationspipette vor, ritzen Sie die Pipette ein, machen Sie einen sauberen Bruch, brechen Sie die Pipette mit einer Pinzette, polieren Sie die Spitze der Pipette und befestigen Sie sie auf einer Mikrospritze, die in einem Mikromanipulator montiert ist.

Ziehen Sie dann den Mikrospritzenkolben zurück, um die Pipette mit zwei Nanolitern Dissoziationspuffer zu füllen, und positionieren Sie die Pipettenspitze am Ende der Inkubation über der Durchflusskammer. Nachdem Sie den Puffer wie gerade gezeigt vorsichtig abgesaugt haben, waschen Sie die arteriellen Segmente mit vier Millilitern Dissoziationspuffer bei Raumtemperatur. Anschließend wird ein Gefäßsegment vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette aspiriert und das Gefäß mit einem Milliliter des Dissoziationspuffers in eine Durchflusskammer gelegt.

Positionieren Sie die Spitze der Tatorpipette in der Nähe eines Endes des Gefäßsegments und aspirieren Sie dann das Gefäßsegment mit etwa 225 Nanolitern pro Sekunde in die Tatingpipette, um eine mechanische Belastung der Endothelzellen zu vermeiden, und werfen Sie das Gefäß zurück in die Kammer. War die Verdauung erfolgreich, werden die glatten Muskelzellen und Adventitia von der Endothelröhre dissoziiert. Bewegen Sie die Adventitia so schnell wie möglich von der Endothelröhre weg, um zu verhindern, dass sie sich in der Röhre verwickelt, und wiederholen Sie dann die Tation wie gerade gezeigt, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind.

Nach der letzten Iteration platzierte ASEE den isolierten Endothelschlauch in der Mitte der Durchflusskammer, richtete ihn entlang der Strömungsrichtung aus und entfernte die auslösende Pipette. Befestigen Sie die Pinning-Pipetten in Mikromanipulatoren, die an beiden Enden der Durchflusskammer angebracht sind, und positionieren Sie dann ihre Spitzen an den jeweiligen Enden des Endothelröhrchens. Senken Sie die Steckpipetten nacheinander über die gegenüberliegenden Enden des Röhrchens ab und drücken Sie das Röhrchen gegen den Boden der Kammer, etwa 50 Mikrometer von jedem Ende des Röhrchens entfernt.

So wie die Pinning-Pipette das Röhrchen berührt, ziehen Sie es langsam entlang der Achse des Röhrchens zurück und verlängern Sie es auf seine ungefähre In-vivo-Länge. Drücken Sie die Pipette gegen den Kammerboden, um das Röhrchen zu sichern, und beginnen Sie dann mit dem Fluss der Superfusionslösung mit einer Peristaltikpumpe, um einen konstanten Fluss der Superfusionslösung durch das Endothelröhrchen aufrechtzuerhalten. In diesem differentiellen Interferenzkontrastbild ist ein isoliertes Endothelzellröhrchen aus einem SEA zu sehen, das einer einstündigen Superfusion mit Superfusionspuffer bei drei Millilitern pro Minute bei Raumtemperatur folgt.

Dieser Film zeigt die Kalziumreaktionen einer mit Grippe oder vier beladenen Endothelzellröhren als Reaktion auf eine mikromolare Acetylcholin-Stimulation. Diese repräsentativen Fluoreszenzbilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation der Endothelröhre mit Acetylcholin aufgenommen. Beachten Sie, wie das intrazelluläre Kalzium im Laufe der Zeit oszilliert.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Endothelröhre während der Tri-Positionierung und des Pinnings nicht mechanisch beschädigt wird, da die Endothelzellen extrem empfindlich und leicht zu beschädigen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie Endothelkanülen aus der oberen epigastrischen Arterie der Maus isolieren und dadurch das native intakte mikrovaskuläre Endothel untersuchen können.