Name: Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie die optische Dual-Farb-Mapping-Technik zur Untersuchung elektrophysiologischer Eigenschaften von CPVT-Mäuseherzen. Diese Methode erfasst gleichzeitig Membranpotenzial und Calciumsignale unter verschiedenen Pacing-Protokollen.

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Diese Studie wird von der National Natural Science Foundation of China (81700308 zu XO und 31871181 zu ML und 82270334 zu XT), dem Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 bis XO, 23ZYZYTS0433 und 2022YFS0607 bis XT und 2022NSFSC1602 bis TC) und dem State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 bis XO) unterstützt. MRC (G10031871181 bis ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE in Oxford (ML) Stipendien.

Für die Experimente werden männliche 10 bis 14 Wochen alte Wildtyp-Mäuse oder RyR2-R2474S/+-Mäuse (C57BL/6-Hintergrund) mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Alle Verfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -verwendung der Southwest Medical University, Sichuan, China, genehmigt (Zulassungs-Nr.: 20160930) in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien, nach denen die Einrichtung arbeitet.
1. Vorbereitung
<ol><li>Lagerlösungen<ol><li>Blebbistatin-Stammlösung: 1 ml 100%iges Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Originalkolben mit 2,924 mg (-) Blebistatin-Pulver geben, um eine Konzentration von 10 mM zu erreichen.</li>
		<li>Spannungsanzeiger RH237 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in den Originalkolben mit 1 mg RH237-Pulver geben, um eine Konzentration von 2,01 mM zu erreichen.</li>
		<li>Kalziumindikator Rhod-2 AM Stammlösung: Geben Sie 1 ml 100% DMSO in 1 mg Rhod-2 AM-Pulver, um eine Konzentration von 0,89 mM zu erreichen.</li>
		<li>Pluronic F127 Stammlösung: 1 ml 100% DMSO in 200 mg Pluronic F127 geben, um eine Konzentration von 20% w/v (0,66 mM) zu erreichen.</li>
		<li>Aliquotieren Sie die Stammlösungen in 200-μl-PCR-Röhrchen in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM und 51 μl Blebbistatin) zur einmaligen oder doppelten Verwendung, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Wickeln Sie die Lösungen dann in Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie bei -20 °C, mit Ausnahme der Pluronic F127-Stammlösung, die in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur gelagert wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusionslösung<ol><li>Krebslösung (in mM): Bereiten Sie 1 L Krebslösung (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 und Glucose 10) vor.</li>
		<li>Die Lösung wird mit einem aseptischen 0,22-μm-Nadelfilter filtriert und mit 95 % O2/5 %CO2 oxygeniert.</li>
		<li>Nehmen Sie 40 ml Krebslösung in ein 50-ml-Zentrifugalröhrchen und lagern Sie es bei 4 °C für die anschließende Herzisolierung.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Langendorff-Perfusionssystem und das optische Mapping-Gerät<ol><li>Richten Sie das Langendorff-Perfusionssystem ein.<ol><li>Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.</li>
			<li>Waschen Sie das Langendorff Perfusionssystem mit 1 L deionisiertem Wasser.</li>
			<li>Perfundiert die Lösung aus dem Ansaugtrakt und stellen Sie die Abflussrate auf 3,5-4 ml/min ein. Anschließend wird das Perfusat mit O2/CO2-Gas (95 %/5 %) bei 37 °C oxygeniert. HINWEIS: Eine Blase ist im Perfusionssystem niemals erlaubt.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereiten Sie das optische Mapping-System vor.<ol><li>Installieren Sie die EMCCD-Kamera (512 × 512 Pixel), die Linse (40-fache Vergrößerung), die Leuchtdioden (LEDs) des Wellenlängenteilers, den EKG-Monitor (Elektrokardiogramm) und die Stimulationselektrode (Abbildung 1).</li>
			<li>Stellen Sie den richtigen Arbeitsabstand zwischen der Linse und der Herzposition ein.</li>
			<li>Stellen Sie zwei LEDs an der diagonalen Position des Thermostatbades für eine gleichmäßige Ausleuchtung ein und stellen Sie eine Wellenlänge von 530 nm zur Erzeugung von Anregungslicht bereit. Verwenden Sie einen ET525/50 Sputter-beschichteten Filter, um jegliches Out-of-Band-Licht für die LEDs zu entfernen.</li>
			<li>Stellen Sie den Griffschalter so ein, dass ein gleichmäßiges Quadrat der Zieloberfläche erreicht wird, sodass die Spannungs- und Kalziumbilder auf der Erfassungsschnittstelle angemessen angezeigt werden.</li>
			<li>Drehen Sie die Blende des Objektivs auf den maximalen Durchmesser, um ein Austreten von Spannungs- oder Kalziumsignalen zu vermeiden.</li>
			<li>Stellen Sie das Kameraobjektiv auf die richtige Höhe ein, da es einen feinen Arbeitsabstand zum Thermostatbad hat, meistens werden 10 cm verwendet.</li>
			<li>Schalten Sie die Kamera für eine stabile Probenahmetemperatur bei -50 °C ein.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Verfahren
<ol><li>Entnahme, Kantubierung und Perfusion von Mäuseherzen<ol><li>Intraperitoneal injizieren Sie den Tieren Avertinlösung (1,2 %, 0,5-0,8 ml) und Heparin (200 Einheiten), um Leiden und Schmerzreflexe zu minimieren und die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Nach 15 Minuten opfern Sie die Tiere durch Gebärmutterhalsverrenkung.</li>
		<li>Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere, entnehmen Sie das Herz vorsichtig und legen Sie es in die kalte Krebslösung (4 °C, 95 % O2, 5 %CO2), um den Stoffwechsel zu verlangsamen und das Herz zu schützen.</li>
		<li>Entfernen Sie das umliegende Gewebe der Aorta, kanülieren Sie die Aorta mit einer speziell angefertigten Kanülennadel (Außendurchmesser: 0,8 mm, Innendurchmesser: 0,6 mm, Länge: 27 mm) und fixieren Sie sie mit einer 4-0 Seidennaht.</li>
		<li>Das Herz mit dem Langendorff-System mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3,5-4,0 ml/min durchbluten und die Temperatur bei 37 ± 1 °C halten. HINWEIS: Alle nachfolgenden Verfahren werden in diesem Zustand ausgeführt.</li>
		<li>Führen Sie ein kleines Kunststoffröhrchen (0,7 mm Durchmesser, 20 mm Länge) in die linke Herzkammer ein, um den Lösungsstau in der Kammer zu lösen und eine Überlastung zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Entkoppler von Anregungs-Kontraktion und Dual-Dye-Beladung<ol><li>Stecken Sie zwei Elektroden in das Perfusat in der Badewanne, schalten Sie die Stromversorgung der EKG-Verstärkerbox und des elektrischen Stimulationsreglers ein und starten Sie dann die referenzierte EKG-Software und überwachen Sie das EKG kontinuierlich.</li>
		<li>Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch, wenn das Herz einen stabilen Zustand erreicht hat (das Herz schlägt rhythmisch mit ~400 Schlägen pro Minute).</li>
		<li>Mischen Sie 50 μl 10 mM Blebistatin-Stammlösung mit 50 ml Krebslösung, um eine Konzentration von 10 μM zu erreichen. Perfusionieren Sie die Blebistatin-Krebs-Lösungsmischung 10 Minuten lang konstant in das Herz, um die Kontraktion von der Erregung zu entkoppeln und Kontraktionsartefakte während des Filmens zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine rote Taschenlampe, um zu überprüfen, ob die Herzkontraktion vollständig aufhört, da die Kontraktion die Qualität der Farbstoffbeladung beeinflusst.</li>
		<li>Nach der Entkopplung von Anregung und Kontraktion werden 15 μl Rhod-2 AM-Stammlösung mit 15 μl pluronic F127-Stammlösung in 50 ml Krebslösung gemischt, um die Endkonzentrationen von 0,267 μM Rhod-2 AM und 0,198 μM pluronic F127 zu erreichen. Anschließend wird das Herz 15 Minuten lang kontinuierlich mit Rhod-2 AM-Arbeitslösung im Langendorff-Perfusionssystem perfundiert.</li>
		<li>Halten Sie die Sauerstoffversorgung während der intrazellulären Kalziumfarbstoffbeladung aufrecht. Da sich in Pluronic F127 leicht Blasen bilden, sollte eine Blasenfalle in das Perfusionssystem eingesetzt werden, um eine Gasembolisation der Herzkranzgefäße zu vermeiden.</li>
		<li>Verdünnen Sie 10 μl RH237-Stammlösung mit 50 ml Perfusat, um die Endkonzentration bei 0,402 μM zu erreichen, und führen Sie eine 10-minütige Beladung durch.</li>
		<li>Machen Sie am Ende der Dual-Dye-Beladung eine Reihe von Fotos, um sicherzustellen, dass sowohl die Spannungs- als auch die Kalziumsignale für die Analyse geeignet sind (keine Wechselwirkung zwischen zwei Signalen).</li>
	</ol></li>
	<li>Optische Kartierung und Arrhythmie-Induktion ANMERKUNG: Die optische Kartierung beginnt nach Beendigung der Kontraktion und einer entsprechenden Farbstoffbeladung, und das Herz wird nacheinander perfundiert, wie in den oben unter 2.1 (4) beschriebenen Schritten beschrieben.<ol><li>Schalten Sie die beiden LEDs für die Anregungslichter ein und stellen Sie ihre Intensität in einem geeigneten Bereich ein (stark genug für Beleuchtung und relativ einfaches Filmen, aber nicht zu robust für Überbelichtung).</li>
		<li>Legen Sie das Herz unter das Erkennungsgerät, stellen Sie sicher, dass es von zwei LEDs ausreichend beleuchtet wird, und stellen Sie den Lichtfleckdurchmesser auf 2 cm ein.</li>
		<li>Stellen Sie den Arbeitsabstand von der Linse zum Herzen auf 10 cm ein, was eine Abtastrate von fast 500 Hz und eine räumliche Auflösung von 120 x 120 μm pro Pixel ergibt.</li>
		<li>Öffnen Sie die Signalabtastsoftware, um die Kamera digital zu steuern und gleichzeitig Spannungs- und Kalziumsignale zu erfassen.</li>
		<li>Starten Sie den Myopacer-Feldstimulator und stellen Sie das Stimulationsmuster auf Transistor-Transistor-Logik (TTL), 2 ms Stimulationsdauer für jeden Impuls und 0,3 V als Anfangsintensität ein.</li>
		<li>Verwenden Sie 30 aufeinanderfolgende 10 Hz S1-Stimuli, um die diastolische Spannungsschwelle des Herzens zu testen, die von der EKG-Aufzeichnungssoftware gesteuert wird. Erhöhen Sie die Spannungsamplitude schrittweise, bis eine 1:1-Erfassung erreicht ist (überprüfen Sie die QRS-Welle des EKG-Monitors, die Signale des Aktionspotentials (AP) und der Kalziumtransienten (CaT).</li>
		<li>Nach der Bestimmung der Spannungsschwelle wird das Herz mit einer Intensität von 2x der diastolischen Spannungsschwelle mit einem Paar Platinelektroden beschleunigt, die am Epikardial der linken Herzkammerspitze (ELVA) befestigt sind.</li>
		<li>Implementieren Sie das S1S1-Protokoll zur Messung von Kalzium- oder Aktionspotentialalternativen und Restitutionseigenschaften. Takten Sie das Herz nacheinander mit einer grundlegenden Zykluslänge von 100 ms und verringern Sie die Zykluslänge in jeder folgenden Sequenz um 10 ms, bis 50 ms erreicht sind. Jede Episode enthält 30 aufeinanderfolgende Stimuli mit einer Pulsbreite von 2 ms. Beginnen Sie gleichzeitig mit dem optischen Mapping vor der Stimulation (die Abtastzeit umfasst ~10 Sinusrhythmen und Stimulationsdauer).</li>
		<li>Um die ventrikuläre effektive Refraktärperiode (ERP) unter Verwendung des S1S2-Stimulusprotokolls zu messen, beginnen Sie mit einer S1S1-Schrittzykluslänge von 100 ms, wobei ein S2 mit 60 ms gekoppelt ist, mit einer 2-ms-Schrittdekrementierung, bis S2 den ektopischen QRS-Komplex nicht mehr erfassen kann.</li>
		<li>Bei der Induktion von Arrhythmien führen Sie eine kontinuierliche 50-Hz-Burst-Stimulation (50 kontinuierliche elektrische Stimulationen mit einer Pulsbreite von 2 ms) durch und führen Sie die gleiche Stimulationsepisode nach einem Ruheintervall von 2 s durch.</li>
		<li>Beobachten Sie die EKG-Aufzeichnungen während der kontinuierlichen Hochfrequenz-Stimulationsphase sorgfältig, damit die gleichzeitigen optischen Mapping-Aufzeichnungen sofort beginnen können, wenn eine interessante arrhythmische EKG-Welle erzeugt wird (da die meisten Herzrhythmusstörungen durch elektrische Stimulation induziert werden, werden die optischen Signale 2-3 s vor der Burst-Stimulation abgetastet, falls wichtige kardiale Ereignisse verloren gehen).</li>
		<li>Bild mit EMCCD-Kamera (Abtastrate: 500 Hz, Pixelgröße: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Datenanalyse<ol><li>Bildbelastung und Signalverarbeitung<ol><li>Klicken Sie auf Ordner auswählen und Bilder laden, um die Bilder in die Bilderfassungssoftware zu laden, um eine halbautomatische Analyse von Massenvideodaten gemäß dem zuvor beschriebenen Setup und Protokollzu ermöglichen 15,16.</li>
			<li>Geben Sie die richtigen Sampling-Parameter ein (z. B. Pixelgröße und Framerate).</li>
			<li>Legen Sie den Bildschwellenwert durch manuelle Eingabe fest und wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus.</li>
			<li>Implementieren Sie einen 3 x 3-Pixel-Gauß-Raumfilter, einen Savitzky-Goaly-Filter und eine Basislinienkorrektur mit Zylinder.</li>
			<li>Drücken Sie auf Prozessbilder, um die Baseline zu entfernen und die elektrophysiologischen Parameter wie APD80 und CaTD50 zu berechnen.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse elektrophysiologischer Parameter<ol><li>Stellen Sie die Initiierungszeit der APD am Peak und den Endpunkt bei 80% Repolarisation (APD80) für die Berechnung von APD80 ein. In ähnlicher Weise wird die CaTD-Startzeit als Peak und der Endpunkt als 80%ige Relaxation definiert.</li>
			<li>Die Messung der Leitungsgeschwindigkeit (CV) hängt von der Pixelgröße und der Aktionspotential-Leitungszeit zwischen zwei oder mehr Pixeln ab. Berechnen Sie die durchschnittliche Geschwindigkeit aus allen ausgewählten Pixeln - dies ist die mittlere Leitungsgeschwindigkeit des ausgewählten Bereichs. Generieren Sie gleichzeitig entsprechende isochrone Karten für eine klare Sicht auf die Leitungsrichtung. HINWEIS: O'Shea et al.15 berichteten ausführlich über die CV-Messung.</li>
			<li>Für die Analyse von Alternanen und Arrhythmien werden Calcium-Alternane als eine kontinuierliche große und kleine Peakamplitude definiert, die abwechselnd auftreten. Verwenden Sie das Spitzenamplitudenverhältnis, um den Schweregrad von frequenzabhängigen Alternanen (1-A2/A1) zu bewerten. Wenden Sie Phasenkarten an, um komplexe Arrhythmien wie ventrikuläre Tachykardie (VT) zu analysieren. Achten Sie darauf, dass die Rotoren in einem bestimmten Bereich deutlich erscheinen, wenn sich die Rotoren verschieben.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu deklarieren.

Basierend auf unserer Erfahrung sind die Schlüssel zu einer erfolgreichen optischen Dual-Dye-Kartierung eines Mausherzens eine gut vorbereitete Lösung und ein gut vorbereitetes Herz, die Farbstoffbeladung, das Erreichen des besten Signal-Rausch-Verhältnisses und die Reduzierung des Bewegungsartefakts.
Herstellung der Lösung Die Krebslösung ist für ein erfolgreiches Herzexperiment unerlässlich. MgCl2- undCaCl2-Stammlösungen (1 mol/L) werden im Voraus unter Berücks...

Die katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als Episoden einer polymorphen ventrikulären Tachykardie (PVT) nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholaminbelastung, die sich zu einem potenziell tödlichen Kammerflimmern verschlechtern kann 1,2,3,4 . Neuere Hinweise nach dem ersten Bericht als klinisches Syndrom im Jahr 1995 implizierten Mutationen in sieben Genen, die alle an der Freisetzung von Ca 2+ durch sarkoplasmatische retikuläre (SR) Speichern beteiligt sind: die am häufigsten berichteten RYR2-kodierenden Ryanodinrezeptor 2 (RyR2) der Ca2+-Freisetzungskanäle5,6, FKBP12.67, CASQ2, die für kardiales Calsequestrin8 kodieren, TRDN kodiert für das junktionale SR-Protein Triadin 9 und CALM1 9, CALM2 10 und CALM3, die identisch für Calmodulin11,12 kodieren. Diese genotypischen Muster führen die arrhythmischen Ereignisse auf die unregulierte pathologische Freisetzung des SR-Speichers Ca2+12 zurück.
Die spontane Freisetzung von Ca 2+ aus SR kann als Ca 2+ Funken oder Ca 2+ Wellen nachgewiesen werden, wodurch der Na+/Ca 2+ Austauscher (NCX) aktiviert wird. Der Wärmetauscher von einem Ca2+ für drei Na+ erzeugt einen nach innen gerichteten Strom, der die diastolische Depolarisation beschleunigt und die Membranspannung an die Schwelle des Aktionspotentials (AP) treibt. In RyR2-Knock-in-Mäusen führt die erhöhte Aktivität von RyR2R4496C im Sinusknoten (SAN) zu einer unerwarteten Abnahme der SAN-Automatik durch Ca2+-abhängige Abnahme der ICa,L- und SRCa2+-Depletion während der Diastole, wodurch subzelluläre pathophysiologische Veränderungen identifiziert werden, die zur SAN-Dysfunktion bei CPVT-Patienten beitragen13,14. Das Auftreten der verwandten zytosolischenCa2+-Wellen von Kardiomyozyten ist wahrscheinlicher, wenn die zytosolische [Ca2+] im Hintergrund nach einer RyR-Sensibilisierung durch Katecholamin, einschließlich Isoproterenol (ISO), erhöht wird.
Detaillierte kinetische Veränderungen in der Ca 2+ Signalübertragung nach RyR2-vermittelter Ca2+ Freisetzung als Reaktion auf die Aktivierung des Aktionspotentials (AP), die die Ursache für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien in intakten kardialen CPVT-Modellen sein könnten, müssen noch für das gesamte Spektrum der berichteten RyR2-Genotypen bestimmtwerden 12. In diesem Artikel werden der Aufbau und die experimentelle Vorgehensweise für die Hochdurchsatzkartierung von Ca2+ Signalen und Transmembranpotentialen (Vm) in murinen Wildtyp- (WT) und heterozygoten RyR2-R2474S/+ Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und nach Isoproterenol-Provokation. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in isolierten Mäuseherzen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Spritzenfilter</td><td>Fabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>Zur Filterlösung</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pasteur-Pipette</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L PCR-Röhrchen</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td><td>F611541-0010</td><td>Alitieren Sie die Stammlösungen&nbsp; um wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr> von <tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>zu vermeiden Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td> CFT011500 Lagern Sie die Lösung von Tyrode bei <td></td><td>4 μg; C für die Nachsorge Herzisolierung</td></tr><tr><td>585/40 nm Filter</td><td>Chroma</td><td>Technology N/A</td><td>Filter für Calciumsignal</td></tr><tr><td>630 nm Langpassfilter</td><td>Chroma Technology</td><td>G15604AJ</td><td>Filter für Spannungssignal</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich</td><td>T48402-100G</td><td>Zur Minimierung von Leiden und Schmerzreflex</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten</td><td>SLBV5564</td><td>Anregungs-Kontraktions-Entkoppler zur Beseitigung von Bewegungsartefakten während des Mappings</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>SLBK1794V</td><td>Für die Lösung von Tyrode</td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes Thermostatbad</td><td>MappingLab, Vereinigtes Königreich</td><td>TBC-2.1</td><td>Zur Aufrechterhaltung der Temperatur der Perfusionslösung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>Lösungsmittel für Farbstoffe</td></tr><tr><td>Dumont Pinzetten</td><td>Fabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap Software</td><td>Universität Birmingham</td><td>N/A</td><td>Quantifizierung elektrischer Parameter</td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Vereinigte Staaten</td><td>A18G150001</td><td>Erfassen Sie Bilder für optische Signale</td></tr><tr><td>ET525/36 Sputter-beschichteter Filter</td><td>Chroma-Technologie</td><td>319106</td><td>Anregungsfilter</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>SLBT4811V</td><td>Für Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td> <td>(H51021209)</td><td>Zur Vorbeugung von Blutgerinnseln in der Koronararterie</td></tr><tr><td>&nbsp; Iris-Zange</td><td>Fabrik für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Vereinigte Staaten</td><td>HY-B0468 / CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>SLBS5003</td><td>Für die Lösung von Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich</td><td>7355/7356</td><td>Das Anregungslicht von Fluoreszenzsonden</td></tr><tr><td>MacroLED-Lichtquelle</td><td>Cairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich</td><td>7352</td><td>Steuerung der LEDs</td></tr><tr><td>Mayo-Schere</td> Fabrik <td>für medizinische Geräte von Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N / A</td><td>Optische Signale zur Abtastung</td></tr><tr><td>von MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>BCBS6841V</td><td>Für die Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Vereinigtes Königreich</td><td>M5337</td><td>Verbinden Sie den elektrischen Stimulator und die Spike2-Software</td></tr><tr><td>MyoPacer EP Feldstimulator</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Vereinigte Staaten</td><td>S006152</td><td>Elektrischer Stimulator</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>SLBS2340V</td><td>Für die Lösung von Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>BCBW9042</td><td>Für die Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten</td><td>SLBX3605</td><td>Für die Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Für EKG-Verstärker</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Vereinigtes Königreich</td><td>N/A</td><td>Calcium-Alternans und Arrhythmie-Analyse</td></tr><tr><td>Ophthalmische Schere</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Vereinigtes Königreich</td><td>6970</td><td>Teilen Sie das Emissionslicht zur Detektion von Ca2+ und Vm&nbsp; gleichzeitig</td></tr><tr><td>Peristalische Pumpe</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, </td><td>BT100-2J</td><td>Zum Pumpen der Lösung</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Vereinigte Staaten</td><td>1899021</td><td>Zur Erhöhung der Beladung mit Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Vereinigte Staaten</td><td>1971387</td><td>Spannungsempfindlicher Farbstoff</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Vereinigte Staaten</td><td>1890519</td><td>Kalziumindikator</td></tr><tr><td>Kieselgelschlauch</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td> <td>96402-16</td><td>Verbinden Sie sich mit der Peristaltikpumpe</td></tr><tr><td>Seidennaht</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, China</td><td>20172650032</td><td>Zur Fixierung der Aorta</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Vereinigtes Königreich</td><td>N/A</td><td>Zum Aufzeichnen und Analysieren von EKG-Daten</td></tr><tr><td>Stimulation Elektrode</td><td>MappingLab, Vereinigtes Königreich</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>Für Lichtquelle</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Für Lichtquelle</td></tr></tbody></table>

optisches dual-dye-mapping von herzen aus ryr2r2474s knock-in-mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer tachykardie

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Die pro-arrhythmische Herzerkrankung katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als polymorphe ventrikuläre Tachykardie-Episoden nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholamin-Provokation, die sich zu potenziell tödlichem Kammerflimmern verschlechtern können. Das Mäuseherz ist eine weit verbreitete Spezies zur Modellierung von erblichen Herzrhythmusstörungen, einschließlich CPVT. Die gleichzeitige optische Kartierung des Transmembranpotentials (Vm) und der Kalziumtransienten (CaT) aus Langendorff-perfundierten Mäuseherzen hat das Potenzial, die Mechanismen aufzuklären, die der Arrhythmogenese zugrunde liegen. Im Vergleich zur Untersuchung auf zellulärer Ebene kann die optische Mapping-Technik einige elektrophysiologische Parameter testen, wie z. B. die Bestimmung der Aktivierung, der Leitungsgeschwindigkeit, der Aktionspotentialdauer und der CaT-Dauer. In diesem Artikel werden der Aufbau der Instrumentierung und das experimentelle Verfahren für die optische Kartierung von CaT und Vm in murinen Wildtyp- und heterozygoten RyR2-R2474S/+-Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und während der Isoproterenol-Challenge. Dieser Ansatz hat eine praktikable und zuverlässige Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in einem ex vivo Mausherzpräparat gezeigt.

Die optische Kartierung war in den letzten zehn Jahren ein beliebter Ansatz zur Untersuchung komplexer Herzrhythmusstörungen. Der optische Mapping-Aufbau besteht aus einer EMCCD-Kamera, die eine Abtastrate von bis zu 1.000 Hz und eine räumliche Auflösung von 74 x 74 μm für jedes Pixel bietet. Es ermöglicht ein relativ hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Signalabtastung (Abbildung 1). Sobald das Langendorff-perfundierte Herz einen stabilen Zustand erreicht hat und die Farbstoffbeladung abg...

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Diese Methode wird uns helfen, die elektrophysiologischen Eigenschaften und Mechanismen von ventrikulären Arrestabstrichen aufzudecken, die mit Erkrankungen wie der katecholaminergen polymorphen ventrikulären Tachykardie assoziiert sind. Mit dieser Technik können wir das Membranpotential und die interzellulären Kalziumsignale gleichzeitig unter verschiedenen programmierten elektrischen Stimulationsprotokollen erhalten, was besonders geeignet ist, um die zugrunde liegenden Mechanismen und Dynamiken von Herzrhythmusstörungen wie CPVT zu untersuchen. Um dieses Experiment erfolgreich durchführen zu können, stellen Sie sicher, dass das Herz gut durchblutet ist, der Farbstoff richtig geladen ist, die Entkopplung von Anregung und Kontraktion erfolgt und die Kamera sorgfältig eingestellt ist.Richten Sie zunächst das optische Mapping-System ein und schalten Sie die Kamera ein, um eine stabile Abtasttemperatur von minus 50 Grad Celsius zu erreichen. Legen Sie das geerntete Mäuseherz in die kalte CREB-Lösung, um den Stoffwechsel zu verlangsamen und das Herz zu schützen. Entfernen Sie das umliegende Gewebe der Aorta.Verwenden Sie eine speziell angefertigte Kanülennadel, um es zu kanülieren, und fixieren Sie es mit einem 4-0-Seidennaht. Nun wird das Herz mit dem Langendorff-System mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3,5 bis 4,0 Millilitern pro Minute durchblutet. Führen Sie ein kleines Kunststoffröhrchen in die linke Herzkammer ein, um die Verstopfung der Lösung in der Kammer zu lösen, um eine Überbelastung zu vermeiden, und fixieren Sie das Kunststoffröhrchen in der Kanülennadel.Legen Sie dann zwei Elektroden in das Perfusat in der Badewanne und schalten Sie die Stromversorgung für die Elektrokardiogramm-Verstärkerbox und den elektrischen Stimulationsregler ein. Starten Sie als Nächstes das referenzierte Elektrokardiogramm oder die EKG-Software und überwachen Sie das EKG kontinuierlich. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch, wenn das Herz einen stabilen Zustand erreicht hat.Führen Sie die Blebbistatin CREBs-Lösungsmischung 10 Minuten lang konstant in das Herz ein, um die Kontraktion von der Erregung zu entkoppeln und Kontraktionsartefakte während des Filmens zu vermeiden. Untersuchen Sie dann mit einer roten Taschenlampe das Herz, um das vollständige Abklingen der Wehen zu bestätigen. Das Herz nach dem Entkoppeln der Erregungskontraktion 15 Minuten lang mit Rhod-2 AM-Arbeitslösung im Langendorff-Perfusionssystem perfundieren.Aufrechterhaltung der Sauerstoffversorgung während der intrazellulären Kalziumfarbstoffbeladung. Um die Blasenbildung von pluronischem F-127 zu verhindern, wird eine Blasenfalle in das Perfusionssystem eingeführt. 10 Mikroliter RH 237 Stammlösung in 50 Milliliter Perfusat verdünnen und 10 Minuten einwirken lassen.Wenn Sie die doppelte Farbbeladung abgeschlossen haben, nehmen Sie eine Reihe von Fotos auf. Vergewissern Sie sich, dass Spannungs- und Kalziumsignale für die Analyse ausreichend sind. Schalten Sie die beiden LEDs für die Anregungslichter ein und stellen Sie ihre Intensität auf einen geeigneten Bereich ein.Legen Sie das Herz unter das Detektionsgerät und achten Sie darauf, dass es von den beiden LEDs gut ausgeleuchtet wird, indem Sie den Durchmesser des Lichtflecks auf zwei Zentimeter einstellen. Stellen Sie den Arbeitsabstand zwischen Objektiv und Herz auf 10 Zentimeter ein, um die gewünschte Abtastrate und räumliche Auflösung zu erreichen. Öffnen Sie die Signalabtastsoftware, um gleichzeitig die Kamera zu steuern und Spannungs- und Kalziumsignale zu erfassen.Starten Sie den MyoPacer Field Stimulator und stellen Sie das Stimulationsmuster auf Transistor-Transistor-Logik mit zwei Millisekunden Stimulationsdauer pro Puls ein. Stellen Sie die Anfangsintensität auf 0,3 Volt ein. Positionieren Sie ein Paar Platinelektroden, die am Epikard der linken Herzkammerspitze befestigt sind.Wenden Sie 30 aufeinanderfolgende 10-Hertz-S1-Stimuli an, um die diastolische Spannungsschwelle des Herzens mit der EKG-Aufzeichnungssoftware zu testen. Erhöhen Sie die Spannungsamplitude schrittweise, bis eine Eins-zu-Eins-Erfassung erreicht ist. Implementieren Sie das S1-S1-Protokoll zur Messung von Kalzium- oder Aktionspotentialalternativen und Restitutionseigenschaften.Beschleunigen Sie das Herz nacheinander, beginnend mit einer grundlegenden Zykluslänge von 100 Millisekunden. Verringern Sie die Zykluslänge in jeder nachfolgenden Sequenz um 10 Millisekunden, bis sie 50 Millisekunden erreicht. Initiieren Sie gleichzeitig ein optisches Mapping vor der Stimulation.Um die ventrikuläre effektive Refraktärperiode mit dem S1-S2-Stimulusprotokoll zu messen, beginnen Sie mit einer S1-S1-Schrittzykluslänge von 100 Millisekunden. Koppeln Sie S2 bei 60 Millisekunden und verringern Sie es mit einem Schritt von zwei Millisekunden, bis S2 den ektopischen QRS-Komplex nicht mehr erfassen kann. Bei der Induktion von Arrhythmien führen Sie eine kontinuierliche 50-Hertz-Burst-Stimulation durch und führen Sie die gleiche Stimulationsepisode durch, nachdem Sie ein zweisekündiges Ruheintervall abgewartet haben.Überwachen Sie die Aufzeichnungen des Elektrokardiogramms während der kontinuierlichen Hochfrequenz-Stimulationsphase sorgfältig, um sofort mit gleichzeitigen optischen Mapping-Aufzeichnungen zu beginnen, wenn eine interessante arrhythmische Welle erzeugt wird. Fahren Sie mit der Aufnahme von Bildern mit der Kamera des elektronenmultiplizierenden ladungsgekoppelten Geräts fort. Drücken Sie in der Bilderfassungssoftware auf Ordner auswählen und laden Sie Bilder, um den halbautomatischen Prozess der Analyse massiver Videodaten zu starten.Geben Sie die richtigen Stichprobenparameter für die Analyse ein. Legen Sie den Bildschwellenwert manuell fest und wählen Sie den gewünschten Bereich aus. Wenden Sie einen Gaußschen Raumfilter mit drei x drei Pixeln, einen Savitzky-Golay-Filter und eine Basislinienkorrektur mit Zylinder an.Drücken Sie dann auf Prozessbilder, um die Baseline zu entfernen und elektrophysiologische Parameter wie APD-80 und CATD-50 zu berechnen. Stellen Sie die Initiierungszeit des Aktionspotentials auf den Peak und den Endpunkt auf 80 % Repolarisation ein, um APD-80 zu berechnen. Definieren Sie in ähnlicher Weise die Startzeit der transienten Kalziumdauer als Peak, wobei der Endpunkt 80 % Relaxation ist.Typische Spuren in Heatmaps von APD-80 und CATD-80 sind dargestellt. Isoproterenol verkürzt APD-80 und Wildtyp- und katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie oder CPVT-Mäuse, aber nach Isoproterenol-Provokation wurde kein Unterschied gefunden. CATD-80- und CPVT-Mäuse waren nach der Isoproterenol-Provokation länger als im Wildtyp, während es vor der Behandlung keine Signifikanz gab.Den Spannungssignalen zufolge besaßen das Wildtyp- und das CPVT-Herz zu Studienbeginn und nach Isoproterenol-Intervention die gleiche Leitungsfähigkeit über das Epikard. Heatmaps zeigten, dass CPVT-Mäuse vor und nach der Isoproterenol-Provokation die gleiche Leitungsfähigkeit wie die Wildtyp-Mäuse haben. Die Analyse der Kalziumamplitudenwechsel zeigte, dass die Kalziumsignale in Wildtyp-Herzen während der aufeinanderfolgenden S1-S1-Stimulation bei 14,29 und 16,67 Hertz stabil blieben, während die CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternativen aufwiesen.Nach der Isoproterenol-Provokation zeigten CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternativen und Kalziumsignale während der S1-S1-Stimulation, während Wildtyp-Herzen nicht beeinflusst wurden. Die Analyse der Tachy-Arrhythmie deutete darauf hin, dass sowohl Wildtyp- als auch CPVT-Herzen während der 50-Hertz-Burst-Stimulation zu Studienbeginn eine normale Leitung aufweisen. Nach der Profusion mit Isoproterenol zeigten CPVT-Herzen nach 50-Hertz-Burst-Stimulation hochfrequente Rotoren, während Wildtyp-Herzen eine normale Leitung beibehielten.Im Anschluss an dieses Verfahren werden Adogentypen und Wildtyp-Mäuse verwendet, um die elektrophysiologischen und funktionellen Eigenschaften in diesen Modellen oder bei der Erfindung von Arzneimitteln zu veranschaulichen. Die optische Kartierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, kann jedoch aufgrund der Einschränkung des Fluoreszenzfarbstoffs unter der Entkopplung der Anregungskontraktion nicht klinisch eingesetzt werden. Mit der Entwicklung von Fluoreszenz, die für verschiedene Zielmoleküle geeignet ist, im Rahmen der Entwicklung der High-Revolution-Berechnungstechnologie wird die kardiale optische Mapping-Technik zwangsläufig nur Anwendungen finden.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Methodik und Ergebnisse der gleichzeitigen endokardiale und epikardialen optische Abbildung der elektrischen Erregung in der intakten linken Vorhof eines Langendorff-perfundierten Schafe Herzen während stretch-induzierten Vorhofflimmern.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Wir stellen die Methodik zur Isolierung von murinen Myozyten vor und wie Spannungs- oder Kalziumspuren gleichzeitig mit Sarcomere-Verkürzungsspuren mittels Fluoreszenzphotometrie mit gleichzeitigen Messungen der digitalen Zellgeometrie erhalten werden können.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

Lernen Sie die optische Dual-Farb-Mapping-Technik zur Untersuchung elektrophysiologischer Eigenschaften von CPVT-Mäuseherzen. Diese Methode erfasst gleichzeitig Membranpotenzial und Calciumsignale unter verschiedenen Pacing-Protokollen.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie (Video) | JoVE Journal

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2^R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

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