Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

Diese Methode wird uns helfen, die elektrophysiologischen Eigenschaften und Mechanismen von ventrikulären Arrestabstrichen aufzudecken, die mit Erkrankungen wie der katecholaminergen polymorphen ventrikulären Tachykardie assoziiert sind. Mit dieser Technik können wir das Membranpotential und die interzellulären Kalziumsignale gleichzeitig unter verschiedenen programmierten elektrischen Stimulationsprotokollen erhalten, was besonders geeignet ist, um die zugrunde liegenden Mechanismen und Dynamiken von Herzrhythmusstörungen wie CPVT zu untersuchen. Um dieses Experiment erfolgreich durchführen zu können, stellen Sie sicher, dass das Herz gut durchblutet ist, der Farbstoff richtig geladen ist, die Entkopplung von Anregung und Kontraktion erfolgt und die Kamera sorgfältig eingestellt ist.

Richten Sie zunächst das optische Mapping-System ein und schalten Sie die Kamera ein, um eine stabile Abtasttemperatur von minus 50 Grad Celsius zu erreichen. Legen Sie das geerntete Mäuseherz in die kalte CREB-Lösung, um den Stoffwechsel zu verlangsamen und das Herz zu schützen. Entfernen Sie das umliegende Gewebe der Aorta.

Verwenden Sie eine speziell angefertigte Kanülennadel, um es zu kanülieren, und fixieren Sie es mit einem 4-0-Seidennaht. Nun wird das Herz mit dem Langendorff-System mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3,5 bis 4,0 Millilitern pro Minute durchblutet. Führen Sie ein kleines Kunststoffröhrchen in die linke Herzkammer ein, um die Verstopfung der Lösung in der Kammer zu lösen, um eine Überbelastung zu vermeiden, und fixieren Sie das Kunststoffröhrchen in der Kanülennadel.

Legen Sie dann zwei Elektroden in das Perfusat in der Badewanne und schalten Sie die Stromversorgung für die Elektrokardiogramm-Verstärkerbox und den elektrischen Stimulationsregler ein. Starten Sie als Nächstes das referenzierte Elektrokardiogramm oder die EKG-Software und überwachen Sie das EKG kontinuierlich. Führen Sie die folgenden Schritte im Dunkeln durch, wenn das Herz einen stabilen Zustand erreicht hat.

Führen Sie die Blebbistatin CREBs-Lösungsmischung 10 Minuten lang konstant in das Herz ein, um die Kontraktion von der Erregung zu entkoppeln und Kontraktionsartefakte während des Filmens zu vermeiden. Untersuchen Sie dann mit einer roten Taschenlampe das Herz, um das vollständige Abklingen der Wehen zu bestätigen. Das Herz nach dem Entkoppeln der Erregungskontraktion 15 Minuten lang mit Rhod-2 AM-Arbeitslösung im Langendorff-Perfusionssystem perfundieren.

Aufrechterhaltung der Sauerstoffversorgung während der intrazellulären Kalziumfarbstoffbeladung. Um die Blasenbildung von pluronischem F-127 zu verhindern, wird eine Blasenfalle in das Perfusionssystem eingeführt. 10 Mikroliter RH 237 Stammlösung in 50 Milliliter Perfusat verdünnen und 10 Minuten einwirken lassen.

Wenn Sie die doppelte Farbbeladung abgeschlossen haben, nehmen Sie eine Reihe von Fotos auf. Vergewissern Sie sich, dass Spannungs- und Kalziumsignale für die Analyse ausreichend sind. Schalten Sie die beiden LEDs für die Anregungslichter ein und stellen Sie ihre Intensität auf einen geeigneten Bereich ein.

Legen Sie das Herz unter das Detektionsgerät und achten Sie darauf, dass es von den beiden LEDs gut ausgeleuchtet wird, indem Sie den Durchmesser des Lichtflecks auf zwei Zentimeter einstellen. Stellen Sie den Arbeitsabstand zwischen Objektiv und Herz auf 10 Zentimeter ein, um die gewünschte Abtastrate und räumliche Auflösung zu erreichen. Öffnen Sie die Signalabtastsoftware, um gleichzeitig die Kamera zu steuern und Spannungs- und Kalziumsignale zu erfassen.

Starten Sie den MyoPacer Field Stimulator und stellen Sie das Stimulationsmuster auf Transistor-Transistor-Logik mit zwei Millisekunden Stimulationsdauer pro Puls ein. Stellen Sie die Anfangsintensität auf 0,3 Volt ein. Positionieren Sie ein Paar Platinelektroden, die am Epikard der linken Herzkammerspitze befestigt sind.

Wenden Sie 30 aufeinanderfolgende 10-Hertz-S1-Stimuli an, um die diastolische Spannungsschwelle des Herzens mit der EKG-Aufzeichnungssoftware zu testen. Erhöhen Sie die Spannungsamplitude schrittweise, bis eine Eins-zu-Eins-Erfassung erreicht ist. Implementieren Sie das S1-S1-Protokoll zur Messung von Kalzium- oder Aktionspotentialalternativen und Restitutionseigenschaften.

Beschleunigen Sie das Herz nacheinander, beginnend mit einer grundlegenden Zykluslänge von 100 Millisekunden. Verringern Sie die Zykluslänge in jeder nachfolgenden Sequenz um 10 Millisekunden, bis sie 50 Millisekunden erreicht. Initiieren Sie gleichzeitig ein optisches Mapping vor der Stimulation.

Um die ventrikuläre effektive Refraktärperiode mit dem S1-S2-Stimulusprotokoll zu messen, beginnen Sie mit einer S1-S1-Schrittzykluslänge von 100 Millisekunden. Koppeln Sie S2 bei 60 Millisekunden und verringern Sie es mit einem Schritt von zwei Millisekunden, bis S2 den ektopischen QRS-Komplex nicht mehr erfassen kann. Bei der Induktion von Arrhythmien führen Sie eine kontinuierliche 50-Hertz-Burst-Stimulation durch und führen Sie die gleiche Stimulationsepisode durch, nachdem Sie ein zweisekündiges Ruheintervall abgewartet haben.

Überwachen Sie die Aufzeichnungen des Elektrokardiogramms während der kontinuierlichen Hochfrequenz-Stimulationsphase sorgfältig, um sofort mit gleichzeitigen optischen Mapping-Aufzeichnungen zu beginnen, wenn eine interessante arrhythmische Welle erzeugt wird. Fahren Sie mit der Aufnahme von Bildern mit der Kamera des elektronenmultiplizierenden ladungsgekoppelten Geräts fort. Drücken Sie in der Bilderfassungssoftware auf Ordner auswählen und laden Sie Bilder, um den halbautomatischen Prozess der Analyse massiver Videodaten zu starten.

Geben Sie die richtigen Stichprobenparameter für die Analyse ein. Legen Sie den Bildschwellenwert manuell fest und wählen Sie den gewünschten Bereich aus. Wenden Sie einen Gaußschen Raumfilter mit drei x drei Pixeln, einen Savitzky-Golay-Filter und eine Basislinienkorrektur mit Zylinder an.

Drücken Sie dann auf Prozessbilder, um die Baseline zu entfernen und elektrophysiologische Parameter wie APD-80 und CATD-50 zu berechnen. Stellen Sie die Initiierungszeit des Aktionspotentials auf den Peak und den Endpunkt auf 80 % Repolarisation ein, um APD-80 zu berechnen. Definieren Sie in ähnlicher Weise die Startzeit der transienten Kalziumdauer als Peak, wobei der Endpunkt 80 % Relaxation ist.

Typische Spuren in Heatmaps von APD-80 und CATD-80 sind dargestellt. Isoproterenol verkürzt APD-80 und Wildtyp- und katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie oder CPVT-Mäuse, aber nach Isoproterenol-Provokation wurde kein Unterschied gefunden. CATD-80- und CPVT-Mäuse waren nach der Isoproterenol-Provokation länger als im Wildtyp, während es vor der Behandlung keine Signifikanz gab.

Den Spannungssignalen zufolge besaßen das Wildtyp- und das CPVT-Herz zu Studienbeginn und nach Isoproterenol-Intervention die gleiche Leitungsfähigkeit über das Epikard. Heatmaps zeigten, dass CPVT-Mäuse vor und nach der Isoproterenol-Provokation die gleiche Leitungsfähigkeit wie die Wildtyp-Mäuse haben. Die Analyse der Kalziumamplitudenwechsel zeigte, dass die Kalziumsignale in Wildtyp-Herzen während der aufeinanderfolgenden S1-S1-Stimulation bei 14,29 und 16,67 Hertz stabil blieben, während die CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternativen aufwiesen.

Nach der Isoproterenol-Provokation zeigten CPVT-Herzen frequenzabhängige Alternativen und Kalziumsignale während der S1-S1-Stimulation, während Wildtyp-Herzen nicht beeinflusst wurden. Die Analyse der Tachy-Arrhythmie deutete darauf hin, dass sowohl Wildtyp- als auch CPVT-Herzen während der 50-Hertz-Burst-Stimulation zu Studienbeginn eine normale Leitung aufweisen. Nach der Profusion mit Isoproterenol zeigten CPVT-Herzen nach 50-Hertz-Burst-Stimulation hochfrequente Rotoren, während Wildtyp-Herzen eine normale Leitung beibehielten.

Im Anschluss an dieses Verfahren werden Adogentypen und Wildtyp-Mäuse verwendet, um die elektrophysiologischen und funktionellen Eigenschaften in diesen Modellen oder bei der Erfindung von Arzneimitteln zu veranschaulichen. Die optische Kartierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, kann jedoch aufgrund der Einschränkung des Fluoreszenzfarbstoffs unter der Entkopplung der Anregungskontraktion nicht klinisch eingesetzt werden. Mit der Entwicklung von Fluoreszenz, die für verschiedene Zielmoleküle geeignet ist, im Rahmen der Entwicklung der High-Revolution-Berechnungstechnologie wird die kardiale optische Mapping-Technik zwangsläufig nur Anwendungen finden.