Name: Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie ein GMP-konformes Verfahren zur Transduktion humaner primärer T-Zellen für Gentherapie und CAR T-Zell-Therapien. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die Herstellung genmodifizierter Zelltherapien ohne teure geschlossene Systeme.

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Diese Forschung wurde von der Europäischen Union und den griechischen nationalen Mitteln im Rahmen des Operationellen Programms Wettbewerbsfähigkeit, Unternehmertum und Innovation unter der Bezeichnung RESEARCH - CREATE - INNOVATE (Projektcode: T2EDK - 00474) kofinanziert. Wir möchten uns auch bei der Choose Life Foundation für die kontinuierliche Unterstützung des GMP-Labors "Dimitris Lois" des Instituts für Zelltherapie bedanken.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Patras und dem Institutional Review Board des Universitätskrankenhauses Patras genehmigt. Vor der Entnahme biologischer Proben wurde die Einverständniserklärung gesunder Personen eingeholt. Die Bewertung der Eignung der Teilnehmer wurde nach institutionellen Verfahren und in Übereinstimmung mit den JACIE-Standards für Leukapherese durchgeführt. Wenn dieses Protokoll in einer klinischen ACT-Umgebung implementiert werden soll, müssen alle Verfahren den Richtlinien der Good Manufacturing Practice (GMP) entsprechen und in GMP-konformen Reinräumen durchgeführt werden. Bei der Arbeit mit viralen Vektoren sind besondere Sicherheitsvorkehrungen erforderlich, und diese Verfahren sollten in einer speziellen Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. In dieser Studie wurden die beschriebenen Verfahren in einer validierten H35-HEPA-Hypoxystation (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um eine kontrollierte und überwachte Umgebung zu gewährleisten. Die Dekontamination aller gefährlichen Flüssigkeiten sollte mit 10% iger Bleichlösung durchgeführt werden.
1. PBMC-Isolierung und T-Zell-Aktivierung (Tag 0)
<ol><li>Sammeln Sie Zellen aus dem Spenderapheresebeutel (Leukopaken, siehe Materialtabelle) in 50-ml-Röhrchen, abhängig vom Ausgangsvolumen.</li>
	<li>Führen Sie zwei Wäschen des Zellbeutels durch, indem Sie 15 ml vollständiges hämatopoetisches Medium infundieren (+5% HSA, handelsübliches serumfreies hämatopoetisches Medium, siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie eine Dichtegradientenzentrifugation auf Polysaccharidbasis in einer Verdünnung von 1:2 (Reagenz:Probe) durch. Bei 800 x g 30 min bei Raumtemperatur mit Abbruch zentrifugieren (A/D, 9/0).</li>
	<li>Sammeln Sie PBMCs mit einer Mikropipette in einem sauberen 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und füllen Sie sie bei jeder Wäsche bis zu 50 ml (400 x g, 10 min, Raumtemperatur). Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständigem Medium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau entweder mit einem Standard-Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen mit vollständigen Medien, um eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen.</li>
	<li>Aktivieren Sie 20 x 106 PBMCs durch Zugabe von 10 μl T-Zell-Stimulationsreagenz (siehe Materialtabelle) pro 2 x 106 Startzellen. HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Aktivierung von 20 x 106 PBMCs ausgelegt, kann aber bei Bedarf für größere Zellenzahlen angepasst werden.</li>
	<li>Fügen Sie rhIL-2 (20 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle), mischen Sie vorsichtig und geben Sie die Mischung in ein geeignetes Gefäß (z. B. 6-Well-Platte).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 72 h.</li>
</ol>2. Lentivirale T-Zell-Transduktion (Tag 3)
<ol><li>Übertragen Sie die Zellkultur in ein geeignetes Gefäß, z. B. ein konisches 50-ml-Röhrchen. Gut mischen und bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, um das Aktivierungsreagenz zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium. HINWEIS: In diesem Stadium ist es möglich, das Virus auf Eis aufzutauen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Medium, um eine Konzentration zu erreichen, die eine Beschichtung von 0,5 x 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 μl pro Well in einer 24-Well-Platte ermöglicht. Fügen Sie rhIL-7 (155 U/ml) und rhIL-15 (290 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Menge der hinzuzufügenden Viren berücksichtigen. Siehe Schritt 2.4.</li>
	<li>Geben Sie in einem separaten Röhrchen Vectofusin-1 (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 10 μg/ml in Opti-MEM-Medium mit einem Volumen, das dem zu verwendenden Virusvolumen entspricht. HINWEIS: Berücksichtigen Sie das Gesamtvolumen der Zellkultur, wenn Sie die Konzentration von Vectofusin-1 berechnen. Siehe Schritt 2.3. Alternativ kann Vectofusin-1 GMP als Reagenz in GMP-Qualität verwendet werden.</li>
	<li>Kombinieren Sie das konzentrierte Virus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 40 mit der Vectofusin-1/Opti-MEM-Mischung (Verhältnis 1:1) und mischen Sie es gründlich. Geben Sie diese Mischung in die Zellkultur und stellen Sie das Gesamtvolumen bei Bedarf auf 400 μl pro Vertiefung mit vollständigem Medium ein.</li>
	<li>Den Deckel auf die Platte legen, mit Paraffinfolie verschließen und bei 1000 x g 2 h bei 32 °C zentrifugieren. Anschließend die Platte bei 37 °C, 5 % CO2 über Nacht inkubieren.</li>
</ol>3. Virusentfernung und T-Zell-Expansion (Tag 4)
<ol><li>Sammeln Sie die Zellen und poolen Sie sie in einem geeigneten Gefäß, z. B. einem 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigen Medien in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml. Fügen Sie rhIL-7 (155 U/ml) und rhIL-15 (290 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Zellen werden in ein geeignetes Gefäß, z. B. einen T25-Kolben, in einer Konzentration von 0,3-0,5 x 106 Zellen/cm2 überführt und 2 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. HINWEIS: Wenn eine größere Zellpopulation erforderlich ist, können die Zellen alle 2 Tage unter den gleichen Inkubationsbedingungen subkultiviert werden (1:2) in Gegenwart von rhIL7 und rhIL-15, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist.</li>
</ol>4. Kryokonservierung (Tag 14)
HINWEIS: Während dieses Schritts wird Eis benötigt, um Kryofläschchen an den Lagerort zu bringen. Der Zeitpunkt der Kryokonservierung hängt von der gewünschten Zellzahl ab. Für dieses Protokoll wird die Kryokonservierung am Tag 14 durchgeführt, nachdem eine 25-fache Expansion erreicht wurde.
<ol><li>Sobald die gewünschte Zellzahl erreicht ist, ernten Sie die Zellen und überführen Sie sie in 50-ml-Röhrchen (passen Sie die Anzahl der Röhrchen basierend auf dem Gesamtvolumen an).</li>
	<li>Die Röhrchen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Medien. Bei Bedarf werden die Zellen aus mehreren Röhrchen gepoolt.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Halten Sie ein Aliquot von 1 x 106 Zellen für jeden Qualitätskontrolltest (QK) (siehe Abschnitt 5) bereit, um die Vektorkopienzahl und die Transduktionseffizienz zu beurteilen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei RT. Beschriften Sie die Kryofläschchen an dieser Stelle entsprechend.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in einer Kryokonservierungslösung, die aus 50 % HSA und 40 % HBSS besteht, in einer Konzentration von 1 x 107 Zellen pro ml pro Kryofläschchen. Übertragen Sie die Zellsuspension in die entsprechende Anzahl von Kryofläschchen und fügen Sie jedem Kryoröhrchen 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die Kryofläschchen auf Eis und geben Sie sie sofort zur Kryokonservierung in einen Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit. Nach der Kryokonservierung werden die Kryofläschchen zur Langzeitlagerung in einen überwachten Flüssigstickstofftank überführt.</li>
</ol>5. Qualitätskontrolle (Tag 14)
HINWEIS: Für Freigabetests wurde das Produkt mehreren Tests unterzogen, darunter Sterilitätstests auf mikrobielles Wachstum und die Bewertung des Endotoxingehalts. Diese Tests wurden in zertifizierten Labors des Universitätskrankenhauses Patras und der Universität Patras durchgeführt. Das Vorhandensein von Mykoplasmen wurde intern mit einem biochemischen Nachweisassay bestimmt und gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einem Luminometer gemessen (siehe Materialtabelle). Der Zellphänotyp (Abbildung 1) sowie die Zellzahl und -viabilität wurden intern durch Durchflusszytometrie (siehe Abschnitt 5.1) bzw. einen automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle) bewertet. Freigabekriterien wurden auf der Grundlage veröffentlichter Daten und Empfehlungen10,11 für GMP-hergestellte Zellprodukte festgelegt (Tabelle 1).
<ol><li>Durchführung einer Transduktionseffizienz-Durchflusszytometrie-Färbung (Tag 14) HINWEIS: Ein Aliquot von 1 x 106 Zellen wird auf Lebensfähigkeit (7-AAD) und CD3-Marker2 gefärbt, um die Transduktionseffizienz zu bewerten (siehe Materialtabelle). Wenn das interessierende Gen, wie im Fall von CAR-T-Zellen, nachgewiesen werden muss, sollte der spezifische Antikörper eine andere Farbe als der CD3-Marker und 7-AAD haben, um eine Kompensation zu vermeiden. Geeignete Kontrollproben sollten berücksichtigt werden.<ol><li>Geben Sie die Probe in ein FACS-Röhrchen und fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g bei RT für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand vollständig mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in einer 1:5 verdünnten Lösung von CD3:FACS-Puffer (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Wirbeln Sie die Probe vor und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min (RT).</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in einer 1:20 verdünnten Lösung von 7-AAD:FACS-Puffer (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Wirbeln Sie die Probe vor und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis im Dunkeln.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer hinzu und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
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<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
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<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
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</ol>

N.S. entwickelte das Protokoll und schrieb das Manuskript, das von A.S. überprüft und beaufsichtigt wurde; K.S., G.A. führte zusätzliche Experimente durch; D.K., M.L. leistete wertvolle Unterstützung bei den Experimenten und zusammen mit V.Z., N.T. im Begutachtungsprozess. N.T. ist Mitglied von ProtATonce Ltd. Alle anderen Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Lentivirale Vektoren als Gentransportvehikel sind wichtige Werkzeuge auf dem Gebiet der Zell- und Gentherapie, da sie sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen transduzieren können12. Die großtechnische Produktion von lentiviralen Vektoren mit GMP-konformen Methoden ist jedoch aufgrund verschiedener Parameter, wie Transfektionsmethoden und Aufreinigungsschritte, immer noch eine Herausforderung, was zu einer Variabilität der Lentivirus-Chargen führen kann. Akademische Zentren beziehe...

Das Aufkommen von adoptiven Zelltherapien (ACT) und chimären Antigenrezeptoren (CAR)-T-Zellen hat zu einem revolutionären Wandel in der modernen klinischen Praxis geführt und ein neues Paradigma der personalisierten Medizin etabliert. Insbesondere CAR-T-Zellen, die auf CD19 abzielen, haben außergewöhnliche klinische Reaktionen gezeigt und stellen die fortschrittlichste T-Zelltherapie für B-Zell-Malignomedar 1,2,3,4,5. Die derzeit kommerzialisierten genmodifizierten T-Zelltherapien sind jedoch stark auf virale Vektoren für den Gentransfer angewiesen. Die Implementierung viraler Vektoren in ACT, insbesondere unter GMP-Bedingungen (Good Manufacturing Practice) in einem akademischen Umfeld, stellt aufgrund von Skalierbarkeitsbeschränkungen, speziellen Ausrüstungsanforderungen, dem Bedarf an hochqualifiziertem Personal und der Verwendung von GMP-konformen Reagenzien für die Plasmid-vermittelte Produktion von Viruspartikeln erhebliche Herausforderungendar 6,7,8.
Folglich ist der Herstellungsprozess für genmodifizierte T-Zelltherapien kompliziert und beginnt typischerweise mit der Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einem Leukaphereseprodukt. T-Zellen werden häufig aus dem PBMC-Pool angereichert und mit Anti-CD3/CD28-Mikrokomplexen aktiviert 7,9. Anschließend werden T-Zellen entweder mit viralen oder nicht-viralen Vektoren genetisch verändert, die in situ hergestellt oder ausgelagert werden können. Um die erforderliche Zellzahl für die Infusion zu erreichen, werden genmodifizierte Zellen vor der endgültigen Formulierung und/oder Kryokonservierung expandiert. Schließlich muss das Zellprodukt verschiedene Freigabekriterien erfüllen, die auf mehreren Qualitätskontrollassays basieren9.
Dieses Protokoll stellt eine umfassende Methodik dar, die einfache Techniken für die Ex-vivo-Manipulation gesunder PBMCs verwendet, um ein genmodifiziertes T-Zellprodukt unter GMP-konformen Bedingungen herzustellen. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung eines lentiviralen Vektors, der an ein virales Produktionsunternehmen ausgelagert werden kann, das alle erforderlichen quantitativen/funktionellen, Reinheits- und Sicherheitstests (z. B. Virustiter, Nachweis von Lentivirus, DNA-Replikations-kompetentem Lentivirus der Wirtszelle) anbietet. Für diese Studie ist der verwendete Vektor ein auf VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) basierender lentiviraler Vektor der zweiten Generation mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) als interessierendem Gen in konstitutiver Expression.

<table><tbody><tr><td>24-Well-TC-behandelte Platte</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>5 mL FACS-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Röhrchen</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-TC-behandelte Platte</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Puffer (1x D-PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Tragbares Luminometer</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus-Quantifizierungskit</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T-Zellen TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Human&nbsp; CD3 (Klon: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Detection Kit</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm ultra-expandierbares Verschlussfolienband 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (Apheresebeutel)</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Hobel Kryo10 Serie III</td><td>Hobel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4%ige Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

ein gmp-konformes verfahren zur erzeugung genmodifizierter t-zellen

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

Das Gebiet der adoptiven Zelltherapie (ACT) wurde durch die Entwicklung genetisch veränderter Zellen, insbesondere chimärer Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen, revolutioniert. Diese modifizierten Zellen haben bei Patienten mit hämatologischen Malignomen bemerkenswerte klinische Reaktionen gezeigt. Die hohen Kosten für die Herstellung dieser Therapien und die Durchführung umfangreicher Qualitätskontrollbewertungen haben jedoch ihren Zugang zu einem breiteren Spektrum von Patienten eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, untersuchen viele akademische Einrichtungen die Machbarkeit der eigenen Herstellung gentechnisch veränderter Zellen unter Einhaltung der Richtlinien nationaler und internationaler Regulierungsbehörden.
Die Herstellung gentechnisch veränderter T-Zell-Produkte in großem Maßstab stellt mehrere Herausforderungen dar, insbesondere im Hinblick auf die Produktionskapazitäten der Institution und die Notwendigkeit, die Anforderungen an die Infusionsmenge zu erfüllen. Eine große Herausforderung besteht darin, großflächige virale Vektoren nach den Richtlinien der Good Manufacturing Practice (GMP) herzustellen, die oft an externe Unternehmen ausgelagert werden. Darüber hinaus kann die Vereinfachung des T-Zell-Transduktionsprozesses dazu beitragen, die Variabilität zwischen den Produktionschargen zu minimieren, die Kosten zu senken und die Schulung des Personals zu erleichtern. In dieser Studie skizzieren wir einen optimierten Prozess für die lentivirale Transduktion von primären menschlichen T-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker als interessierendem Gen. Der gesamte Prozess entspricht GMP-konformen Standards und wird in unserer akademischen Einrichtung implementiert.

Bewertung der Transduktionseffizienz Die transduzierten Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Expression des interessierenden Gens (GFP) untersucht. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. An Tag 14 waren mehr als 95% der Zellen CD3+, was auf eine erfolgreiche T-Zell-Aktivierung und -Expansion hinweist. Die Transduktionseffizienz innerhalb der CD3+-Population wurde mit 58,7 % gemessen (TD, <strong class="xfi...

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Transduktion primärer menschlicher T-Zellen mit einem Gen von Interesse, um die Kompatibilität mit den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sicherzustellen.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Dieses Protokoll beschreibt einen vereinfachten und GNP-konformen Prozess der Transduktion menschlicher primärer T-Zellen mit einem Gen von Interesse. Diese spezielle Technik wurde so konzipiert, dass sie kostengünstig und GNP-konform ist, ohne dass teure Fertigungsplattformen mit geschlossenen Systemen verwendet werden müssen, die derzeit in vielen akademischen Zentren verfügbar sind. Diese Methode könnte möglicherweise auf die Erzeugung genmodifizierter Zelltherapien angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CAR-T-Zellen, die einen Paradigmenwechsel zur Bekämpfung hämatologischer Malignome darstellen.Um PBMC aus den Zellen zu isolieren, die nach der Leukapherese von Spenderblut entnommen wurden, führen Sie eine Dichtegradientenzentrifugation der Probe auf Polysaccharidbasis durch, wobei ein Reagenzien-Proben-Verhältnis von 1:2 beibehalten wird, indem Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei ausgeschalteten Bremsen zentrifugieren. Sammeln Sie dann mit einer Mikropipette die PBMCs in einem sauberen 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation.Vor der Resuspendierung der gewaschenen Zellen in vollständigen hämat

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Das Video beschreibt einen Prozess zur Herstellung genetisch veränderter CAR-T-Zellen durch das CRISPR-Cas9-System. Die Infektion von T-Zellen mit CRISPR- und CAR-Lentiviren führt zu Veränderungen des Zielgens und zur Synthese eines chimären Antigenrezeptors (CAR), was schließlich zur Bildung genetisch veränderter CAR-T-Zellen führt.

Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Gen-Editierung in menschlichen T-Zellen mit der CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Mischung aus primären CD4+- und CD8+-T-Zellen wird mit einem CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex kombiniert, der auf spezifische Gene für den Knockout abzielt. Bei der Elektroporation leitet die sgRNA Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt so präzise Schnitte. Diese Schnitte werden dann durch den nicht-homologen Endverbindungsmechanismus der Zelle repariert, was zu...

Eine CRISPR-Cas9-Technik zur Gen-Editierung in T-Zellen

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe...

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare Methode zur Erweiterung von Adoptive Cell Therapies (ACT)-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zellen und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, mit gasdurchlässigen Rapid Expansion (G-Rex)-Geräten, die ein effizientes und robustes Wachstum in einem klinisch relevanten Kontext nachweisen.

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

Erfahren Sie ein GMP-konformes Verfahren zur Transduktion humaner primärer T-Zellen für Gentherapie und CAR T-Zell-Therapien. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die Herstellung genmodifizierter Zelltherapien ohne teure geschlossene Systeme.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

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