Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek

De vena saphena wordt plotseling blootgesteld aan arteriële aandoeningen na een coronaire bypass-operatie. Het begrijpen van de aanpassingsreactie op mechanische stress kan helpen bij het ontwerpen van therapeutische hulpmiddelen om adertransplantaatfalen te voorkomen. Dit endotheelcelisolatieprotocol is heel eenvoudig en vereist alleen incubatie met collagenase.

Met minimale vaatmanipulatie resulteert dit in verminderde besmetting met gladde spiercellen en fibroblasten. Het protocol voor het isoleren van menselijke SVECs en het kweken ervan onder schuifspanning en cyclische rek is essentieel om de bijdrage van mechanische krachten in endotheelceldisfunctie geassocieerd met falen van sapheneuze adertransplantaten te begrijpen. Eerdere endotheelcelcultuur is zeer veeleisend in termen van celmediasupplementen.

Het is verplicht om groeifactoren toe te voegen om een cultuur, de menselijke SVECs, met succes te isoleren. Voor het isoleren van primaire menselijke vena endotheliale cellen of menselijke SVECs, verzamel ten minste een twee tot drie centimeter lang saphenous adersegment. Werk onder een steriele laminaire stromingskap en breng het adersegment over naar een petrischaal gevuld met voorverwarmde PBS.

Om al het bloed uit het lumen te verwijderen, plaatst u een pipetpunt die aan een pipet is bevestigd en gevuld met PBS in het ene uiteinde van de ader en spoelt u deze voorzichtig door. Spoel het door totdat de wasstroom volledig helder is. Sluit vervolgens het ene uiteinde van de ader met een steriele katoenen hechting.

Vul het vat voorzichtig met één milligram per milliliter collagenase type 2-oplossing en sluit het andere uiteinde van het vat met een katoenen hechtdraad. Incubeer het vat met collagenase-oplossing in een bevochtigde atmosfeer van 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Snijd vervolgens het ene uiteinde van het vat over een buis van 15 milliliter om de collagenase-oplossing te verzamelen voordat u het andere uiteinde snijdt.

Spoel het luminale oppervlak met één tot twee milliliter PBS om alle losgemaakte endotheelcellen in de buis te verzamelen met collagenase. Centrifugeer de buis op 400G in kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van het supernatant, suspensie de celpellet opnieuw in drie tot vier milliliter volledig endotheelcelmedium met een extra heparine-oplossing.

Plaats de cellen in een celkweekschaal van 60 millimeter, voorgecoat met 3% gewicht per volume gelatine. Incubeer de cellen in een bevochtigde atmosfeer gedurende vier dagen zonder het medium te veranderen. Verander daarna het medium om de andere dag zonder de heparinesuppletie toe te voegen.

Onderzoek de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de rode bloedcellen zijn verwijderd. Na één tot vier dagen na extractie, afhankelijk van de grootte en diameter van het adersegment, visualiseert u de menselijke SVECs door fasecontrastmicroscopie om de mate van samenvloeiing en hun kasseimorfologie te evalueren. Blijf de media om de twee dagen veranderen totdat de cellen 70% tot 80% confluentie bereiken.

Bedek de schuif met 0,1% gewicht per volume gelatine en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 graden Celsius. Om de vloeistofeenheid en de steriele perfusieset met reservoirs van 10 millimeter in evenwicht te brengen, incubeer je die 's nachts in een bevochtigde atmosfeer. Voor het schuifspanningsexperiment zaait u 200.000 endotheelcellen gesuspendeerd in 100 microliter kweekmedium in de met gelatine gecoate stroomkamer.

Voor het bevestigen van de cellen aan het kweekoppervlak, incubeer de cellen gedurende vier uur. Plaats de perfusieset op de fluidic unit. Vul de reservoirs en de perfusieset met ongeveer 12 milliliter voorverwarmd compleet endotheelcelmedium.

Verwijder luchtbellen uit de perfusieset om het niveau van beide reservoirs op vijf milliliter in evenwicht te brengen. Plaats de vloeistofeenheid op de gemonteerde perfusieset zonder dat de kamer in de incubator schuift en sluit de elektrische kabel aan op de computergestuurde pomp. Door het vooraf gedefinieerde protocol in de pompbesturingssoftware uit te voeren, verwijdert u alle luchtbellen uit de reservoirs en de perfusieset.

Neem de fluidic unit met de gemonteerde perfusieset op de laminaire flowkap en bevestig de dia's met een confluence cell monolayer. Nadat u de hele unit met de dia's in de couveuse hebt geplaatst, sluit u de elektrische kabel aan op de pomp. Pas in de pompbesturingssoftware de instelling van de vloeistofeenheid aan door het type dia te selecteren en de viscositeit van het medium in te stellen.

Voer in stroomparameters de afschuifspanningswaarde in en stel de cyclusduur en het debiettype in. Klik vervolgens op de afspeelknop om het experiment te starten. Vergeet niet om de dia te onderhouden met cellen die zijn behandeld met dezelfde media zonder blootstelling aan stroming als statische controles.

Breng glijmiddel op siliconenbasis aan op de boven- en zijkanten van het 25-millimeter 6-well equibiaxiale laadstation. Zaai 400.000 cellen gesuspendeerd in drie milliliter aan elke put van de 6-well flexible-bottomed kweekplaten bedekt met collageen één. Incubeer de cellen in bevochtigde lucht totdat ze 100% confluency bereiken.

Voordat u met het stretchprotocol begint, wast u de cellen eenmaal met voorverwarmde PBS en voegt u drie milliliter vers kweekmedium per put toe. Plaats de basisplaat met alle gesmeerde laadstations in de incubator en sluit de slang op de juiste manier aan op de controllerapparatuur van het bi-bioreactorsysteem voor spanningscellen. Bevestig elke kweekplaat aan één rode pakking die door het bioreactorsysteem wordt geleverd.

Plaats ze vervolgens in de bodemplaat in de couveuse. Plaats alle vier de kweekplaten in de basisplaat om de juiste vacuüm- en rekbelasting te bereiken. Schakel de controllerapparatuur en het computersysteem in.

Open de FlexCell-besturingssoftware en configureer het gewenste regime, inclusief het percentage rek, golfvormvorm, frequentie en tijd. Bewaar het regime. Schakel het vacuümsysteem in, selecteer vervolgens het regime en klik op start op het computerscherm om het uitrekken uit te voeren.

Controleer of het siliconenmembraan de cellen beweegt en uitrekt. De aangehechte endotheelcellen konden 4 tot 10 dagen na de extractie worden waargenomen. Ze vormen aanvankelijk celclusters met een typische kasseimorfologie.

Zij drukten de EG-markers CD31 en VE-cadherine uit. De hSVECs bij kweek onder schuifspanning uitgelijnd in de richting van de stroming. De schuifspanning van 20 dynes per vierkante centimeter gedurende 72 uur induceert de expressie van typische mechanosensitieve genen, KLF2, KLF4 en NOS3, wat de effectiviteit van de schuifprikkel aangeeft.

De cyclische rekuitkomst hing af van de intensiteit die werd toegepast op de menselijke SVECs. Cellen onder lage rek vertoonden een corticale F-actinepatroon vergelijkbaar met statische cellen. Zonder verandering in de afgifte van stikstofmonoxide gedurende maximaal 72 uur, hebben onze arteriële niveaus van stretch het actinecytoskelet na 24 uur gemodelleerd en na 72 uur de NO-afgifte verlaagd.

Naast mechanische stressstudies kunnen onderzoekers de geïsoleerde cellen gebruiken om verschillende methoden uit te voeren om de kennis van de endotheelcelfunctie en disfunctie uit te breiden. Volgens het gedemonstreerde protocol is het mogelijk om elk ander type endotheelcellen te bestuderen onder schuifspanning en rek.