Name: Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer hoe je TGFβ/BMP/SMAD-signalering visualiseert en kwantificeert in endotheelcellen onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay. Deze methode is waardevol voor vasculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Maria Reichenbach en Dr. Christian Hiepen voor hun steun aan het flow-set-up systeem en Eleanor Fox en Yunyun Xiao voor het kritisch lezen van het manuscript. P-L.M. werd gefinancierd door de internationale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK ontving financiering van de DFG-SFB1444. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.

1. Blootstelling aan celkweek en vloeistofafschuivingsstress
OPMERKING: Humane navelstrengader EC's (HUVECs) werden gebruikt als voorbeeld om SS-geïnduceerde interactie van SMADs te bestuderen. Het hieronder beschreven protocol kan worden toegepast op elk SS-responsief celtype.
<ol><li>Bestrijk 6-kanaals dia met 0,1% varkenshuidgelatine in PBS gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Zaad HUVECs in voorgecoate 6-kanaals dia's met een dichtheid van 2,5 x 106 cellen per ml in 30 μL M199 volledig medium. OPMERKING: Voor meer informatie over het zaaien van cellen in de stroomdia, zie referentie24.</li>
	<li>Laat cellen zich 1 uur hechten bij 37 °C in een bevochtigde incubator.</li>
	<li>Voeg 60 μL voorverwarmd M199 vol medium toe aan elk van de reservoirs.</li>
	<li>Kweek gedurende 2 dagen, met een zachte medium uitwisseling eenmaal daags, bij 37 °C in een bevochtigde incubator.<ol>
<li>Zuig de reservoirs volledig aan, voeg 120 μL voorverwarmd M199 volledig medium toe in een van de reservoirs en zuig vanaf de andere kant op.</li>
		<li>Voeg 60 μL voorverwarmd M199 vol medium toe aan beide reservoirs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monteer en start de stroomopstelling zoals beschreven in de reference25.<ol>
<li>Monteer slangen op vloeistofeenheden. Hier worden siliconenbuizen met een diameter van 0,8 mm en 1,6 mm gebruikt om schuifspanning van respectievelijk 1 kleurstof /cm2 en 30 kleurstof / cm2 toe te passen. OPMERKING: Het materiaal en de buislengte moeten constant blijven, omdat veranderingen de resulterende schuifspanning kunnen beïnvloeden. Over het algemeen kunnen andere combinaties van pompsystemen en slangen worden gebruikt, zolang de resulterende schuifspanning bekend is en de pomp een constante laminaire stroom creëert.</li>
		<li>Vul de reservoirs met een geschikte hoeveelheid voorverwarmd M199 vol medium (minimaal 10 ml).</li>
		<li>Sluit vloeistofeenheden met de slang aan op het pompsysteem en voer een voorloop uit zonder cellen om het medium in evenwicht te brengen en eventuele resterende lucht te verwijderen25.</li>
		<li>Verbind de afzonderlijke kanalen op de 6-kanaals schuif serieel met elkaar door middel van seriële verbindingsslangen. Het eerste en het laatste kanaal op de dia worden aangesloten op de in 1.6.1 gemonteerde buis (zie figuur 1A voor een schema). Zorg ervoor dat u geen lucht in het systeem brengt, omdat dit de cellen ernstig kan schaden. Meer informatie over de seriële verbinding is te vinden in reference26.</li>
		<li>Gebruik voor de blootstelling van cellen aan hoge niveaus van schuifspanning (>20 dyn / cm2) een rampfase, d.w.z. verhoog de schuifspanning stapsgewijs met aanpassingsfasen. Stappen kunnen worden ingesteld in stappen van 5 dyn/cm2 per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixatie
<ol><li>Maak de glijdingen van de pompen los na blootstelling aan de vloeistof SS. Gebruik klemmen op de slang bij het losmaken, om te voorkomen dat het medium in de couveuse wordt gemorst.</li>
	<li>Breng onmiddellijk stromingsglijbanen over op ijs, terwijl de resterende buizen sequentieel worden losgemaakt. Bij het verwijderen van de slang uit reservoirs moet het reservoir aan de andere kant met een vinger worden gesloten om te voorkomen dat luchtbellen in het kanaal worden opgesloten. Dit kan de fixatiestappen verstoren.</li>
	<li>Houd de cellen op ijs en zuig het medium voorzichtig op uit de reservoirs, maar niet uit het kanaal waar de cellen zich bevinden. Was vervolgens monsters met koud steriel PBS (4 °C) met driemaal het kanaalvolume (90 μL). Voeg PBS toe in het ene reservoir en zuig voorzichtig op uit het andere reservoir. Herhaal deze stap in elk van de 6 kanalen per dia. OPMERKING: Voor alle was- en incubatiestappen wordt de respectieve oplossing toegevoegd in een van de reservoirs, wat leidt tot een uitwisseling van oplossingen in het kanaal. Om volledige vervanging van oplossingen in het kanaal mogelijk te maken, wordt de overtollige oplossing vervolgens aangezogen uit het andere reservoir. Oplossing aan de bovenkant van de cellen in het kanaal wordt niet verwijderd. Cellen mogen op geen enkel moment drogen. Daarom is het belangrijk om zorgvuldig te wassen zonder dat er luchtbellen in de dia's worden ingebracht.</li>
	<li>Fixeer de cellen door 90 μL gebufferde 4% PFA-oplossing toe te voegen aan hetzelfde reservoir waar de PBS vooraf is toegevoegd en zuig op dezelfde manier de vloeistof uit het andere reservoir aan. Herhaal deze stap in elk kanaal in elke dia. Breng na de toevoeging van de PFA-oplossing de monsters over van ijs naar kamertemperatuur (RT) en incubeer gedurende 20 minuten. LET OP: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld. Gebruik handschoenen en werk onder een zuurkast.</li>
	<li>Was cellen 3x met PBS (RT) door het in het ene reservoir toe te voegen en voorzichtig uit het andere reservoir te zuigen. Leeg alleen de reservoirs en zorg ervoor dat het kanaal niet uitdroogt. Herhaal deze stap voor elk van de 6 kanalen per dia.</li>
	<li>Blus de PFA-fixatie door 90 μL omgevingsactief 50 mM ammoniumchloride in PBS toe te voegen in een van de reservoirs. Zuig overtollige oplossing uit het andere reservoir. Herhaal dit voor elk kanaal in de dia. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT.</li>
	<li>Wassen zoals beschreven in stap 2.5. OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters 's nachts bij 4 °C worden bewaard, of het protocol kan onmiddellijk worden voortgezet met blokkering en primaire antilichaamincubatie (zie stap 3).</li>
</ol>3. Blokkering en primaire antilichaamincubatie
<ol><li>Om de cellen te permeabiliseren, voegt u 90 μL van 0,3% Triton-X-100 in PBS toe aan een leeg reservoir en zuigt u voor elk kanaal uit het andere reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.</li>
	<li>Wassen zoals beschreven in stap 2.5.</li>
	<li>Voeg 90 μL steriele PLA-blokkerende oplossing toe in het ene reservoir van een kanaal en adem vanaf de andere kant op. Herhaal deze stap voor elk kanaal. Blok gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.<ol>
<li>Om een bevochtigde kamer te maken, gebruikt u een schaal van 10 cm met nat weefsel afgesloten met wasfolie en plaatst u de schaal in de couveuse. Als alternatief kunnen andere vochtigheidskamerformaten worden gebruikt die een vochtige atmosfeer leveren. OPMERKING: Als alternatief kan een zelfgemaakte blokkeringsoplossing worden gebruikt (bijv. 3% (w / v) BSA in PBS, steriel gefilterd).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid primaire antilichamen (1:100) voor in PLA-antilichaamverdunningsmiddel. Bereid 30 μL van de oplossing per kanaal. Voeg beide primaire antilichamen tegelijkertijd en vortex toe. OPMERKING: Als alternatief kan zelfgemaakt antilichaamverdunningsmiddel worden gebruikt (bijv. 1% (w / v) BSA in PBS). Antilichamen die hier worden gebruikt zijn combinaties van SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 en fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Gedetailleerde informatie is te vinden in de Tabel met Materialen.</li>
	<li>Voordat primaire antilichamen worden aangebracht, zuigt u de blokkerende oplossing op uit de reservoirs en ook voorzichtig uit het kanaal. Pipetteer 30 μL van de primaire antilichaamoplossing onmiddellijk in het lege kanaal door het kanaal te kantelen terwijl de oplossing wordt toegevoegd. OPMERKING: Voer de verwijdering van de blokkerende oplossing en toevoeging van de antilichaamoplossing kanaal voor kanaal uit om ervoor te zorgen dat cellen niet tussendoor uitdrogen.</li>
	<li>Incubateer monsters met de primaire antilichamen 's nachts in bevochtigde kamers bij 4 °C. OPMERKING: De incubatie kan ook gedurende 1 uur bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, als u geïnteresseerd bent om op dezelfde dag door te gaan met de volgende stappen.</li>
</ol>4. PLA probe incubatie
OPMERKING: Voor alle stappen in rubriek 4.1-7.3 worden de wasbuffers A en B bewaard bij 4 °C en moeten ze vóór gebruik worden opgewarmd tot RT.
<ol><li>Verdun PLA-probes (+)-muis en (-)-konijn tot 1:5 in PLA antilichaam verdunningsmiddel (of 1% BSA) oplossing. Bereid 30 μL per kanaal.</li>
	<li>Was monsters 2x gedurende 5 minuten met behulp van 90 μL van de wasbuffer A bij RT door deze toe te voegen in een van de reservoirs en voorzichtig uit het andere reservoir te zuigen. Herhaal deze stap voor elk van de 6 kanalen per dia.</li>
	<li>Zuig de wasbuffer A voorzichtig op en voeg 30 μL PLA-sondeoplossing (bereid in stap 4.1) toe, vergelijkbaar met de toevoeging van primaire antilichamen in stap 3.5.</li>
	<li>Incubeer monsters gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.</li>
</ol>5. Ligatie
<ol><li>Was monsters 2x gedurende 5 minuten met 90 μL van de wasbuffer A bij RT, zoals beschreven in 4.2.</li>
	<li>Bereid een 1:5 verdunning van de ligatiebuffer in gedeïoniseerd water. Gebruik deze buffer om het ligase-enzym te verdunnen tot 1:40 (op ijs). Gebruik 30 μL per kanaal.</li>
	<li>Zuig de wasbuffer A volledig aan en voeg de ligatieoplossing toe zoals beschreven in punt 3.5.</li>
	<li>Incubeer monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.</li>
</ol>6. Versterking
<ol><li>Was monsters 2x gedurende 2 minuten met 90 μL wasbuffer A bij RT, zoals beschreven in 4.2.</li>
	<li>Bereid de amplificatiebuffer voor door deze 1:5 te verdunnen in gedeïoniseerd water en gebruik deze om het polymerase-enzym te verdunnen tot 1:80 (op ijs). Bescherm tegen licht. Bereid 30 μL per kanaal.</li>
	<li>Zuig de wasbuffer A volledig aan en voeg onmiddellijk de bereide versterkingsoplossing toe aan het lege kanaal, zoals beschreven in punt 3.5. Incubeer monsters gedurende 100 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.</li>
</ol>7. Montage
<ol><li>Was monsters 2x gedurende 10 minuten met 90 μL wasbuffer B bij RT zoals beschreven in 4.2. Voeg DAPI (1:500) van 1 mg/ml stamoplossing (in gedeïoniseerd water) toe aan de eerste wasbeurt om kernen te bevlekken. Droog het kanaal niet.</li>
	<li>Verdun de wasbuffer B in gedeïoniseerd water (1:10) en was 1x met 90 μL 0,1x buffer B-oplossing zoals beschreven in 4.2.</li>
	<li>Zuig de wasbuffer B volledig op en voeg onmiddellijk 2-3 druppels van het vloeibare montagemedium toe aan één reservoir. Verdeel het in het kanaal door de schuif te kantelen. Bewaar monsters bij 4 °C in een bevochtigde omgeving totdat ze worden ingebeeld.</li>
</ol>8. Beeldverwerving
<ol><li>Verkrijg beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat de respectievelijke filters die op de fluorescerende PLA-sondes passen, beschikbaar zijn. OPMERKING: Het is gunstig om gebruik te maken van een confocale microscoop, indien mogelijk, omdat verkregen PLA-vlekken meer gedefinieerd zijn. Dit ondersteunt ook verdere beeldverwerking en data-analyse.</li>
</ol>9. Beeldanalyse en kwantificering met behulp van ImageJ / FIJI
<ol><li>Verwerk geëxporteerde afbeeldingen (.tiff) met een beeldverwerkingsprogramma, zoals ImageJ27. OPMERKING: Alle scripts die in deze studie worden gebruikt en die nodig zijn voor het automatisch tellen van cellulaire, nucleaire en alle PLA-gebeurtenissen (per cel) zijn te vinden in een GitHub-repository: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Voer statistische analyses uit met behulp van een geschikt programma of hulpmiddel.</li>
</ol>

<ol><li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+BMP+receptors%3A+Specificity%2C+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF%CE%B2+responses+and+altered+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).</li>
<li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ActivinA+induced+SMAD1%2F5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+%28FOP%29+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+receptor-like+kinase+%28ALK%291+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta%2FALK5+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li>
<li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1%2F5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li>
<li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1%2F5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756(2018).</li>
<li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-%CE%B2%2Fbone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry+%3A+The+Official+Journal+of+The+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazono%2C+K+%22Smad+Signal+Transduction%3A+Smads+in+Proliferation%2C+Differentiation+and+Disease%22">Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease</a>. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).</li>
<li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).</li>
<li>Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li>
<li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+TGF-%CE%B2%2FBMP+signaling+in+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li>
<li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loeys-Dietz+syndrome%3A+a+primer+for+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine+%3A+An+Official+Journal+of+the+American+College+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Smad+2%2F3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1%2F5+and+proliferation+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-specific+activation+of+Smad1%2F5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li>
<li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis%3A+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li>
<li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+Assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).</li>
<li>Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012).</li>
<li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019).</li>
<li>ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ibidi%22">ibidi</a>. , (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP%2FTAZ+on+BMP%2FTGF-%CE%B2+induced+osteogenic+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).</li>
<li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+takes+two+to+tango%3A+Endothelial+TGF%CE%B2%2FBMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Het hier beschreven OP PLA gebaseerde protocol biedt een efficiënte manier om de nabijheid van twee eiwitten (bijvoorbeeld hun directe interactie) te bepalen in EC's die zijn blootgesteld aan schuifspanning met kwantitatieve en ruimtelijke resolutie. Door gebruik te maken van flowglaasjes met meerdere parallelle kanalen kunnen verschillende eiwitinteracties tegelijkertijd worden onderzocht in cellen onder identieke mechanische omstandigheden. Op maat gemaakte stroomkamersystemen maken daarentegen vaak gebruik van een enk...

Eiwitten van de transforming growth factors beta (TGFβ) superfamilie zijn pleiotrope cytokines met een verscheidenheid aan leden, waaronder TGFβs, botmorfogenetische eiwitten (BMP's) en Activinen1,2. Ligandbinding induceert de vorming van receptor oligomeren die leiden tot de fosforylering en daarmee activering van cytosolische regulerende SMAD (R-SMAD). Afhankelijk van de subfamilie van liganden worden verschillende R-SMADs geactiveerd1,2. Terwijl TGFβs en Activins voornamelijk fosforylering van SMAD2/3 induceren, induceren BMP's SMAD1/5/8 fosforylering. Er zijn echter steeds meer aanwijzingen dat BMP's en TGFβs/Activinen ook R-SMADs van de respectieve andere subfamilie activeren, in een proces dat wordt aangeduid als 'laterale signalering'3,4,5,6,7,8 en dat er gemengde SMAD-complexen zijn die bestaan uit zowel SMAD1/5 als SMAD2/3, leden3,9 . Twee geactiveerde R-SMADs vormen vervolgens trimerische complexen met de gemeenschappelijke mediator SMAD4. Deze transcriptiefactorcomplexen zijn vervolgens in staat om naar de kern te transloceren en de transcriptie van doelgenen te reguleren. SMADs kunnen interageren met een verscheidenheid aan verschillende transcriptionele co-activatoren en co-repressoren, wat leidt tot de diversificatie van de mogelijkheden om doelgenen te reguleren10. Deregulering van SMAD-signalering heeft ernstige gevolgen voor een verscheidenheid aan ziekten. In lijn hiermee kan onevenwichtige TGFβ / BMP-signalering leiden tot ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arteriële hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie of atherosclerose3,11,12,13,14.
Endotheelcellen (EC's) vormen de binnenste laag van bloedvaten en worden daarom blootgesteld aan schuifspanning (SS), een wrijvingskracht die wordt uitgeoefend door de viskeuze bloedstroom. Interessant is dat EC's die zich bevinden in de delen van de vasculatuur, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van uniforme, laminaire SS, in een homeostatische en rustige toestand worden gehouden. Daarentegen zijn EC's die lage, niet-uniforme SS ervaren, bijvoorbeeld bij bifurcaties of de kleinere kromming van de aortaboog, proliferatief en activeren ontstekingsroutes15. Op hun beurt zijn plaatsen van disfunctionele EC's vatbaar voor het ontwikkelen van atherosclerose. Interessant is dat EC's in deze atheroprone gebieden afwijkend hoge niveaus van geactiveerde SMAD2 / 3 en SMAD1 / 516, 17,18 vertonen. In deze context bleek verbeterde TGFβ/BMP-signalering een vroege gebeurtenis te zijn in de ontwikkeling van atherosclerotische laesies19 en interferentie met BMP-signalering bleek vasculaire ontsteking, atheromavorming en bijbehorende calcificatie aanzienlijk te verminderen20.
Proximity Ligation Assay (PLA) is een biochemische techniek om eiwit-eiwit interacties in situ21,22 te bestuderen. Het is gebaseerd op de specificiteit van antilichamen van verschillende soorten die doeleiwitten van belang kunnen binden, waardoor zeer specifieke detectie van endogene eiwitinteracties op eencellig niveau mogelijk is. Hier moeten primaire antilichamen zich binden aan hun doelepithop op een afstand van minder dan 40 nm om de detectie mogelijk te maken23. Daarom is PLA zeer gunstig ten opzichte van traditionele co-immunoprecipitatiebenaderingen, waarbij enkele miljoenen cellen nodig zijn om endogene eiwitinteracties te detecteren. In PLA binden soortspecifieke secundaire antilichamen, covalent gekoppeld aan DNA-fragmenten (plus- en minus-sondes genoemd), de primaire antilichamen en als de eiwitten van belang op elkaar inwerken, komen plus- en minus-sondes in de buurt. Het DNA wordt in de volgende stap geligeerd en de rollende cirkelversterking van het circulaire DNA wordt mogelijk gemaakt. Tijdens amplificatie binden fluorescerend gelabelde complementaire oligonucleotiden aan het gesynthetiseerde DNA, waardoor deze eiwitinteracties kunnen worden gevisualiseerd door conventionele fluorescentiemicroscopie.
Het hier beschreven protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal actieve SMAD-transcriptiecomplexen bij atheroprotectieve en atheroprone SS-condities in vitro kwantitatief te vergelijken met behulp van PLA. RVS wordt gegenereerd via een programmeerbaar pneumatisch pompsysteem dat in staat is om laminaire unidirectionele stroom van gedefinieerde niveaus te genereren en stapsgewijze verhogingen van debieten mogelijk maakt. Deze methode maakt het mogelijk om interacties tussen SMAD1/5 of SMAD2/3 met SMAD4 te detecteren, evenals gemengde R-SMAD-complexen. Het kan eenvoudig worden uitgebreid om interacties van SMADs met transcriptionele co-regulatoren te analyseren of om transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs te analyseren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van het protocol hieronder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van het beschreven protocol. (A) Cellen gezaaid in 6-kanaals dia's worden blootgesteld aan schuifspanning met een pneumatisch pompsysteem. (B) Vaste cellen worden gebruikt voor PLA-experimenten of voor controleomstandigheden. (C) Beelden van PLA-experimenten worden verkregen met een fluorescentiemicroscoop en worden geanalyseerd met behulp van ImageJ-analysesoftware. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>6-kanaals slide</td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Quenching</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Blocking</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Stain DNA/Nuclei</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>PLA-kit met Ligase, ligatiebuffer, polymerase en amplificatiebuffer (met groen gelabelde oligonucleotiden)</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS probe</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92002</td><td>PLUS probe</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA-wasbuffers A en B</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement</td><td>Corning</td><td></td><td>supplement voor medium (ECGS)</td></tr><tr><td>Fetal calf Serum</td><td></td><td></td><td>supplement voor medium</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4% buffered</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186.BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Full medium</td><td></td><td></td><td>M199 basaal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &micro;g/mL Hep +&nbsp;&nbsp; 50 &micro;g/mL ECGS</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin, Type A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gebruik 0,1% in PBS voor coating van flowkanalen</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>Statistisch programma gebruikt voor de grafieken en statistische berekeningen</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>supplement voor medium (Hep)</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi Mounting Medium</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Vloeibaar montagemedium</td></tr><tr><td>ibidi Pump System</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>pneumatische pomp</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>confocale microscoop</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>supplement voor medium (L-Glu)</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Basismedium</td></tr><tr><td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>Geschikt voor PLA</td></tr><tr><td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>Niet geschikt voor PLA in combinatie met CST 9515</td></tr><tr><td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Geschikt voor PLA</td></tr><tr><td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>supplement voor medium (P/S)</td></tr><tr><td>Perfusion Set WHITE</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Slangen gebruikt voor 1 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Slangen gebruikt voor 30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9516</td><td>Geschikt voor PLA</td></tr><tr><td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>8685</td><td>Geschikt voor PLA</td></tr><tr><td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9515</td><td>Niet geschikt voor PLA in combinatie met BD 610843</td></tr><tr><td>Serial Connector for &micro;-Slides</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>serieverbindingsbuizen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Permeabilisatie</td></tr></tbody></table>

visualisatie en kwantificering van tgfβ/bmp/smad-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering is strak gereguleerd en gebalanceerd tijdens de ontwikkeling en homeostase van het vasculatuursysteem Daarom resulteert deregulering in deze signaleringsroute in ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arterie hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie en atherosclerose. Endotheelcellen (EC's), als de binnenste laag van bloedvaten, worden voortdurend blootgesteld aan vloeistofschuifstress (SS). Van abnormale patronen van vloeibare SS is aangetoond dat ze de TGFβ / BMP-signalering verbeteren, die, samen met andere stimuli, atherogenese induceren. In verband hiermee bleek atheroprone, lage laminaire SS de TGFβ/BMP-signalering te verbeteren, terwijl atheroprotectieve, hoge laminaire SS deze signalering vermindert. Om de activering van deze paden efficiënt te analyseren, hebben we een workflow ontworpen om de vorming van transcriptiefactorcomplexen onder lage laminaire SS- en hoge laminaire SS-omstandigheden te onderzoeken met behulp van een in de handel verkrijgbaar pneumatisch pompsysteem en nabijheidsligatietest (PLA).
Actieve TGFβ/BMP-signalering vereist de vorming van trimerische SMAD-complexen bestaande uit twee regulerende SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 en SMAD1/5/8 voor respectievelijk TGFβ- en BMP-signalering) met een gemeenschappelijke bemiddelaar SMAD (co-SMAD; SMAD4). Met behulp van PLA gericht op verschillende subeenheden van het trimerische SMAD-complex, d.w.z. R-SMAD / co-SMAD of R-SMAD / R-SMAD, kan de vorming van actieve SMAD-transcriptiefactorcomplexen kwantitatief en ruimtelijk worden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Het gebruik van stromingsdia's met 6 kleine parallelle kanalen, die in serie kunnen worden aangesloten, maakt het mogelijk om de transcriptiefactorcomplexvorming te onderzoeken en noodzakelijke controles op te nemen. 
De hier uitgelegde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor studies die gericht zijn op de nabijheid van SMADs tot andere transcriptiefactoren of tot transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs, in verschillende vloeibare SS-omstandigheden. De hier gepresenteerde workflow toont een snelle en effectieve manier om de vloeistof SS geïnduceerde TGFβ / BMP-signalering in EC's te bestuderen, zowel kwantitatief als ruimtelijk.

We hebben eerder PLA gebruikt om interacties van verschillende SMAD-eiwitten te detecteren3 en door schuifspanning veroorzaakte veranderingen in SMAD-fosforylering28 geanalyseerd.
Hier werden beide methoden gecombineerd met het hierboven beschreven protocol. HUVECs werden onderworpen aan schuifspanning van 1 dyn/cm2 en 30 dyn/cm2 en geanalyseerd op interacties van SMAD transcriptiefactoren. We tonen aan dat, in vergelijking ...

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal transcriptiefactorcomplexen onder verschillende afschuifstressomstandigheden kwantitatief te vergelijken en zal gunstig zijn voor onderzoek in de vasculaire biologie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van microfluïdische stroomkanalen die onderzoek van verschillende antilichaamparen mogelijk maken, inclusief de respectieve controles tegelijkertijd. Om te beginnen, coat de zeskanaals dia door 0,1% varkenshuidgelatine bereid in PBS toe te voegen aan de kanalen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Leeg de kanalen van de gelatine-oplossing en zaad Huvecs in de voorgecodeerde zes kanaalglaasjes met een dichtheid van 2,5 maal 10 tot de zesde cel per milliliter in 30 microliter M199 volledig medium. Laat de cellen een uur lang hechten bij 37 graden Celsius in de bevochtigde couveuse. Voeg 60 microliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium toe aan elk van de reservoirs.Kweek de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator met medium vervanging na 24 uur. Monteer de siliconenbuizen op de vloeistofeenheden, vul de reservoirs met minimaal 10 milliliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium. Sluit de vloeistofeenheden met slangen aan op het pompsysteem en voer de voorloop uit zonder cellen voor het in evenwicht brengen van het medium en het verwijderen van resterende lucht.Sluit de afzonderlijke kanalen op de zes kanalen schuif aan met behulp van de seriële verbindingsslang. Sluit het eerste en laatste kanaal op de schuif aan op de buizen die op de fluidics-eenheid zijn gemonteerd. Voor blootstelling van de cellen aan hoge niveaus van pure stress, verhoog de pure stress stapsgewijs met aanpassingsfasen, waarbij de stappen worden ingesteld in stappen van vijf kleurstoffen per vierkante centimeter per 30 minuten.Gebruik de klonten op de slang om de glijbanen los te maken van pompen na blootstelling aan vloeistofschuifspanning, om medium morsen in de incubator te voorkomen en stroomglijbanen op ijs over te brengen. Gebruik tijdens het losmaken van de buizen van de reservoirs de vinger om de andere kant van het reservoir te sluiten om te voorkomen dat de luchtbellen in het kanaal worden opgesloten. Houd de stroom op ijs glijden, zuig het medium voorzichtig op uit de reservoirs, maar niet uit het kanaal waar de cellen zich bevinden.Was de monsters met 90 microliter koud steriel PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en zuig voorzichtig op uit het andere reservoir en herhaal dit vervolgens voor alle kanalen. Fixeer de cellen door 90 microliter gebufferde 4%PFA-oplossing toe te voegen aan hetzelfde reservoir waar de PBS is toegevoegd en zuig de vloeistof uit het andere reservoir aan zoals aangetoond. Nadat u de cellen in alle zes kanalen hebt bevestigd, brengt u de monsters over van ijs naar kamertemperatuur en incubeert u gedurende 20 minuten.Was de cellen drie keer met PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en het voorzichtig uit het andere reservoir in alle kanalen aan te zuigen, waarbij u ervoor zorgt dat de kanalen niet uitdrogen. Blus toegang tot PFA door 90 microliter omgevingsactief 15 millimolar ammoniumchloride bereid in PBS toe te voegen aan een van de reservoirs. Aspirateer uit het andere reservoir en incubeer de cellen gedurende 10 minuten.Permeabiliseer de cellen door 90 microliter van 0,3% Triton X 100 bereid in PBS toe te voegen in het lege reservoir. Aspirateer uit het andere reservoir voor elk kanaal en incubeer gedurende 10 minuten en spoel vervolgens drie keer met PBS zoals eerder aangetoond. Bij 90 microliter steriele PLA-blokkerende oplossing voor één reservoir.Adem vanaf de andere kant voor elk kanaal en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer. Voeg primaire antilichamen toe aan PLA-antilichaamverdunningsmiddel en vortex. Zuig de blokkerende oplossing voorzichtig op uit de reservoirs en kanalen.Voeg onmiddellijk 30 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan het lege kanaal door de schuif te kantelen terwijl u de oplossing toevoegt. Herhaal dit voor alle kanalen en incubeer bij vier graden Celsius in de bevochtigde kamer 's nachts of bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Verdun minus konijn en plus muis PLA sondes één tot vijf in het PLA-antilichaamverdunningsmiddel.Was alle kanalen twee keer door 90 microliter wasbuffer A toe te voegen en aan te zuigen zoals gedemonstreerd. Voeg na het aanzuigen van de wasbuffer 30 microliter PLA-sondeoplossing toe en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de ligatiebuffer één tot vijf in D-geïoniseerd water en verdun het lygus-enzym één tot 40 in de verdunde ligatiebuffer.Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter ligatieoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de amplificatiebuffer één tot vijf in gedeïoniseerd water en verdun vervolgens het polymerase-enzym één tot 80 in de verdunde amplificatiebuffer op ijs. Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter versterkingsoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer deze in de bevochtigde kamer.Verdun de DAPI één tot 500 in wasbuffer B en was alle kanalen eenmaal door 90 microliter DAPI-bevattende wasbuffer B toe te voegen en aan te zuigen zoals aangetoond om de kernen te stomen. Was vervolgens alle kanalen één keer met wasbuffer B zonder DAPI. Verdun de wasbuffer B één tot 10 in gedeïoniseerd water en was alle kanalen eenmaal met 90 microliter verdunde wasbuffer B.Voeg na het aanzuigen van wasbuffer B onmiddellijk twee tot drie druppels van het vloeibare montagemedium toe aan één reservoir en kantel de schuif om het montagemedium in alle kanalen te verdelen.Bewaar de monsters bij vier graden Celsius in een bevochtigde omgeving totdat ze worden ingebeeld. Huvecs werden blootgesteld aan hoge en lage pure stress. De lage schuifspanning verhoogde smad-eiwitinteracties in het cytosol en de kernen.Enkele antilichaamcontroles vertoonden geen tot zeer weinig signalen, wat het succes van het experiment bewijst. Verhoogde antilichaamconcentratie resulteerde in een hoger aantal PLA-gebeurtenissen per cel, maar het verschil in PLA-signalen tussen cellen met hoge en lage pure stress was verminderd. Zelfgemaakte buffers voor blokkering en antilichaamverdunning kunnen worden gebruikt als alternatief voor commerciële buffers.De kwantificering van PLA-gebeurtenissen voor commerciële en zelfgemaakte verdunnings- en blokkeringsoplossingen toonde hetzelfde patroon van PLA-signalen in de cytosolische en nucleaire gebieden. Het totale aantal PLA-gebeurtenissen per cel was echter hoger met commerciële oplossingen. Een combinatie van SMAD Two/Three, SMAD Four antilichamen werd gebruikt waar het SMAD Four antilichaam niet geschikt was voor immunofluorescentie experimenten.Er was geen verschil in PLA-gebeurtenissen in de experimentele versus controleconditie, wat wijst op het belang van het selecteren van de juiste antilichaamcombinatie om de PLA-gebeurtenissen te detecteren. Het beschreven protocol kan worden aangepast om de interacties van transcriptiefactorcomplexen te detecteren die verschillen van SMADs en daarom helpen bij het begrijpen van genregulatie in athero-gevoelige en athero-beschermende omstandigheden.

visualization-quantification-tgfbmpsmad-signaling-under-different

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.

Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.

Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat

Leer hoe je TGFβ/BMP/SMAD-signalering visualiseert en kwantificeert in endotheelcellen onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay. Deze methode is waardevol voor vasculair biologisch onderzoek.

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay (Video) | JoVE Journal

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Meer video's verkennen