Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal transcriptiefactorcomplexen onder verschillende afschuifstressomstandigheden kwantitatief te vergelijken en zal gunstig zijn voor onderzoek in de vasculaire biologie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van microfluïdische stroomkanalen die onderzoek van verschillende antilichaamparen mogelijk maken, inclusief de respectieve controles tegelijkertijd. Om te beginnen, coat de zeskanaals dia door 0,1% varkenshuidgelatine bereid in PBS toe te voegen aan de kanalen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Leeg de kanalen van de gelatine-oplossing en zaad Huvecs in de voorgecodeerde zes kanaalglaasjes met een dichtheid van 2,5 maal 10 tot de zesde cel per milliliter in 30 microliter M199 volledig medium. Laat de cellen een uur lang hechten bij 37 graden Celsius in de bevochtigde couveuse. Voeg 60 microliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium toe aan elk van de reservoirs.

Kweek de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator met medium vervanging na 24 uur. Monteer de siliconenbuizen op de vloeistofeenheden, vul de reservoirs met minimaal 10 milliliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium. Sluit de vloeistofeenheden met slangen aan op het pompsysteem en voer de voorloop uit zonder cellen voor het in evenwicht brengen van het medium en het verwijderen van resterende lucht.

Sluit de afzonderlijke kanalen op de zes kanalen schuif aan met behulp van de seriële verbindingsslang. Sluit het eerste en laatste kanaal op de schuif aan op de buizen die op de fluidics-eenheid zijn gemonteerd. Voor blootstelling van de cellen aan hoge niveaus van pure stress, verhoog de pure stress stapsgewijs met aanpassingsfasen, waarbij de stappen worden ingesteld in stappen van vijf kleurstoffen per vierkante centimeter per 30 minuten.

Gebruik de klonten op de slang om de glijbanen los te maken van pompen na blootstelling aan vloeistofschuifspanning, om medium morsen in de incubator te voorkomen en stroomglijbanen op ijs over te brengen. Gebruik tijdens het losmaken van de buizen van de reservoirs de vinger om de andere kant van het reservoir te sluiten om te voorkomen dat de luchtbellen in het kanaal worden opgesloten. Houd de stroom op ijs glijden, zuig het medium voorzichtig op uit de reservoirs, maar niet uit het kanaal waar de cellen zich bevinden.

Was de monsters met 90 microliter koud steriel PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en zuig voorzichtig op uit het andere reservoir en herhaal dit vervolgens voor alle kanalen. Fixeer de cellen door 90 microliter gebufferde 4%PFA-oplossing toe te voegen aan hetzelfde reservoir waar de PBS is toegevoegd en zuig de vloeistof uit het andere reservoir aan zoals aangetoond. Nadat u de cellen in alle zes kanalen hebt bevestigd, brengt u de monsters over van ijs naar kamertemperatuur en incubeert u gedurende 20 minuten.

Was de cellen drie keer met PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en het voorzichtig uit het andere reservoir in alle kanalen aan te zuigen, waarbij u ervoor zorgt dat de kanalen niet uitdrogen. Blus toegang tot PFA door 90 microliter omgevingsactief 15 millimolar ammoniumchloride bereid in PBS toe te voegen aan een van de reservoirs. Aspirateer uit het andere reservoir en incubeer de cellen gedurende 10 minuten.

Permeabiliseer de cellen door 90 microliter van 0,3% Triton X 100 bereid in PBS toe te voegen in het lege reservoir. Aspirateer uit het andere reservoir voor elk kanaal en incubeer gedurende 10 minuten en spoel vervolgens drie keer met PBS zoals eerder aangetoond. Bij 90 microliter steriele PLA-blokkerende oplossing voor één reservoir.

Adem vanaf de andere kant voor elk kanaal en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer. Voeg primaire antilichamen toe aan PLA-antilichaamverdunningsmiddel en vortex. Zuig de blokkerende oplossing voorzichtig op uit de reservoirs en kanalen.

Voeg onmiddellijk 30 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan het lege kanaal door de schuif te kantelen terwijl u de oplossing toevoegt. Herhaal dit voor alle kanalen en incubeer bij vier graden Celsius in de bevochtigde kamer 's nachts of bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Verdun minus konijn en plus muis PLA sondes één tot vijf in het PLA-antilichaamverdunningsmiddel.

Was alle kanalen twee keer door 90 microliter wasbuffer A toe te voegen en aan te zuigen zoals gedemonstreerd. Voeg na het aanzuigen van de wasbuffer 30 microliter PLA-sondeoplossing toe en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de ligatiebuffer één tot vijf in D-geïoniseerd water en verdun het lygus-enzym één tot 40 in de verdunde ligatiebuffer.

Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter ligatieoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de amplificatiebuffer één tot vijf in gedeïoniseerd water en verdun vervolgens het polymerase-enzym één tot 80 in de verdunde amplificatiebuffer op ijs. Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter versterkingsoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer deze in de bevochtigde kamer.

Verdun de DAPI één tot 500 in wasbuffer B en was alle kanalen eenmaal door 90 microliter DAPI-bevattende wasbuffer B toe te voegen en aan te zuigen zoals aangetoond om de kernen te stomen. Was vervolgens alle kanalen één keer met wasbuffer B zonder DAPI. Verdun de wasbuffer B één tot 10 in gedeïoniseerd water en was alle kanalen eenmaal met 90 microliter verdunde wasbuffer B.Voeg na het aanzuigen van wasbuffer B onmiddellijk twee tot drie druppels van het vloeibare montagemedium toe aan één reservoir en kantel de schuif om het montagemedium in alle kanalen te verdelen.

Bewaar de monsters bij vier graden Celsius in een bevochtigde omgeving totdat ze worden ingebeeld. Huvecs werden blootgesteld aan hoge en lage pure stress. De lage schuifspanning verhoogde smad-eiwitinteracties in het cytosol en de kernen.

Enkele antilichaamcontroles vertoonden geen tot zeer weinig signalen, wat het succes van het experiment bewijst. Verhoogde antilichaamconcentratie resulteerde in een hoger aantal PLA-gebeurtenissen per cel, maar het verschil in PLA-signalen tussen cellen met hoge en lage pure stress was verminderd. Zelfgemaakte buffers voor blokkering en antilichaamverdunning kunnen worden gebruikt als alternatief voor commerciële buffers.

De kwantificering van PLA-gebeurtenissen voor commerciële en zelfgemaakte verdunnings- en blokkeringsoplossingen toonde hetzelfde patroon van PLA-signalen in de cytosolische en nucleaire gebieden. Het totale aantal PLA-gebeurtenissen per cel was echter hoger met commerciële oplossingen. Een combinatie van SMAD Two/Three, SMAD Four antilichamen werd gebruikt waar het SMAD Four antilichaam niet geschikt was voor immunofluorescentie experimenten.

Er was geen verschil in PLA-gebeurtenissen in de experimentele versus controleconditie, wat wijst op het belang van het selecteren van de juiste antilichaamcombinatie om de PLA-gebeurtenissen te detecteren. Het beschreven protocol kan worden aangepast om de interacties van transcriptiefactorcomplexen te detecteren die verschillen van SMADs en daarom helpen bij het begrijpen van genregulatie in athero-gevoelige en athero-beschermende omstandigheden.