Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus
21. April 2023
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.
Meine Forschung konzentriert sich auf neuronale Kodierung und Mechanismen der visuellen Verarbeitung. Wir versuchen zu beantworten, wie verschiedene Informationen im Gehirn kodiert werden, insbesondere im Colliculus superior unter den zugrundeliegenden Neuromechanismen. Um die visuelle Verarbeitung zu verstehen, kombinieren Wissenschaftler verschiedene Ansätze, darunter neuronale Morphologie, antegrade und retrograde Tracing, IL-Sequenzierung, Neuromodellierung und maschinelles Lernen.
Die Herausforderung besteht darin, den Schädel über der SSA zu entfernen, zu schneiden und in einem größeren Stück im Knochen zu belassen, was wahrscheinlich fehlschlägt, da der Knochen an der Dura befestigt ist. Durch die Kombination von zwei Fotos auf einem Weitfeld-Kalziumbild enthüllte unsere jüngste Arbeit die Funktionsarchitektur der Bewegungsrichtung im SC der Maus sowohl bei Einzelzellauflösung als auch auf globaler Skala. Wir fanden heraus, dass Neuronen mit ähnlicher Präferenz Pflaster bilden, die bis zu 500 Mikrometer unter der globalen nach oben gerichteten Nasenbewegung liegen.
Mit unserem Protokoll adressieren wir zwei Forschungslücken. Erstens können Forscher eine Langzeit-Gipsbildgebung bei Mäuse-SC mit einer Einzelzellauflösung durchführen, ohne den Kortex zu unterbrechen. Zweitens können die Forscher die Neuroaktivität über das gesamte SC hinweg mit Hilfe der Weitfeldmikroskopie erfassen.
Unser Protokoll bietet ein Maß zur Abbildung des posterioren medialen SC mit Einzelzellauflösung und intaktem Kortex in Mäusen. Außerdem verwenden wir einen biokompatiblen Pfropfen, um den SC freizulegen, was die Infektion für die chronische Bildgebung reduziert. Unsere Ergebnisse bieten eine Möglichkeit, die neuronale Kodierung visueller Informationen über ein großes Gesichtsfeld hinweg zu untersuchen.
In Kombination mit der Optogenetik kann man halbe Inputs aus verschiedenen Hirnregionen untersuchen, die die Neuroaktivität bei SC modulieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Abbildung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) wacher Mäuse bereit, wobei mittels Zweiphotonenmikroskopie die Aktivität einzelner Neuronen erfasst wird, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen erhalten bleibt, und mittels Weitfeldmikroskopie der gesamte SC bei Mäusen mit teilweisem Kortexdefekt untersucht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Bildgebende Verfahren
- Visuelle Verarbeitung
Hintergrund
- Der obere Hügel spielt eine entscheidende Rolle bei der Verarbeitung visueller Informationen.
- Das Verständnis der neuronalen Kodierung im oberen Hügel ist entscheidend, um die Mechanismen der visuellen Verarbeitung aufzuklären.
- Frühere Abbildungsmethoden können die kortikale Integrität stören und dadurch Langzeit-Aufzeichnungsstudien erschweren.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, diese Herausforderungen durch einen minimalinvasiven Ansatz für die Bildgebung zu bewältigen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für die Langzeit-Calcium-Bildgebung im SC der Maus.
- Vereinfachung der Aufzeichnung neuronaler Aktivität über den gesamten SC, ohne den Kortex zu stören.
- Verbesserung des Verständnisses darüber, wie visuelle Informationen neuronenweise im SC repräsentiert werden.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet Zwei-Photonen- und Weitfeldmikroskopietechniken.
- Wildtyp- und Mutanten-Mausmodelle werden eingesetzt, wobei ein adeno-assoziierter Virus verwendet wird, um GCaMP6m für die Kalzium-Bildgebung zu exprimieren.
- Zu den wichtigsten Methoden gehören die Implantation einer Kopfplatte, chirurgische Zugangswege zur Freilegung des SC sowie die Verwendung einer Saugglocke für die chronische Bildgebung.
- Nach der Virusinjektion wird eine Erholungsphase von drei Wochen abgewartet, bevor die Bildgebung beginnt.
- Detaillierte chirurgische Schritte gewährleisten eine minimale Schädigung des umgebenden Gewebes.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuronale Aktivität, die mit Präferenzen für Bewegungsrichtungen im SC verbunden ist.
- Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Neuronen mit ähnlichen Präferenzen zu Clustern zusammengefasst sein können, was die visuelle Signalverarbeitung über weite Bereiche hinweg beeinflusst.
- Chronische Bildgebung ist bei Erhalt der kortikalen Integrität möglich und ermöglicht fortlaufende Studien der neuronalen Dynamik.
- Die Kombination von Bilddaten mit Optogenetik erlaubt die Untersuchung modulatorischer Eingaben aus anderen Gehirnregionen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert eine robuste Methode zur Analyse der Kalziumsignalübertragung im SC und leistet damit einen bedeutenden Beitrag zum Verständnis der Mechanismen der visuellen Informationsverarbeitung.
- Die beschriebenen Bildgebungstechniken versprechen Fortschritte bei Längsschnittstudien zur neuronalen Aktivität bei wachen Tieren.
- Derartige Methoden werden die Untersuchung neuronaler Mechanismen sowie deren Auswirkungen auf visuelles Verhalten und Erkrankungen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe hochauflösender Kalzium-Bildgebung im übergeordneten Hügel des Mäuses (SC) lässt sich die neuronale Kodierung, die der visuellen Verarbeitung zugrunde liegt, direkt untersuchen und unterstützt die mechanistische Risikominderung im Stadium der Zielvalidierung. Die Fähigkeit, sowohl die Aktivität einzelner Zellen als auch ganzer Strukturen bei wachen Tieren zu erfassen, ermöglicht eine vorhersagbare Zuverlässigkeit für translationale Neurowissenschafts- und Neuropharma-Portfolios. Dieser Ansatz auf doppelter Skala stärkt frühe Entdeckungsentscheidungen und leitet die Entwicklung nachgeschalteter Assays für Ziele im visuellen System ein.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Kartierung visueller Verarbeitungsschaltkreise auf zellulärer und Netzwerkebene.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem vererbte und de-novo-neuronale Kodierung im SC unterschieden werden.
- Liefert quantitative Daten zur neuronalen Aktivität, um die Zielstruktur-Auswahl und -Validierung zu unterstützen.
- Erleichtert die hypothesengeleitete Untersuchung der Kodierung visueller Merkmale in krankheitsrelevanten Systemen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Bildgebungstechnologien zur reproduzierbaren Messung neuronaler Reaktionen.
- Liefert quantitative, skalierbare Messgrößen, die für die Wirkstoffscreening-Analysen in Modellen der Sehbahn geeignet sind.
- Ermöglicht die Standardisierung von Testbedingungen für die Vergleichbarkeit zwischen Studien und Forschungsteams.
- Unterstützt die Entwicklung robuster phänotypischer Screening-Assays für neuroaktive Verbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Messungen der neuronalen Aktivität mit translationalen Biomarkern der Sehfunktion.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckungsphase neuronaler Kodierung zur präklinischen Validierung von Interventionen am visuellen System.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Zielstrukturen entlang der Sehbahn basierend auf funktionellen In-vivo-Daten.
- Unterstützt mechanistische Untersuchungen der Schaltkreismodulation unter Verwendung der Optogenetik.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Bildgebungsprotokoll verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem es die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Signalwegen und quantitative Analysen im SC ermöglicht. Es ist darauf ausgelegt, in Studien von der Zielvalidierung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen und translationsmedizinischen Untersuchungen integriert zu werden.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die direkte Messung der neuronalen Kodierung und Pfadfunktion im Colliculus superior.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten für die Assay-Entwicklung und die Evaluierung von Substanzen.
- Analysen: Liefert datenreiche Informationen zur neuronalen Aktivität und unterstützt den statistischen Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vivo-neuronale Aktivität mit potenziellen Biomarkern für Erkrankungen des Sehsystems.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die an andere Hirnregionen und Forschungsfragen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zur visuellen Verarbeitung.
- Operationaler Wert: Standardisiert bildgebende Arbeitsabläufe hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Studien hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung bezüglich Weiterentwicklung oder Einstellung und die Kapitalnutzungseffizienz, indem bereits früh im Prozess robuste funktionelle Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets im visuellen System und unterstützt Entscheidungen zur Weiterentwicklung mit quantitativen Belegen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der In-vivo-Bildgebung, chirurgischen Vorbereitung und Datenanalyse.
- Setzt Zugang zu Zwei-Photonen- und Weitfeldmikroskopie-Plattformen sowie unterstützender Infrastruktur voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Tierbehandlung, viralen Applikation und den Bildgebungsprotokollen.
- Kann an andere Hirnregionen angepasst werden, sofern Protokollmodifikationen gemäß der Quelle erfolgen.
- Langfristige Bildstabilität und präzise Zielgenauigkeit sind praktische Aspekte bei chronischen Studien.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
