Calcium-Bildgebung von enterischen Neuronen- und Gliaaktivitäten in einem myenterischen Plexus des Dickdarms der Maus

Nehmen Sie eine Bildgebungskammer mit immobilisiertem myenterischem Plexusgewebe des Dickdarms, in dem sich ganglionäre Plexus befinden, die aus Netzwerken von enterischen Neuronen und Gliazellen bestehen.

Diese Zellen sind mit einem Kalziumindikator markiert, der bei der Kalziumbindung fluoresziert.

Stellen Sie die Kammer anschließend auf einen Fluoreszenzmikroskoptisch. Perfundieren Sie die Kammer mit einem vorgewärmten Puffer, der Inhibitoren enthält, um Muskelkontraktionen während der Bildgebung zu unterdrücken.

Identifizieren Sie mit einem Mikroskop gesunde Ganglionregionen, die eine gleichmäßige Fluoreszenz aufweisen.

Erfassen Sie Fluoreszenzbilder, um die Ausgangsaktivität zu messen und eine Referenz für den intrazellulären Kalziumspiegel zu erhalten.

Perfusionieren Sie das Gewebe mit einem Rezeptoragonisten, um neuronale Rezeptoren zu aktivieren, was einen intrazellulären Kalziumeinstrom und eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität auslöst.

Die neuronale Aktivierung stimuliert indirekt die umgebenden Gliazellen, was zu einem Kalziumeinstrom und einer anschließenden Zunahme der Fluoreszenz führt.

Nehmen Sie Zeitraffer-Fluoreszenzbilder auf, um Änderungen der Fluoreszenzintensität zu messen, die die Kalziumdynamik und die Signalaktivität sowohl in Neuronen als auch in Gliazellen im Verhältnis zu den Ausgangswerten anzeigen.

Stellen Sie während der Inkubation einen modifizierten Kreb-Puffer gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls her und fügen Sie 3 mikromolare Nicardipin und 1 mikromolare Scopolamin hinzu, um die Muskelkontraktionen während der Kalzium-2-Bildgebung zu hemmen. Positionieren Sie die Aufnahmekammer unter dem Fluoreszenzmikroskop und stellen Sie mit Hilfe eines Schwerkraftdurchflussperfusionssystems mit mehreren beheizten Spritzenbehältern eine kontinuierliche Perfusionsrate von 2 bis 3 Millilitern pro Minute des Kreb-Puffers von 37 Grad Celsius her. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden, und zwar sowohl in der Saugleitung, die mit einer Vakuumfalle verbunden ist. Bringen Sie den gewünschten Plexus unter Hellfeldbeleuchtung in den Fokus. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu überbelichten, da dies zu Photobleaching führen kann.

Untersuchen Sie die Fluorophorbeladung in den Ganglien und wählen Sie gesunde Ganglien für die Bildgebung aus. Ungesunde geschädigte Ganglien weisen Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie auf und sollten nicht für die Bildgebung verwendet werden. Sobald ein Ganglion ausgewählt ist, lenken Sie den Lichtweg zur Kamera und erhalten Sie ein Live-Bild mit einer Bilderfassungssoftware. Stellen Sie sicher, dass das Ganglion scharf ist, und stellen Sie die Bildaufnahmerate und die Belichtungszeiten ein.

Die Bilderfassungsraten und -zeiten variieren je nach den Ereignissen, die die Ermittler aufzeichnen möchten. Für die meisten Experimente werden Bilder traditionell bei 0,5 bis 1 Hertz für Gliazellen und bis zu 2 bis 10 Hertz für Neuronen aufgenommen, da gliale Kalziumtransienten nicht so schnell sind wie transiente Kalziumneuronen.

Starten Sie die Aufzeichnung und ermitteln Sie die physiologische Ausgangsaktivität des ausgewählten Ganglions in Abwesenheit von experimentellen Stimuli für 30 Sekunden. Tragen Sie dann vorgewärmte Arzneimittel von Interesse, wie z. B. Rezeptoragonisten und Antagonisten, mit dem Schwerkraftfluss-Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2 bis 3 Millilitern pro Minute gemäß einem für Ihr Medikament optimierten Protokoll auf. Stoppen Sie die Aufzeichnung und sehen Sie sich den Zeitrafferfilm des Experiments an.

Wählen Sie die Regions of Interest (ROIs) mit der entsprechenden Bildanalysesoftware sorgfältig aus.

Verwenden Sie schließlich eine geeignete Bildgebungssoftware, um die Fluoreszenzintensität der interessierenden Regionen zu normalisieren und mit dem anfänglichen Ausgangswert zu vergleichen. Änderungen der normalisierten Fluoreszenz sind direkt proportional zu Änderungen des Kalziums.