Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

Qingyue Zhang; Marc A. Kerzhnerman; Nelson Garc&#237;a-V&#225;zquez; Gergely Rona

doi:10.3791/65926

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

JoVE Journal
Biology

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JoVE Journal Biology

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

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December 22, 2023

DOI: 10.3791/65926-v

Qingyue Zhang^1,2, Marc A. Kerzhnerman^1,2, Nelson García-Vázquez^1,2,3, Gergely Rona^1,2,4,5

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,NYU Grossman School of Medicine, ²The Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center,NYU Langone Health, ³Department of Cell Biology,NYU Grossman School of Medicine, ⁴Howard Hughes Medical Institute,NYU Grossman School of Medicine, ⁵Institute of Enzymology, Centre of Excellence of the Hungarian Academy of Sciences,HUN-REN Research Centre for Natural Sciences

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study addresses the detection of single-stranded DNA foci during the G1 phase of the cell cycle, emphasizing the importance of DNA repair mechanisms. Utilizing cell cycle synchronization and RPA2 immunofluorescent staining, the method provides a robust way to visualize DNA damage across various cell cycle stages.

Key Study Components

Research Area

DNA damage response
Cell cycle synchronization
Immunofluorescent staining

Background

Importance of DNA repair in maintaining genome stability
Limitations of traditional BrdU antibody methods for single-stranded DNA detection
Need for better understanding of DNA repair in non-replicating cells

Methods Used

RPA2 immunofluorescent staining
RPE1 cells as the biological model
Cell cycle synchronization followed by hydrogen peroxide treatment

Main Results

Successful visualization of RPA2 foci in different cell cycle phases
Demonstrated increased foci formation in response to DNA damaging agents
Clear distinction from traditional BrdU methods with no observed antibody cross-reactivity

Conclusions

The study provides a novel method for visualizing single-stranded DNA foci throughout the cell cycle.
This advancement has significant implications for understanding DNA repair processes and their relevance to cancer and aging research.

Frequently Asked Questions

What is the main purpose of this study?

To develop a method for detecting single-stranded DNA foci during the G1 phase of the cell cycle.

How does this method improve upon traditional approaches?

It provides a higher signal-to-noise ratio without the limitations of antibody cross-reactivity seen with BrdU.

What biological model is used in this research?

RPE1 cells are utilized for the experiments.

What are RPA2 foci?

RPA2 foci are markers indicating the presence of single-stranded DNA during repair processes.

Why is it important to study DNA repair in non-replicating cells?

Understanding DNA repair mechanisms can illuminate pathways relevant to diseases like cancer and neurological disorders.

What treatment is used to induce DNA damage in the study?

Hydrogen peroxide is used to induce DNA damage in the cells.

What are the potential applications of this research?

The findings could inform therapeutic strategies for treating various diseases associated with DNA damage.

Das folgende Protokoll zeigt den Nachweis einzelsträngiger DNA-Foci in der G1-Phase des Zellzyklus unter Verwendung von Zellzyklussynchronisation, gefolgt von RPA2-Immunfluoreszenzfärbung.

Die Reaktion auf DNA-Schäden ist lebenslang unverzichtbar. Da die DNA ständig verschiedenen schädlichen Motoren ausgesetzt ist, führt deren mangelnde Reparatur zu Instabilität des Genoms und zu Krankheiten. Wir haben eine Methode entwickelt, die auf den biologischen Eigenschaften des RPA2 basiert, um einzelsträngige DNA-Trakte während der DNA-Reparatur in verschiedenen Zellzyklusstadien sichtbar zu machen.

Herkömmliche Methoden zum Nachweis von Einzelstrang-DNA verwenden BrdU-Antikörper. Dieser Ansatz kann für die aktive Replikation von Zellen verwendet werden. Darüber hinaus neigt dieser Antikörper dazu, mit anderen Nukleotidanaloga zu kreuzreagieren, was ihre Verwendung einschränkt.

Im Gegensatz zu BRDU hat unser Ansatz ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, wodurch er in jeder Zyklusphase einsetzbar ist. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Wirkung verschiedener DNA-Reparaturwege in verschiedenen Zellzyklusphasen und potenziell nicht replizierenden Zellen zu verstehen. Unser Protokoll bietet einen neuen Ansatz und ein neues Werkzeug zur Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde, bei denen klassische Ansätze mit BrdU begrenzt sind.

Ein umfassendes Verständnis von DNA-Reparaturprozessen könnte als therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs, Alterung und neurologischen Erkrankungen dienen. Die meisten unserer Zellen sind terminalisiert und vermehren und teilen sich daher nicht. Es ist wichtig, besser zu verstehen, wie diese Zellen verschiedene DNA-Läsionen reparieren.

Daher wird sich unser Labor hauptsächlich auf postreplikative DNA-Reparaturprozesse konzentrieren und neue Werkzeuge entwickeln, um diese zu untersuchen.

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