Name: Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Doppelt-Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen für die Zellzyklusforschung mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung multifunktionaler Proteine während der Mitose.

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Wir sind dankbar, dass Dr. Kozo Tanaka der Tohoku University, Japan für den Austausch von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin. Diese Arbeit wurde durch ein NCI Zuschuss an DV (R00CA178188) und Starthilfe von der Northwestern University unterstützt.

1. doppelter Thymidin sperren und freigeben: Reagenz Vorbereitungen
<ol><li>Machen 500 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt.</li>
	<li>Machen Sie 100 mM Lager von Thymidin in sterilem Wasser oder Store in Aliquote bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Protokoll für feste Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 1A)
<ol><li>Am Tag 1, Samen ~ 2 x 105 HeLa-Zellen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Deckglas (mit 70 % Ethanol und UV-Bestrahlung sterilisiert) und 2 mL DMEM Medium. Wachsen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>1St Thymidin Block: am 2. Tag, mischen Sie die erforderliche Menge Thymidin in frischen DMEM Medien (100 mM Lager, 2 mM Endkonzentration).</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL Thymidin-haltigen Medien auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well Platte und 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 3. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM; wachsen Sie Zellen in frisch vorgewärmte DMEM Medium für 9 h Zellen aus Block freizugeben.</li>
	<li>2Nd -Thymidin-Block: erneut hinzufügen 2 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte.</li>
	<li>Ein weiterer 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am Tag 4 aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.</li>
	<li>Verdünnte SiRNAs (Kontrolle und Cdt1) und Transfection Reagens in Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 9-10 h von der Blockierung lösen und befestigen der Zellen auf der Abdeckung rutscht mit 4 % PFA für 20 min bei RT Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>
Immunostain Zellen, nach dem permeabilizing mit 0,5 % (V/V) Reinigungsmittel für 10 min bei RT und die Zellen zweimal mit 1 X PBS für 5 min waschen.
	<ol>
<li>Sperren von Zellen mit 1 % BSA (w/V) mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT gefolgt von Behandlung von Zellen mit 50 µL Primärantikörper (Maus Anti-α-Tubulin Antikörper verdünnt 1:1, 000, Kaninchen-Anti-Zwint1-Antikörper verdünnt 1: 400 und Maus, die Anti-Phospho-ɣ H2AX bei 1: 300 verdünnt) bei 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei 37 oC.</li>
		<li>Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS dreimal, Behandlung von Zellen mit 50 µL Sekundärantikörper für jedes Cover-Glas (Alexa 488 und Rhodamine Red bei 1: 250 Verdünnungen in 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei RT</li>
		<li>Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für jeweils 5 min., Behandlung von Zellen mit DAPI (0.1µg / mL in 1 X PBS) für 5 min bei RT</li>
		<li>Legen Sie nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für 5 min, das Deckglas mit Blick auf Zellen an die entsprechenden Montage-Medien auf einer klaren mikroskopische Folie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bild der Zellen für die Immunostained Proteine mit 60 X oder 100 X 1,4 NA Plan-apochromatische DIC Öl eintauchen Ziel auf eine invertierte hochauflösende confocal Mikroskop, ausgestattet mit einer geeigneten Kamera als notwendig für die Qualität der Bilder erforderlich montiert.</li>
	<li>Abrufen von Bildern bei Raumtemperatur Z-Stapel von 0,2 µm Dicke mit Software für das Mikroskop nach Bedarf.</li>
</ol>3. Protokoll für Live Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 3A)
<ol><li>Am 1. Tag Saatgut ca. 0,5-1 x 105 HeLa-Zellen stabil mCherry-H2B und GFP-α-Tubulin (leicht variabel je nach Zelle Art und die Proteine, die sie zum Ausdruck bringen) in 35 mm unten Glasschalen mit 1,5 mL DMEM Medium ausdrücken und in eine befeuchtete wachsen Inkubator für 24 h bei 37 oC und 5 % CO2.</li>
	<li>1St Thymidin Block: am 2. Tag, fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien, um die Zellen in der Schale (100 mM Thymidin, 2 mM Endkonzentration).</li>
	<li>18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 3. Tag aspirieren Sie Thymidin-haltigem Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.</li>
	<li>Verdünnte SiRNAs (Kontroll- und Hec1) und Transfection Reagens mit Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen in 1,5 mL frisch vorgewärmte DMEM Medium für 8 h, Zellen aus Block freizugeben.</li>
	<li>2Nd -Thymidin-Block: Fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in der Schale.</li>
	<li>Ein weiterer 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 4. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM zu. Dann wachsen Zellen in frisch vorgewärmte Leibovitz ist (L-15) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 20 mM HEPES bei pH 7,0 für 8 h, Zellen aus dem Block freizugeben.</li>
	<li>Legen Sie die Schale in die Temperatur Kontrollkammer inmitten der hochauflösende confocal Mikroskop, die bereits auf mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung zur Stabilisierung der Temperaturen auf der Bühne und experimentelle gewechselt hat.</li>
	<li>Fokussieren im Hellfeld mit Objektiv 60 X bis Zellen sichtbar sind, und klicken Sie dann manuell in die Region der Wahl der auf der Bühne zu sichten.</li>
	<li>Licht und Kraft/Laserbelichtung, Erwerb Bildparameter und Dauer des Experiments mit der Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software der Wahl einrichten. Verwenden Sie Filter für GFP (488 Erregung; 385 nm Emission) und mCherry (561 nm Anregung und 385 nm Emission) Bilder zu erwerben.</li>
	<li>Führen Sie die Zeitraffer-Experiment durch gepulste Durchlicht separat zu erwerben und Fluoreszenz Bilder alle 10 Minuten für einen Zeitraum bis zu 16 h.</li>
	<li>Abrufen von Bildern zwölf 1,0 µm getrennt Z-Ebenen um 9 Uhr nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block mit Software das Mikroskop nach Bedarf.</li>
	<li>Analysieren Sie die Verfolgung einzelner Zellen für mitotischen Progression Bilder zu und schließlich montieren Sie den entsprechenden Film mit den Fidschi-Inseln/ImageJ-Source-Software.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.

Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.
Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu Tumor...

In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen - G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromatiden des doppelten Genoms sind verdichtete (Prophase) und sind an ihren Kinetochore von Mikrotubuli der montierten mitotischen Spindel (prometaphase) erfasst, das treibt ihre Ausrichtung an der Metaphase-Platte (Metaphase) gefolgt von ihrer gleich Trennung, wenn Schwester Chromatiden sind aufgeteilt in Richtung und transportiert zum gegenüberliegenden Spindel (Anaphase) Polen. Die zwei Tochterzellen sind räumlich getrennt von der Aktivität eines Actin-basierte kontraktilen Rings (Telophase und Cytokinese). Das Kinetochor ist eine spezialisierte proteinhaltige Struktur, die in der Zentromer-Region der Schwesterchromatiden montiert und dienen als Befestigung Standorte für Spindel Mikrotubuli. Seine Hauptfunktion ist zu fahren Chromosom erfassen, Ausrichtung, und Hilfe bei der Korrektur unsachgemäße Spindel Mikrotubuli Anlage, bei der Vermittlung des Spindel Baugruppe Prüfpunkt um die Treue des Chromosom Abtrennung3,4zu erhalten.
Die Technik der Zelle Synchronisation dient als ideales Werkzeug für die molekulare und strukturelle Ereignisse im Zellzyklus Fortschreiten zu verstehen. Dieser Ansatz wurde zur Zell-Populationen in bestimmten Phasen für verschiedene Arten von Analysen, einschließlich der gen-Expression profiling Analysen der zelluläre biochemische Prozesse und Erkennung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu bereichern. Synchronisierte Säugerzellen können nicht nur für das Studium der einzelnen Gen-Produkte, sondern auch für Ansätze mit Analyse der ganzer Genome Microarray Analyse des Gens Ausdruck5, MiRNA Ausdruck Muster6einschließlich verwendet werden, Translational Regelung7und Proteomic Analyse von Protein-Modifikationen-8. Synchronisation kann auch verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen der gen-Expression oder Protein Knock-down oder Knock-out- oder Chemikalien auf Zellzyklus Fortschreiten.
Zellen können in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert werden. Physikalische und chemische Methoden sind für die Zelle Synchronisation verbreitet. Die wichtigsten Kriterien für die Synchronisierung der Zelle sind, dass Synchronisation noncytotoxic und reversibel sein sollte. Wegen der potenziellen nachteiligen zellulären folgen Zellen durch pharmakologische Wirkstoffe zu synchronisieren können chemisch-abhängige Methoden für die Untersuchung wichtigen Zellzyklus Veranstaltungen vorteilhaft sein. Z. B. Hydroxyurea, Amphidicolin, Mimosine und Lovastatin, einsetzbar für Zelle Synchronisation am G1/S-Phase aber, wegen ihrer Wirkung auf die biochemischen Bahnen, die sie hemmen sie Zellzyklus Checkpoint Mechanismen zu aktivieren und töten einen wichtigen Bruchteil der Zellen9,10. Auf der anderen Seite kann Feedback-Hemmung der DNA-Replikation durch Zugabe von Thymidin, Wachstumsmedien, bekannt als "Thymidin-Block" Zellzyklus bei bestimmten Punkten11,12,13verhaften. Zellen können auch durch die Behandlung mit Nocodazole und RO-33069,14in G2/M-Phase synchronisiert werden. Nocodazole, die Montage von Mikrotubuli verhindert, hat eine relativ hohe Zytotoxizität. Darüber hinaus können Nocodazole verhaftet Zellen zurück altklug durch mitotische Schlupf interphase. Doppelte Thymidin Block Verhaftung-Zellen am G1/S-Phase und nach der Entlassung aus dem Block, sind Zellen gefunden, synchron durch G2 und in Mitose vorzugehen. Die normale Progression des Zellzyklus für Zellen befreit Thymidin-Block kann unter hochauflösenden konfokalen Mikroskopie durch Zelle Fixierung oder live Imaging beobachtet werden. Die Auswirkungen der Störung der mitotischen Proteine kann studiert werden, besonders dann, wenn Zellen eingeben und fahren Sie durch Mitose nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block. Cdt1, ein multifunktionales Protein ist beteiligt an der DNA-Replikation Herkunft Lizenzierung in der G1-Phase und ist auch während der Mitose15für Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen erforderlich. Um die Funktion des Cdt1 während der Mitose zu studieren, braucht man eine Methode zu verabschieden, die die Wirkung von seiner Erschöpfung zur Replikation Lizenzierung während der G1-Phase, während gleichzeitig bewirken seine Erschöpfung speziell in der G2/M-Phase nur vermeidet. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle basierend auf der doppelten Thymidin-Block zur Untersuchung der mitotischen Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus von festen und live-Cell Imaging.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Filiale bei 4 > C</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 mittel</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Lagern bei 4 > C</td></tr><tr><td>Serum reduziertes Medium (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Bei 4 > C</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen-Streptogramm)</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Gelöst in sterilem destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen, die GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td>exprimieren</tr><tr><td>HeLa-Zellen, die GFP-&alpha;-Tubulin exprimieren und mCherry H2B</td><td>Großzügiges Geschenk von Dr. Kozo Tanaka aus Tohoku Universität, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Giftig, erfordert Vorsicht</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Giftig, erfordert Vorsicht</td></tr><tr><td>Maus Anti-&Alpha;-Tubulin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>Sc32293</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen Ameise-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>1:400 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus Anti-Phospho-& Gamma H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, Klon JBW301</td><td>1:300 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>BioLite 6 Well Multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschale</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TiE inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td> Spinning disc <td></td><td></td></tr><tr><td>für konfokale</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>4 Wellenlängenlaser</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubationssystem für Mikroskope</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>NIS-elements Software</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von mitotische zelle synchronisation und hochauflösenden konfokalen mikroskopie zur untersuchung der rolle von multifunktionalen zelle zyklus proteine während der mitose

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.

Studie der mitotischen Progression und Mikrotubuli Stabilität in den Zellen fest nach Entlassung aus dem Thymidin-block Cdt1 engagiert sich bei der Lizenzierung der DNA-Replikation Ursprünge in der G1-Phase. Es wird abgebaut, während der S-Phase aber wieder sammelt sich im G2/M-Phase. Um ihre Rolle bei der Mitose zu untersuchen, muss der endogenen Cdt1 speziell auf die mit der am besten geeigneten Zelle Synchronisation Technik, die doppelte Thymidin Block<sup class="xr...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der doppelten Thymidin-Synchronisation und der hochauflösenden konfokalen Mikroskopie die mitotische Rolle multifunktionaler Proteine zu untersuchen, die möglicherweise kritische Interphasenfunktionen besitzen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, wie die normalen Funktionen von Proteinen, die am Zellzyklus und an der Mitose beteiligt sind, beschrieben werden können. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Zellen ihr normales physiologisches Verhalten beibehalten können und dass diese Methode auch sehr einfach durchzuführen ist.Dieses Verfahren wird von Dr. Mohammed Amin demonstriert, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, der ein Experte für die Anwendung dieser Methode ist. Für die fixierte Zellbildgebung der mitotischen Zellprogression beginnen Sie damit, etwa zweimal 10 bis fünfte HeLa-Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu säen, die ein 70 % Ethanol- und UV-sterilisiertes Deckglas und zwei Milliliter DMEM-Medium enthält. Nach 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator verstopfen Sie die Zellen mit zwei Millilitern frisch verdünntem Thymidin und frischem Medium pro Vertiefung und stellen Sie die Platte für weitere 18 Stunden wieder in den Inkubator.Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit frischem 37 Grad Celsius Medium. Bringen Sie die Zellen für neun Stunden in den Inkubator zurück, um die Zellen aus dem Block zu lösen, gefolgt von der Zugabe von weiteren zwei Millilitern Thymidin-supplementiertem Medium pro Well. Nach der zweiten Blockierungsinkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit zwei Millilitern frischem 37 Grad Celsius heißem Medium und geben Sie 100 Nanomolar frisch zubereiteter siRNA in die entsprechenden Vertiefungen.Nach neun bis 10 Stunden aspirieren Sie den Überstand und fixieren die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit vier Prozent Paraformaldehyd auf den Deckgläsern. Nach dem Waschen mit PBS permeabilisieren Sie die fixierten Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,5 % Waschmittel, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in PBS. Blockieren Sie die Zellen mit einem Prozent BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur.Dann markieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 50 Mikrolitern der primären Antikörper von Interesse. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in PBS und markieren Sie sie mit 50 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper. Waschen Sie die Zellen nach einer Stunde bei Raumtemperatur zweimal für jeweils fünf Minuten in PBS und markieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI.Folgen Sie der DAPI-Färbung mit zwei fünfminütigen Wäschen in PBS und verwenden Sie das geeignete Eindeckmedium, um die Deckgläser auf einzelne klare Objektträger zu montieren. Anschließend werden mit apochromatischen DIC-Ölimmersionsobjektiven mit 60 oder 100 x 1,4 Pixeln mit numerischem Aperturplan, die auf einem inversen, hochauflösenden konfokalen Mikroskop montiert sind, das mit einer geeigneten Kamera ausgestattet ist, Bilder der immungefärbten Proteine in Z-Stapeln mit einer Dicke von 0,2 Mikrometern aufgenommen. Für die Lebendzellbildgebung der mitotischen Zellprogression säen Sie etwa 0,5 bis eins mal 10 bis fünftel HeLa-Zellen, die mCherry H2B und GFP alpha-Tubulin stabil exprimieren, in 35-Milliliter-Glasbodenschalen aus, die 1,5 Milliliter DMEM-Medium enthalten.Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator. Dann blockiert Thymidin die Zellen zweimal, wie gerade gezeigt, diesmal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit einem Milliliter vorgewärmtem DMEM-Medium am Ende jedes Thymidin-Blocks und behandelt die Zellen nach dem ersten Block während der ersten Thymidin-Auswaschung mit siRNA. Züchten Sie die Zellen acht Stunden lang in frischem, vorgewärmtem Leibovitz-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 20 Millimolar HEPES, um die Zellen aus dem zweiten Block freizusetzen.Platzieren Sie dann die erste Platte in der temperaturgesteuerten Kammer eines hochauflösenden Konfokalmikroskops und verwenden Sie das 60-fache Objektiv und die Hellfeldbildgebung, um die Zellen in den Fokus zu bringen. Wenn die Zellen sichtbar sind, passen Sie die Plattenposition manuell an den gewünschten Bereich an und verwenden Sie die Bildaufnahmesoftware, um die Laserleistung und -belichtung, die Bildaufnahmeparameter und die Versuchsdauer einzustellen. Wählen Sie die geeigneten GFP- und mCherry-Filter aus und nehmen Sie bis zu 16 Stunden lang alle 10 Minuten gepulste Durchlicht- und Fluoreszenzbilder auf, um Zeitrafferbilder des Mitoseprozesses zu erhalten.Neun Stunden nach der Freisetzung aus dem doppelten Thymidinblock nehmen Sie die Bilder in 12 ein Mikrometer voneinander entfernten Z-Ebenen auf. Analysieren Sie dann die Bilder, indem Sie einzelne mitotische Zellen verfolgen und verwenden Sie die entsprechende Quellsoftware, um einen entsprechenden Film zusammenzustellen. Obwohl sich die meisten Kontroll- und Cdt1-siRNA-Zellen neun Stunden nach der Freisetzung aus dem Doppel-Thymidin-Block im Metaphasenstadium befinden, zeigt die Fixierung nach 10 Stunden, dass die meisten der mit Cdt1 siRNA behandelten Zellen in der späten Prometaphase immer noch arretiert sind, während die Kontrollzellen in die Anaphase eintreten und ihre Chromosomen wie erwartet segregieren.Die Kältebehandlung neun Stunden nach der Freisetzung aus dem doppelten Thymidinblock erleichtert die Beibehaltung stabiler Kinetochor-Mikrotubuli, die in Cdt1-depletierten Zellen im Vergleich zu denen in kontrolldepletierten Zellen relativ weniger robust sind. Die Lizenzierung des DNA-Replikationsursprungs ist in Cdt1- oder kontrolldepletierten Zellen während der G2-M-Phase nicht gestört, da bei diesen Zellen in der nachfolgenden G2-Phase keine Akkumulation von phosphoralisiertem gamma H2AX, einem Marker für DNA-Schäden, festgestellt wurde. Die Cdt1-siRNA-Transfektion von asynchronen Kulturen induziert jedoch die Akkumulation von phospho gamma H2AX-positiven Herden, möglicherweise aufgrund der DNA-Schäden, die durch eine unsachgemäße DNA-Replikationslizenzierung induziert werden.Nach dem Zusammenbruch der Kernhülle treten normale Zellen in die Mitose ein und durchlaufen den Beginn der Anaphase, um die Mitose innerhalb von etwa 30 bis 60 Minuten zu verlassen. Der RNAi-vermittelte Knockdown von Hec1, einem wichtigen Kinetochorprotein, das für die robuste Bildung von Kinetochor-Mikrotubuli-Attachments benötigt wird, verzögert jedoch die normale mitotische Progression zum Beginn der Anaphase oder zum Austritt aus der Mitose selbst nach mehrstündiger Mitoseverzögerung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Während Sie den Eingriff versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Thymidin vollständig aufzulösen, nachdem Sie es aus dem Gefrierschrank aufgetaut haben. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Western Blotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Expressionsmuster von Proteinen von Interesse während der Mitose im Vergleich zur Interphase sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Krebsbiogenese in menschlichen Zellkulturmodellen zu erforschen und mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie die zellzyklusbezogenen Funktionen von Proteinen von Interesse zu identifizieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

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