Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der doppelten Thymidin-Synchronisation und der hochauflösenden konfokalen Mikroskopie die mitotische Rolle multifunktionaler Proteine zu untersuchen, die möglicherweise kritische Interphasenfunktionen besitzen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, wie die normalen Funktionen von Proteinen, die am Zellzyklus und an der Mitose beteiligt sind, beschrieben werden können. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Zellen ihr normales physiologisches Verhalten beibehalten können und dass diese Methode auch sehr einfach durchzuführen ist.

Dieses Verfahren wird von Dr. Mohammed Amin demonstriert, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, der ein Experte für die Anwendung dieser Methode ist. Für die fixierte Zellbildgebung der mitotischen Zellprogression beginnen Sie damit, etwa zweimal 10 bis fünfte HeLa-Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu säen, die ein 70 % Ethanol- und UV-sterilisiertes Deckglas und zwei Milliliter DMEM-Medium enthält. Nach 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator verstopfen Sie die Zellen mit zwei Millilitern frisch verdünntem Thymidin und frischem Medium pro Vertiefung und stellen Sie die Platte für weitere 18 Stunden wieder in den Inkubator.

Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit frischem 37 Grad Celsius Medium. Bringen Sie die Zellen für neun Stunden in den Inkubator zurück, um die Zellen aus dem Block zu lösen, gefolgt von der Zugabe von weiteren zwei Millilitern Thymidin-supplementiertem Medium pro Well. Nach der zweiten Blockierungsinkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit zwei Millilitern frischem 37 Grad Celsius heißem Medium und geben Sie 100 Nanomolar frisch zubereiteter siRNA in die entsprechenden Vertiefungen.

Nach neun bis 10 Stunden aspirieren Sie den Überstand und fixieren die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit vier Prozent Paraformaldehyd auf den Deckgläsern. Nach dem Waschen mit PBS permeabilisieren Sie die fixierten Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,5 % Waschmittel, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in PBS. Blockieren Sie die Zellen mit einem Prozent BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Dann markieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 50 Mikrolitern der primären Antikörper von Interesse. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in PBS und markieren Sie sie mit 50 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper. Waschen Sie die Zellen nach einer Stunde bei Raumtemperatur zweimal für jeweils fünf Minuten in PBS und markieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI.

Folgen Sie der DAPI-Färbung mit zwei fünfminütigen Wäschen in PBS und verwenden Sie das geeignete Eindeckmedium, um die Deckgläser auf einzelne klare Objektträger zu montieren. Anschließend werden mit apochromatischen DIC-Ölimmersionsobjektiven mit 60 oder 100 x 1,4 Pixeln mit numerischem Aperturplan, die auf einem inversen, hochauflösenden konfokalen Mikroskop montiert sind, das mit einer geeigneten Kamera ausgestattet ist, Bilder der immungefärbten Proteine in Z-Stapeln mit einer Dicke von 0,2 Mikrometern aufgenommen. Für die Lebendzellbildgebung der mitotischen Zellprogression säen Sie etwa 0,5 bis eins mal 10 bis fünftel HeLa-Zellen, die mCherry H2B und GFP alpha-Tubulin stabil exprimieren, in 35-Milliliter-Glasbodenschalen aus, die 1,5 Milliliter DMEM-Medium enthalten.

Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator. Dann blockiert Thymidin die Zellen zweimal, wie gerade gezeigt, diesmal mit zwei Millilitern PBS und einmal mit einem Milliliter vorgewärmtem DMEM-Medium am Ende jedes Thymidin-Blocks und behandelt die Zellen nach dem ersten Block während der ersten Thymidin-Auswaschung mit siRNA. Züchten Sie die Zellen acht Stunden lang in frischem, vorgewärmtem Leibovitz-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 20 Millimolar HEPES, um die Zellen aus dem zweiten Block freizusetzen.

Platzieren Sie dann die erste Platte in der temperaturgesteuerten Kammer eines hochauflösenden Konfokalmikroskops und verwenden Sie das 60-fache Objektiv und die Hellfeldbildgebung, um die Zellen in den Fokus zu bringen. Wenn die Zellen sichtbar sind, passen Sie die Plattenposition manuell an den gewünschten Bereich an und verwenden Sie die Bildaufnahmesoftware, um die Laserleistung und -belichtung, die Bildaufnahmeparameter und die Versuchsdauer einzustellen. Wählen Sie die geeigneten GFP- und mCherry-Filter aus und nehmen Sie bis zu 16 Stunden lang alle 10 Minuten gepulste Durchlicht- und Fluoreszenzbilder auf, um Zeitrafferbilder des Mitoseprozesses zu erhalten.

Neun Stunden nach der Freisetzung aus dem doppelten Thymidinblock nehmen Sie die Bilder in 12 ein Mikrometer voneinander entfernten Z-Ebenen auf. Analysieren Sie dann die Bilder, indem Sie einzelne mitotische Zellen verfolgen und verwenden Sie die entsprechende Quellsoftware, um einen entsprechenden Film zusammenzustellen. Obwohl sich die meisten Kontroll- und Cdt1-siRNA-Zellen neun Stunden nach der Freisetzung aus dem Doppel-Thymidin-Block im Metaphasenstadium befinden, zeigt die Fixierung nach 10 Stunden, dass die meisten der mit Cdt1 siRNA behandelten Zellen in der späten Prometaphase immer noch arretiert sind, während die Kontrollzellen in die Anaphase eintreten und ihre Chromosomen wie erwartet segregieren.

Die Kältebehandlung neun Stunden nach der Freisetzung aus dem doppelten Thymidinblock erleichtert die Beibehaltung stabiler Kinetochor-Mikrotubuli, die in Cdt1-depletierten Zellen im Vergleich zu denen in kontrolldepletierten Zellen relativ weniger robust sind. Die Lizenzierung des DNA-Replikationsursprungs ist in Cdt1- oder kontrolldepletierten Zellen während der G2-M-Phase nicht gestört, da bei diesen Zellen in der nachfolgenden G2-Phase keine Akkumulation von phosphoralisiertem gamma H2AX, einem Marker für DNA-Schäden, festgestellt wurde. Die Cdt1-siRNA-Transfektion von asynchronen Kulturen induziert jedoch die Akkumulation von phospho gamma H2AX-positiven Herden, möglicherweise aufgrund der DNA-Schäden, die durch eine unsachgemäße DNA-Replikationslizenzierung induziert werden.

Nach dem Zusammenbruch der Kernhülle treten normale Zellen in die Mitose ein und durchlaufen den Beginn der Anaphase, um die Mitose innerhalb von etwa 30 bis 60 Minuten zu verlassen. Der RNAi-vermittelte Knockdown von Hec1, einem wichtigen Kinetochorprotein, das für die robuste Bildung von Kinetochor-Mikrotubuli-Attachments benötigt wird, verzögert jedoch die normale mitotische Progression zum Beginn der Anaphase oder zum Austritt aus der Mitose selbst nach mehrstündiger Mitoseverzögerung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Während Sie den Eingriff versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Thymidin vollständig aufzulösen, nachdem Sie es aus dem Gefrierschrank aufgetaut haben. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Western Blotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Expressionsmuster von Proteinen von Interesse während der Mitose im Vergleich zur Interphase sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Krebsbiogenese in menschlichen Zellkulturmodellen zu erforschen und mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie die zellzyklusbezogenen Funktionen von Proteinen von Interesse zu identifizieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.