Name: Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Fluoreszenzmikroskopie optimieren, um den axonalen Transport endogener Fracht in lebenden Caenorhabditis elegans zu visualisieren. Diese Methode ermöglicht präzisere Beobachtungen neuronaler Dynamiken.

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<meta charset="utf8"></head><body>Verbesserung der axonalen Transportanalyse in lebenden C. elegans mit GFP-markiertem RAB-3

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
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<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
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<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (22 mm x 22 mm, Nr. 1); Gold Seal Cover Glas</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop: Nikon Ti2 inverses Mikroskop, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS Kamera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA Öl-Immersionsobjektiv, Nikon Photostimulationsscanner bei 488nm mit ET525/36 Emissionsfilter</td><td>Nikon</td><td></td><td>Spinning Disc Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software für die Nikon Ti2&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Nematode strain</td><td>Identifier</td><td>Source</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>Wird bei CGC (https://cgc.umn.edu/) hinterlegt</td></tr></tbody></table>

optimierung der visualisierung des axonalen transports endogener fracht durch fluoreszenzmikroskopie bei lebenden caenorhabditis elegans

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Überblick über das Modellsystem und das Messverfahren Um den axonalen Transport von synaptischen Vesikelvorläufern sichtbar zu machen, verfolgten wir endogen GFP-markiertes RAB-3. Hier verwenden wir einen kürzlich generierten GFP::Flip-on::RAB-3 Stamm6, in dem die Expression der Rekombinase Flippase unter einem zellspezifischen Promotor (glr-4p) endogenes RAB-3 im Motoneuron DA9 markiert. DA9 ist ein bipolares Motoneuron, dessen Zellkörper sich im hinteren Teil des Tieres auf der ventralen Seite in der Nähe des Anus befindet (Abbildung 1A). Es enthält einen kurzen Dendriten, der anterior entlang des ventralen Nervenstrangs verläuft, und ein langes Axon, das nach posterior verläuft, eine Kommissur bildet und dann anterior entlang des dorsalen Nervenstrangs verläuft, wo es en passant Synapsen bildet, die den dorsalen Muskel und das VD-Neuroninnervieren 22,23,24. Wir visualisieren den axonalen Transport in der asynaptischen Region; Die meisten Transportereignisse können mit einer einzigen Fokusebene erfasst werden (Abbildung 1A). Ein erster Photobleichschritt wird durchgeführt, um den Hintergrund der stationären Vesikel in diesem Bereich zu reduzieren, die oft dazu neigen, in diesem Bereich zu pausieren (Abbildung 1B). Zeitraffervideos werden über 3 Minuten aufgezeichnet und das RAB-3-Signal entlang der asynaptischen Region wird in einen Kymographen eingetragen, um einzelne Transportereignisse zu extrahieren (Abbildung 1C).
Anpassung des Erfassungsparameters zur Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports Um die geringe Signalintensität vieler endogen fluoreszierender markierter Proteine zu überwinden, müssen die Erfassungsparameter des Mikroskops optimiert werden. Für eine robuste Quantifizierung von Transportereignissen muss die Signalintensität einzelner Transportereignisse über dem zytoplasmatischen Hintergrund oder der pausierenden, stationären Fracht so hell wie möglich sein. Synaptische Vesikelvorläufer pausieren oft in der asynaptischen Region in unterschiedlichen Vesikelpools, was die Detektion neuer ankommender Vesikel stört und es schwierig macht, ihre Transportspuren zu verfolgen7.
Ein einziger anfänglicher Fluoreszenzbleichschritt kann das Fluoreszenzsignal, das von den Vesikelpools ausgeht, stark reduzieren, um die Bewegungserkennung neuer eingehender Vesikel zu verbessern (Abbildung 2A). Der Bleichschritt verstärkte das Signal der Bewegung von RAB-3-Vesikeln über die zytoplasmatische Hintergrundintensität nur geringfügig, wahrscheinlich weil der zytoplasmatische Anteil von RAB-3 sehr gering ist (Abbildung 2D).
Die Verwendung von Binning bietet eine zusätzliche Schicht, um das Signal über den Hintergrund einzelner Transportereignisse zu verbessern, indem ein Array von Pixeln zu einem einzigen Pixel kombiniert wird. Ein 2 x 2 Binning halbiert die räumliche Auflösung (hier von 108,33 nm/Pixel auf 216,7 nm/Pixel), was immer noch ausreicht, um einzelne RAB-3-Transportpartikel zu verfolgen (Abbildung 2B), aber die Signalintensität einzelner Vesikel stark verbessert (Abbildung 2D). Sofern keine sehr hohe räumliche Auflösung erforderlich ist, kann Binning auch zur Visualisierung vieler anderer axonaler Frachten angewendet werden.
Als nächstes fragten wir, wie Änderungen in der Expositionszeit die Signalintensität einzelner Transportereignisse verbessern können. Wir haben insbesondere die Expositionszeit in die Analyse einbezogen, um auch zu zeigen, dass eine Expositionszeit von bis zu 500 ms mit 700 ms zwischen den nachfolgenden Bildgebungszeitpunkten immer noch eine zeitliche Auflösung bietet, bei der synaptische Vesikelvorläufer verfolgt werden können (Abbildung 2C,D).
Generierung und Analyse von Kymographen mit Fidschi Um einen Kymographen zu generieren und einzelne Transportereignisse zu analysieren, führen Sie die Schritte in Abbildung 3 aus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über das Modellsystem zur Visualisierung des axonalen Transports von endogen fluoreszierendem RAB-3. (A) Oberes Bild: Überblick über den Fadenwurm mit angedeuteter posterior-anteriorer und ventral-dorsaler Achse. Das Motoneuron DA9 ist blau markiert. Mittleres Fenster: Vergrößern Sie den im oberen Bereich gezeigten Boxed-Bereich mit angezeigter DA9-Kompartimentierung. En passant Synapsen sind grün dargestellt, * zeigt den Anus an. Beachten Sie, dass sich das Axon im dorsalen Nervenstrang fortsetzt, bis es die Vulva passiert. Das rote Feld zeigt den Bereich der aynaptischen Zone an. Unteres Bild: Konfokale Mikroskopieaufnahme von endogenem GFP, markiert RAB-3 im proximalen Axon in einer einzigen Fokusebene. Beachten Sie, dass es Vesikelsenken mit länger pausierendem RAB-3 im asymmetrischen Bereich gibt, obwohl die meisten RAB-3-Signalcluster im synaptischen Bereich vorhanden sind. Die asynaptische Region ist rot umrandet. Maßstab: 20 μm. (B) Repräsentative Bilder einer Zeitrafferaufnahme zur Visualisierung des axonalen Transports. Um die Rückverfolgbarkeit einzelner Transportteilchen über stationäre Partikel zu verbessern, wird der asymmetrische Bereich zunächst photogebleicht. Die unteren Felder im violetten Bereich zeigen ein Beispiel für ein anterogrades (orangefarbene Pfeilspitze) und ein retrogrades (blaue Pfeilspitze) Bewegungsereignis. Die Felder von oben nach unten stellen aufeinanderfolgende Zeitpunkte dar. (C) Die Zeitrafferaufnahme in (B) wurde als Kymograph aufgezeichnet (2D-Darstellung der Zeit über der Position). Diagonale Linien stellen Bewegungsereignisse dar, bei denen die Steigung die Geschwindigkeit angibt. Vertikale Linien zeigen stationäre Ereignisse. Das violette Feld ist ein Vergrößern des Kymographen, um die Transportereignisse hervorzuheben, die auch in (B) dargestellt sind, und die anterograden (orange) und retrograden (blau) Transportereignisse werden verfolgt. Gestrichelte vertikale Linien zeigen die pausierenden Ereignisse an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Abbildung 2: Optimierung von Erfassungsschritten und -parametern zur Verbesserung der Visualisierung der endogenen axonalen Fracht. Endogene GFP::RAB-3 wurden in der aynaptischen Zone des DA9-Axons sichtbar gemacht, indem Bilder einer einzelnen Fokusebene auf einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop aufgenommen wurden. Es wurden Kymographen erworben, um einzelne Transportereignisse in anterograder (von rechts nach links) und retrograder (von links nach rechts) Richtung (A-C) sichtbar zu machen. (A) Kymographen zeigen RAB3-Transportereignisse ohne (linke Kymographen) oder mit integriertem Bleichschritt. Beachten Sie, dass der Bleichschritt die Visualisierung von Pausierungsereignissen (gekennzeichnet durch gelbe Pfeilspitzen) zwischen aufeinanderfolgenden Transportereignissen (orangefarbene Pfeilspitzen) verbessert. (B) Die Implementierung von 2 x 2 Binning trägt dazu bei, die Signalintensität von schwachen RAB3-Transportereignissen zu verbessern. Die Bilder wurden bei einer Belichtungszeit von 300 ms aufgenommen und tragen mit (C) einer schrittweisen Erhöhung der Belichtungszeit (von 100 ms ganz links auf 500 ms ganz rechts) dazu bei, die Signalintensität einzelner Transportereignisse zu verbessern. Die Bilder wurden mit 2 x 2 Binning und unter Verwendung eines ersten Photobleaching-Schritts aufgenommen. Alle Kymographen zeigen eine Gesamtdauer von 3 min an und sind im gleichen Maßstab gezeichnet, so dass Kymographen mit weniger Erfassungszeitpunkten aufgrund eines längeren Zeitraffers zwischen aufeinanderfolgenden Bildpunkten eine kürzere Gesamtlänge des Kymographen aufweisen. (D) Quantifizierung der Signalintensität pro Transportereignis nach Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz von Kymographen in (A-C). Beachten Sie, dass das Binning und der Photobleichschritt bei einer Belichtungszeit von 300 ms aufgenommen wurden. Statistischer Vergleich mit n Ereignissen für 100 ms (nEreignisse = 27 in nTieren = 2), 200 ms (nEreignisse = 30 in nTieren = 2), 300 ms (nEreignisse = 88 in nTieren = 6), 500 ms (nEreignisse = 12 in nTieren = 1), 300 ms ohne (w.o.) Binning (nEreignisse = 31 in nTieren = 3), 300 ms mit (w) Binning (nEreignisse = 88 in nTieren = 6) und 300 ms, 2 x 2 Binning mit Bleiche (nEreignisse = 88 bei nTieren = 6) und ohne Bleichen. Jeder Datenpunkt repräsentiert die Signalintensität eines einzelnen RAB-3-Transportereignisses nach der Subtraktion des Hintergrunds (Zytoplasma des Axons) zu einem einzigen Zeitpunkt entlang seiner Spur, der zufällig ausgewählt wurde. Die Belichtungszeit wurde mit einem Kruskal-Wallis-Test verglichen, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleich, Binning und Photobleaching wurden mit einem paarweisen Mann-Whitney-Test verglichen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise zur Erstellung eines Kymographen und zur Messung einzelner Transportereignisse . (A) Nach dem Laden der Videoaufzeichnung nach Fidschi wird das segmentierte Linienwerkzeug verwendet, um eine Linie entlang der Länge des zu analysierenden axonalen Segments zu verfolgen. (B) Ein Kymograph (rechtes Fenster) wird mit dem Kymoreslicewide-Plugin mit den im linken Feld dargestellten Parametern generiert. (C) Einzelne Transportereignisse werden mit dem Linearlinienwerkzeug nachverfolgt und im ROI-Manager gespeichert. Im rechten Bereich werden die Messeinstellungen angezeigt, die zum Generieren der Ergebnistabelle verwendet werden. (D) Die Ergebnisse in der Tabelle werden zur Berechnung der Transportparameter verwendet. Kästchen zeigen wichtige Parameter an, die im Abschnitt "Methoden" des Protokolls beschrieben werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

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Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Intrazellulärer Transport von Frachten, wie Vesikeln oder Organellen, wird von molekularen Motorproteinen durchgeführt, die auf polarisierten Mikrotubuli verfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Korrelation der Transportrichtung einzelner Frachtpartikel, die sich innerhalb von Neuronen bewegen, mit der relativen Menge und Art der assoziierten Motorproteine.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Diese Studie skizziert quantitative Messungen der synaptischen Größe und Lokalisation, Muskelmorphologie und mitochondrialen Form in C. elegans mit frei verfügbaren Bildverarbeitungswerkzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht es zukünftigen Studien in C. elegans, das Ausmaß der strukturellen Veränderungen von Gewebe und Organellen infolge genetischer Mutationen quantitativ zu vergleichen.

Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz für die Abbildung der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben von C. elegans während des Alterns.

Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

Erfahren Sie, wie Sie die Fluoreszenzmikroskopie optimieren, um den axonalen Transport endogener Fracht in lebenden Caenorhabditis elegans zu visualisieren. Diese Methode ermöglicht präzisere Beobachtungen neuronaler Dynamiken.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

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