Computergestützte Vorhersage der Aminosäurepräferenzen potenziell multispezifischer Peptidbindungsdomänen, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind

Wir schlagen ein Protokoll zur rechnergestützten Vorhersage von Aminosäurepräferenzen in spezifischeren Protein-Protein-Wechselwirkungen vor. Dieses Protokoll kann als ein erster Schritt bei der Gestaltung von Vermittlern dieser Wechselwirkungen angesehen werden. Wir sind daran interessiert, diese Mediatoren als potenzielle Inhibitoren für spezifische Wechselwirkungen zu verwenden, in der Immunologietechnologe.

Unsere Implementierer, die zur Charakterisierung der Aminosäurepräferenzen unter den spezifischen Bindungsstellen verwendet werden, sind teuer und umständlich. Unser Protokoll ist eine biogestützte Technologie, die auf Effizienz und Serienbetrieb basiert. Diese Strategie hat das Potenzial, eine große Anzahl von Liniensequenzen zu verarbeiten, was zu einer vollständigen und konsistenten Differenz der Aminosäurepräferenzen führt.

Unser Protokoll bietet eine professionelle Kosteneffizienz, indem es eine große Anzahl von DNA-Sequenzen verarbeitet, die gegenüber einer vollständigeren aus der typischerweise begrenzten Anzahl von Sequenzen bevorzugt werden, Prozesse in Web-Labor-Ansätzen. Neben der Entwicklung von Inhibitoren immunologischer Produkte möchten wir die Leistungsfähigkeit dieser Methodik mit anderen Produktfamilien vergleichen. Dies wird es uns ermöglichen, die strukturelle Grundlage für Multispezifität besser zu verstehen, nicht nur im immunologischen Kontext, sondern auch in anderen zellulären Funktionen, wie z.B. Signalübertragung und Kommunikation.

Beginnen Sie mit dem Herunterladen der Struktur des Protein-Protein-Komplexes. Navigieren Sie dazu auf die Startseite der Proteindatenbank und geben Sie die PDB-ID in das Hauptsuchfeld ein. Klicken Sie auf der Hauptseite der Struktur auf Dateien herunterladen und dann auf Biologische Anordnung 1, um die Dateien im PDB gz-Format herunterzuladen.

Öffnen Sie die heruntergeladene Struktur in UCSF Chimera. Navigieren Sie zu Tools, dann zu Strukturbearbeitung und klicken Sie auf Change Chain IDs. Benennen Sie die zweite Kette, die ursprünglich als A gekennzeichnet war, in B um.Klicken Sie dann auf Favoriten und dann auf Modellgruppe.

Wählen Sie das Modell mit den beiden Ketten aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Gruppieren/Gruppieren aufheben, um jede Kette in ein anderes Modell zu unterteilen. Wählen Sie als Nächstes die beiden Modelle aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Kopieren/Kombinieren. Geben Sie einen neuen Namen für das kombinierte Modell ein.

Aktivieren Sie Quellmodelle schließen, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Auswählen, dann auf Verketten und bestätigen Sie, dass die Ketten im Dimer nun als A und B identifiziert sind.Klicken Sie auf Datei und PDB speichern, um die bearbeitete Struktur als neue PDB-Datei zu speichern. Um das Zielsegment im Ligandenprotein zu identifizieren, navigieren Sie zum BUDE Alanine Scan Server. Klicken Sie unter Struktur-Upload auf die Schaltfläche Datei auswählen und laden Sie die gespeicherte PDB-Datei hoch.

Überprüfen Sie auf der nächsten Seite, ob die Struktur korrekt geladen wurde, und geben Sie einen Namen für den Job auf dem Server ein. Legen Sie die Ketten A als Rezeptor und B als Liganden fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten, um den Auftrag zu senden. Sobald der Job abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen, um die Ergebnisseite zu öffnen.

Wählen Sie in der Liste Rückstand die Restdehnung aus, die voraussichtlich besser mit der Zielbindungsoberfläche interagieren wird. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde ein Aminosäuresegment vorhergesagt, das mit der IRF5-Bindungsoberfläche interagiert. Mit Hilfe der computergestützten Alanin-Scanning-Mutagenese wurde ein 13-Aminosäure-Segment von den Positionen 424 bis 436 vorhergesagt, wobei das p L x IS-Motiv bei Arginin 432 begann.

Bereiten Sie zunächst die Protein-Peptid-Grenzfläche für die Sequenzdiversifizierung vor. Öffnen Sie die PDB-Datei in Chimera und stellen Sie sicher, dass die Struktur der Zieluntereinheiten intakt ist und keine Atome oder Bindungen fehlen. Um alle nicht-essentiellen Moleküle aus der Struktur zu entfernen, klicken Sie auf Auswählen, dann auf Rückstände und wählen Sie dann alle Moleküle außer Standardaminosäuren aus.

Klicken Sie dann auf Aktionen gefolgt von Adams/Bonds und löschen. Klicken Sie dann in der Reihenfolge auf Favoriten und dann auf die Kette, die als Ligand betrachtet wird. Schneiden Sie die Ligandenkette auf das identifizierte interagierende Segment zu, indem Sie alle Rückstände mit Ausnahme derjenigen zwischen den ausgewählten Positionen löschen.

Klicken Sie auf Datei und PDB speichern, um die bearbeitete Struktur in einer anderen PDB-Datei zu speichern. Kopieren Sie diese Datei an einen Linux-Speicherort, auf den die Rosetta-Anwendungen zugreifen können. Verwenden Sie die fixedbb-Anwendung von Rosetta, um ein Repack aller Aminosäure-Seitenketten der Basenstruktur vor der Sequenzdiversifizierung durchzuführen, indem Sie diesen Befehl ausführen.

Benennen Sie dann die PDB-Datei repack mit dem Suffix _ repack um, indem Sie den folgenden Befehl verwenden. Führen Sie als Nächstes pepspec im Entwurfsmodus aus, um mit diesem Befehl eine Sequenzdiversifizierung durchzuführen. Generieren Sie dann ein PWM mit dem gen pepspec pwm.

py-Skript, das in der Rosetta-Suite enthalten ist. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um dieses Skript auszuführen. Um ein Sequenzlogo zu erstellen, öffnen Sie die Datei mit den im vorherigen Schritt generierten Peptidsequenzen mit einem bevorzugten Texteditor und kopieren Sie alle Sequenzen.

Navigieren Sie zum WebLogo-Server, und fügen Sie die Sequenzen in das Textfeld Multiple Sequence Alignment ein. Wählen Sie das gewünschte Format und die gewünschte Größe des Logos entsprechend der Eingabelänge und klicken Sie auf Logo erstellen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden die Aminosäurepräferenzen für das konservierte p L x IS-Motiv in der IRF5-Bindungsoberfläche vorhergesagt.

Position, Gewichtsmatrix und Sequenzlogo, die bei der Sequenzdiversifizierung erzeugt wurden, zeigten eine Präferenz für Glutamat an Position 432 und für Leucin und Isoleucin an den Positionen 433 und 435. Die Positionen 427, 429 und 436, die typischerweise von Serin besetzt sind, zeigten eine höhere Präferenz für Aspartat und Glutamat, was die Rolle der Phosphorylierung und der IRF5-Dimerisierung unterstreicht. Position 425 zeigte eine hohe Präferenz für Serin, was darauf hindeutet, dass es in seiner unphosphorylierten Form an der Protein-Protein-Interaktion beteiligt ist.