Name: Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die hochauflösende 3D-Ganzorgantomographie zur Untersuchung mikrobieller Infektionen. Diese Methode ermöglicht die ortsspezifische Detektion einzelner Salmonella-Zellen in infizierten Mausgeweben während Antibiotikatherapien.

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Verfolgung von Krankheitserregern im ganzen Organ durch Quantifizierung von fluoreszierenden Reportern

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<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der lokale Gewebekontext bakterieller Krankheitserreger ist entscheidend für die Bestimmung lokaler Wirtsangriffe, bakterieller Anpassungen, des lokalen Ergebnisses der Wirtserreger-Interaktionen und der antimikrobiellen Chemotherapie sowie der individuellen Beiträge zum Gesamtergebnis der Erkrankung. Die Abbildung von mikrometergroßen Bakterien in zentimetergroßen Organen war eine Herausforderung. Die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STP) bietet eine ausreichende räumliche Auflösung zum Nachweis einzelner Bakterienzellen in ganzen Organen, automatisierte Schnitte und Bildgebung sowie einen ausreichenden Durchsatz (~1 Organ pro Tag)11. Während Wirtsantigene in vivo gefärbt werden können, sollten Erregerzellen geeignete fluoreszierende Proteine exprimieren, um einen umfassenden Nachweis intrazellulärer Erregerzellen zu gewährleisten. Die daraus resultierenden Datensätze (0,5-1,5 TeraByte pro Organ) stellen IT-Infrastrukturen zur Datenanalyse und -speicherung vor erhebliche Herausforderungen.
Diese Methode umfasst mehrere kritische Schritte. Zunächst wird ein Erregerstamm mit nachweisbarer und homogener Expression des fluoreszierenden Proteins GFP oder YFP benötigt. Idealerweise wird eine chromosomale Expressionskassette25 verwendet, um die Fluoreszenzheterogenität aufgrund von Variation der Plasmidkopienzahl zu minimieren. Eine ausreichende Fluoreszenzintensität ist erforderlich, aber übermäßige Mengen an fluoreszierendem Protein sollten vermieden werden, um Fitnessbeeinträchtigungen des Erregerszu vermeiden 23. Geeignete Expressionsniveaus können durch Auswahl eines geeigneten Promotors und Feinabstimmung der ribosomalen Bindungsstelle25 oder der gesamten 5'-untranslatierten Region (UTR)26 erreicht werden. Zweitens sollte die Perfusionsfixierung eine erste Reinigung mit Puffer beinhalten, um so viele Erythrozyten wie möglich aus dem Blutkreislauf zu entfernen. Dies ist besonders kritisch für Milz und Leber (obwohl eine vollständige Entfernung von Erythrozyten aus diesen Organen schwierig ist). Verbleibende Erythrozyten absorbieren Licht im sichtbaren Teil des Spektrums und beeinträchtigen die Bildqualität27. Drittens ist die Lagerung des fixierten Gewebes im Kryoprotektivum entscheidend, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu reduzieren, die bei entzündeten Geweben besonders hoch ist und die vergleichsweise schwache Fluoreszenz der Erregerzellen überschatten kann11. Viertens ist die effektive Vernetzung des Gewebes mit dem umgebenden Agaroseblock entscheidend für ein reibungsloses Vibratomschneiden, ohne dass das Gewebe aus dem Agaroseblock herausspringt. Fünftens müssen Fluoreszenzsignale und ihre Identifizierung als Erregerzellen unabhängig verifiziert werden, indem orthogonale Ansätze wie die Färbung mit Antikörpern gegen Erregerkomponenten (z. B. Lipopolysaccharid für gramnegative Bakterien) und die konfokale Mikroskopie der vom Tomographen entnommenen Schnitte11 verwendet werden. Einige infizierte Gewebe enthalten autofluoreszierende Partikel mit ähnlicher Form und überlappenden Fluoreszenzspektren, die leicht als Krankheitserregerzellen fehlinterpretiert werden können. Sechstens sollte die Menge der Erregerzellen innerhalb von Mikrokolonien mit orthogonalen Ansätzen wie der konfokalen Mikroskopie verglichen werden, um die Genauigkeit zu beurteilen. Die auf diesen Berechnungen basierende bakterielle Gesamtbelastung sollte durch Vergleich mit orthogonalen Ansätzen wie Durchflusszytometrie und Plattierung verifiziert werden.
Zu den wichtigen Modifikationen des weit verbreiteten STP-Protokolls gehört die Platzierung eines Schmalbandfilters 510/20 nm vor dem Photomultiplier 211, um die Interferenz der grün-gelben Autofluoreszenz zu reduzieren, die bei infizierter und entzündeter Leber, Milz und Peyer-Pflastern besonders stark ist. Die starke Autofluoreszenz und die erhöhte Lichtstreuung solcher Organe im Vergleich zum Gehirn (die andere Anwendungen von STP dominiert) erzeugen auch einen Bedarf an einer effektiveren Korrektur für ungleichmäßige Beleuchtung. Als weitere Modifikation verwendet dieses Protokoll zu diesem Zweck den CIDRE-Ansatz22 (Abbildung 3) und die KI-basierte Segmentierung von Bakterien. Schließlich wurde die Gewebevorbehandlung verändert, indem ein Inkubationsschritt in einem Kryoprotektivum bei -20 °C eingeschlossen wurde, der die Gewebeautofluoreszenz reduziert und somit den Nachweis kleiner Erregerzellen mit relativ schwacher Fluoreszenz erleichtert11.
Eine Fehlerbehebung kann erforderlich sein, wenn keine Erregersignale erkannt werden können oder die Segmentierung zu einer unzureichenden Sensitivität (zu viele Erregerzellen werden übersehen) oder zu einer unzureichenden Präzision (zu viele Hintergrundpartikel werden als Erregerzellen segmentiert) führt. Wenn die Autofluoreszenz des Hintergrundgewebes nachweisbar ist, aber zu wenige Erregersignale vorhanden sind, könnten die Erreger zu wenig fluoreszierende Proteine enthalten. Dies kann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie von Gewebeschnitten aus demselben infizierten Gewebe oder der Durchflusszytometrie von Gewebehomogenaten getestet werden19,28. Dahinterliegende Gründe können unzureichende Expressionsniveaus oder eine Instabilität der Expressionskassette sein. Zu den Minderungsstrategien könnten alternative Promotoren gehören, um die Expression zu steuern, die Codon-Anpassung der Gene, die für das fluoreszierende Protein für die Erregerspezies kodieren, die Verwendung episomaler Konstrukte mit höherer Kopienzahl oder die Stabilisierung von Expressionskassetten durch chromosomale Integration oder balanciert-letale Komplementierung29. Die Wahl des fluoreszierenden Proteins ist ebenfalls wichtig, aber der Nachweis ist mit GFP.mut2, mWasabi, YPet und TIMERbac möglich. Wenn die Segmentierung ungenau ist, kann dies durch eine zu schwache Erregerfluoreszenz verursacht werden, die wie oben beschrieben behoben werden könnte, oder durch einen zu hohen Autofluoreszenzhintergrund des Gewebes. Eine umfangreiche Perfusion der Waschlösung oder eine längere Inkubation in Lagerpuffer unmittelbar vor der Einbettung in den Agaroseblock und die Tomographie können diese Probleme beheben. Schließlich ist für eine präzise Klassifizierung ein ausreichendes Training des neuronalen Netzes erforderlich, aber übermäßiges Training kann zu einer Überanpassung führen, die die Leistung für neue Stichproben beeinträchtigt.
Derzeit ist keine andere Methode in der Lage, ganze Organe mit ausreichender räumlicher Auflösung in 3D abzubilden, um einzelne Bakterien nachzuweisen. Zukünftige Verbesserungen bei der Gewebereinigung und der Lichtblattmikroskopie könnten eine ähnliche Auflösung erreichen. Dies könnte eine Bildgebung mit höherer Geschwindigkeit und mit mehr Fluoreszenzkanälen ermöglichen.
Eine wichtige Einschränkung von STP ist die Pixelauflösung in der Ebene von ~0,5 μm und die vertikale Auflösung von 5 bis 10 μm, die nicht ausreicht, um nahe gelegene Bakterien, z. B. innerhalb einer dicht gepackten Mikrokolonie, aufzulösen. Es ist jedoch möglich, Gewebeschnitte nach der Tomographie für die sekundäre hochauflösende konfokale Mikroskopie ausgewählter Gewebeteile zu gewinnen. Eine weitere Einschränkung von STP ist die Verfügbarkeit von nur drei Fluoreszenzkanälen, was die Anzahl der Fluorophore, die gleichzeitig abgebildet werden können, einschränkt. Auch hier kann die Sekundäranalyse von entnommenen Gewebeschnitten mit Multiplexing-Methoden die Lage und Intensität vieler weiterer Marker für ausgewählte Gewebeteile aufzeigen. Diese Informationen könnten in die gesamte 3D-Struktur des umgebenden Gewebes integriert werden, wie sie mit STP bestimmt wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll detaillierte Untersuchungen von Wirt-Pathogen-Interaktionen auf lokaler und ganzorganlicher Ebene ermöglicht. Das Protokoll sollte leicht an andere Krankheitserreger (sofern sie als fluoreszierende Stämme gewonnen werden können), andere Organe und verschiedene Wirtsarten angepasst werden können.

Infektionen treten in Geweben mit komplexer Anatomie und kompartimentierter Physiologie auf. Die vielfältigen Mikroumgebungen, die im infizierten Gewebe koexistieren, können das Schicksal lokaler Erregeruntergruppen und ihren Beitrag zum Gesamtausgang der Erkrankung bestimmen 1,2,3. Eine umfassende 3D-Kartierung von mikrobiellen Krankheitserregern in zentimetergroßen Geweben bleibt jedoch eine Herausforderung4. Die Bildgebung des Gehirns und anderer Organe ist ein sehr aktives Forschungsfeld mit ständig verbesserten experimentellen Strategien5, aber vielen Methoden fehlt noch die Auflösung im Sub-μm-Bereich, die erforderlich wäre, um μm-große bakterielle Krankheitserreger sicher zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STP)6 die automatisierte, mehrfarbige, verformungsfreie Bildgebung ganzer Gewebe mit einer Auflösung von unter μm in der Ebene, wodurch vollständige volumetrische Datensätze erhalten werden. Diese Methode kombiniert das wiederholte physikalische Schneiden des Gewebes mit einem Vibratom mit intermittierender Zwei-Photonen-Bildgebung der austretenden Blockflächen mit Infrarotlicht. Die STP-Tomographie wird häufig zur Kartierung dünner Axone im Gehirn eingesetzt, um Konnektivitätskarten zu erstellen 7,8,9,10.
Die STP-Tomographie ermöglicht auch die 3D-Kartierung einzelner mikrobieller Erregerzellen (Salmonellen, Toxoplasmen) im gesamten infizierten Gewebe11,12 mit Hilfe eines Tomographen. Die Generierung der zweiten Harmonischen zeigt Kollagenhüllen um Arterien und in fibrösen Banden wie den Trabekeln der Milz und liefert so den anatomischen Kontext. In vivo injizierte fluoreszierende Antikörper können zur Färbung von Wirtszellen verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen einzelnen Erregerzellen und infiltrierenden Immunzellen wie Neutrophilen aufzudecken. Hier wird die Pipeline beschrieben, die die Verarbeitung des Gewebes, die Bildgebung, das Zusammenfügen von Bildgebungskacheln mit Beleuchtungskorrektur, das Stapeln von Bildern in drei Dimensionen und die Segmentierung mit Hilfe von Werkzeugen des maschinellen Lernens umfasst. Diese Pipeline liefert 3D-Positionen von einzelnen Krankheitserregern, Zellen und Mikrokolonien innerhalb ihres Wirtskontextes. Die Anzahl der einzelnen Zellen innerhalb von Mikrokolonien bleibt aufgrund der Auflösungsgrenzen schwierig, aber diese Zahlen können auf der Grundlage der integrierten Helligkeit der Mikrokolonie geschätzt werden. Die Pipeline kann problemlos an andere Infektionsmodelle angepasst werden, wenn rekombinante GFP- oder YFP-exprimierende Erreger zur Verfügung stehen.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sofortklebstoff Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Natriumperiodat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetraborat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum Filtration 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peel away plastic</td><td>mold Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000</td><td>Tomograph TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikörper/Farbstoffe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primär Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonellen, Kaninchen</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, Klon 3D6.112</td><td>Biolegende&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>Anti-Ly-6G-PE, Klon 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hühner-Anti-Kaninchen Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g oder höher</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b oder höher</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (Tomograph)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visualisierungssoftware Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 oder höher</td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende dreidimensionale ganzorgantomographie von mikrobiellen infektionen

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Die meisten Infektionen finden in dreidimensionalen Wirtsgeweben mit komplizierter Anatomie und lokal unterschiedlicher Wirtsphysiologie statt. Die Positionierung der Erregerzellen in dieser vielfältigen Umgebung hat einen erheblichen Einfluss auf ihr Stressniveau, ihre Reaktionen, ihr Schicksal und ihren Beitrag zum allgemeinen Fortschreiten der Krankheit und zum Versagen der Behandlung. Aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Lokalisierung von μm-großen Erregerzellen in cm-großen Wirtsorganen war dieses Forschungsgebiet jedoch noch relativ unerforscht. Hier stellen wir eine Methode vor, um diese Herausforderung anzugehen. Wir setzen serielle Zwei-Photonen-Tomographie und KI-gestützte Bildanalyse ein, um einzelne Salmonellenzellen in der gesamten Milz, in den Leberlappen und in ganzen Lymphknoten infizierter Mäuse zu lokalisieren. Mit Hilfe von Fluoreszenzreportern und in vivo der Verabreichung von Antikörpern können die Replikationsrate einzelner Salmonellenzellen , ihre lokale Interaktion mit spezifischen Immunzellen und die bakterielle Reaktion auf Antibiotika bestimmt werden. Diese Methoden eröffnen Wege für eine umfassende Untersuchung von Infektionen, deren Prävention und Behandlung im dreidimensionalen Gewebekontext.

Das beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis einzelner Salmonellenzellen in ganzen Mausorganen wie Milz, Leber, mesenterialen Lymphknoten und Peyer-Pflastern11 (Abbildung 5 und Abbildung 6). Es weist auch Toxoplasma gondii-Parasiten im Gehirn von Mäusennach 12. Einige infizierte Gewebe wie Leber, Peyer-Pflaster und Milz emittieren eine erhebliche Autofluoreszenz im grün-gelben Bereich. Die Autofluoreszenz wird durch die Fixierung mit Paraformaldehyd, die zur Erhaltung der Gewebestruktur notwendig ist, weiter verstärkt. Die Detektion der grünen Fluoreszenz von GFP, mWasabi und der grünen Komponente von TIMERbac vor diesem Autofluoreszenzhintergrund wird verbessert, indem ein Schmalbandpassfilter 510/20 nm (der die meisten GFP-Emissionen durchlässt, aber einen großen Teil des Autofluoreszenzspektrums blockiert) vor den Photomultiplier 2 (der grüne Emissionen sammelt) gesetzt wird und die Autofluoreszenz des Gewebes reduziert wird, indem fixiertes Gewebe für 3 oder mehr Tage in Kryoprotektivumgelagert wird 11. Bakterien sollten jedoch immer noch mindestens einige tausend Kopien pro Zelle von GFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen exprimieren. Auf der anderen Seite sollten übermäßige Fluoreszenzproteinspiegel vermieden werden, um die Fitnesskosten zu minimieren, die zu einer abgeschwächten Virulenz führen könnten23.
Die korrekte Segmentierung von fluoreszierenden Bakterien im Gewebe kann durch Immunhistochemie der entnommenen Gewebeschnitte nach der Bildgebung bestätigt werden. Insbesondere Objekte, die mit einem Antikörper gegen bakterielle Oberflächenkomponenten wie Lipopolysaccharid gefärbt wurden, können mit dem Fluoreszenzbild ausgerichtet werden, das durch die STP-Tomographie erhalten wurde (Abbildung 5). Es ist wichtig zu beachten, dass einigen gefärbten Salmonellenzellen fluoreszierende Proteine und damit sowohl in der konfokalen Mikroskopie als auch in der STP-Tomographie nachweisbare Fluoreszenz fehlen. Bei diesen Zellen handelt es sich um Salmonellen , die vom Immunsystem des Wirts abgetötet wurden, wie durch durchflusszytometrische Sortierung und Wachstumskulturen aus einzelnen sortierten Zellen nachgewiesen wurde, sowie durch die enge Korrelation zwischen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf Agarplatten und der Anzahl fluoreszierender Salmonellenzellen , wie sie durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde24. Darüber hinaus kann der Plasmidverlust zu nicht fluoreszierenden lebensfähigen Zellen führen, und dies muss durch Plattieren auf Medien mit und ohne geeignete Antibiotika entsprechend dem Selektionsmarker auf dem Plasmid getestet werden. Bei pSC101-abgeleiteten Plasmiden ist der Plasmidverlust in vivo selten19. Bei den meisten chromosomal integrierten Expressionskassetten, wie z.B. sifB::gfp , die inNummer 11 verwendet werden, ist ein Expressionsverlust in vivo nicht nachweisbar. Wenn die Segmentierung nicht mit immunhistochemischen Daten übereinstimmt, muss die Segmentierungspipeline geändert werden.
Die Auflösung der STP-Tomographie reicht nicht aus, um einzelne Bakterienzellen innerhalb dicht gepackter Mikrokolonien aufzulösen. Die Gesamtfluoreszenzintensität der Mikrokolonie ermöglicht jedoch eine Abschätzung der Anzahl der Salmonellenzellen . Dies erfordert einen fluoreszierenden Stamm mit sehr homogenen Fluoreszenzwerten wie z.B. Salmonella sifB::gfp11. Die Kombination der geschätzten Anzahl von Salmonellenzellen für alle Mikrokolonien und Einzelzellen ergibt eine bakterielle Gesamtgewebebelastung, die mit alternativen Methoden wie Plattierung oder Durchflusszytometrie von Gewebehomogenaten übereinstimmt11. Plattierung und Durchflusszytometrie können nicht direkt aus demselben Gewebe durchgeführt werden, da sie für die STP-Tomographie perfusionsfixiert werden müssen. Stattdessen müssen sie mit zusätzlichen Tieren durchgeführt werden, die nicht fixiert sind. Wenn sich die mediane Bakterienlast, die durch die verschiedenen Ansätze ermittelt wurde, um mehr als das 3-fache unterscheidet, könnte die Lebensfähigkeit fluoreszierender Bakterien beeinträchtigt sein (im Falle von niedrigeren koloniebildenden Einheiten) oder einige Bakterien könnten das fluoreszierende Reporterkonstrukt verloren haben (im Falle von höheren koloniebildenden Einheiten). Ein Kontrollversuch ist erforderlich, um die Ursache solcher Diskrepanzen zu ermitteln.
Die STP-Tomographie ermöglicht die Lokalisierung von Bakterienzellen innerhalb der 3D-Struktur des infizierten Gewebes. Die zweiten harmonischen Signale von Kollagen liefern anatomische Orientierungspunkte wie Arterien und Trabekel. Darüber hinaus können Wirtszellen in vivo gefärbt werden, indem vor der Perfusion ein Antikörper in Oberflächenmarker injiziert wird (Abbildung 5 und Abbildung 6). Diese Färbung bietet zusätzliche Orientierungspunkte für Gewebekompartimente und spezifische Mikroumgebungen, einschließlich Entzündungsherde (intrazelluläre Marker und einige Kompartimente mit Diffusionsbarrieren, wie z. B. die Milz, die weiße Pulpa oder das Gehirn, sind für diese In-vivo-Färbung nicht leicht zugänglich). Dieser Ansatz enthüllte die Milz-weiße Pulpa als Gewebekompartiment, das ein langfristiges Überleben von Salmonellen während einer antimikrobiellen Chemotherapie ermöglicht11.
Schließlich können Salmonellen, die sich mit moderaten oder langsamen Raten replizieren, identifiziert und innerhalb der 3D-Struktur von Geweben lokalisiert werden, indem Stämme verwendet werden, die den Timerbac exprimieren, einen Einzelzellreporter für die Replikationsrate11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Abbildung 1: Verfahren zur Ganzorganbildgebung mittels serieller Zwei-Photonen-Tomographie (STP). (A-B) Das Organ wird nach der transkardialen Perfusion entnommen und über Nacht in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C gelagert. (C-E) Das Organ wird in oxidierte Agarose eingebettet und vernetzt, dann wird das Gewebe gescannt und mittels STP-Tomographie in Scheiben geschnitten. Die Scheiben werden für die anschließende Immunhistochemie gesammelt. (F-J) Pipelines für die computergestützte Analyse zur Quantifizierung der Bakterienzahl, zur Bestätigung fluoreszierender Bakterien und zur 3D-Rekonstruktion von Bakterienpositionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Abbildung 2: Aufbau einer seriellen Zwei-Photonen-Tomographie (STP). (A) Tomograph, der (B) 2-Photonen-Bildgebung mit (C) automatisierter serieller Gewebeschnitterstellung umfasst. (D) Entnommene Gewebeschnitte für Nachuntersuchungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Abbildung 3: Kachel-Stitching und Beleuchtungskorrektur. Die Kacheln werden vernäht und ungleichmäßige Ausleuchtungen werden durch korrigierte Intensitätsverteilungen mit Hilfe von Regularized Energy Minimization (CIDRE) korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Abbildung 4: Segmentierung von Salmonellen , die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, unter Verwendung einer Support Vector Machine (SVM) und eines Convolutional Neural Network (CNN). (A) Repräsentative Bilder von GFP-Objekten, segmentiert nach SVM (links) und entsprechende Bilder (rechts) mit Regionen, die nach SVM segmentiert sind (Maßstabsleiste: 10 μm). (B) Verteilung der gruppierten Rot-Grün-Blau-Werte (RGB) für die segmentierten Regionen. (C) Repräsentative Bilder von Nicht-GFP-Objekten, die von der SVM fälschlicherweise als Bakterien identifiziert wurden (links). CNN verwirft sie korrekterweise als Hintergrund (rechts, Maßstabsleiste: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Abbildung 5: Nachweis von Salmonellen, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, mittels Tomographie und Bestätigung durch Immunhistochemie. Bilder desselben Schnitts, die durch Tomographie (links) oder konfokale Mikroskopie nach der Färbung mit einem Antikörper gegen Salmonella-Lipopolysaccharid (rechts) aufgenommen wurden. Neutrophile (rot) wurden durch In-vivo-Injektion eines PE-markierten Anti-Ly-6G-Antikörpers vor der Perfusion gefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Abbildung 6: 3D-Rekonstruktion und Lokalisierung von Salmonellen in infizierter Milz von Mäusen. (A) Dreidimensionale (3D) Rekonstruktion eines 5 mm dicken Milzschnitts, der in vivo vor der Perfusion mit einem Anti-CD169-Antikörper (rot) gefärbt wurde. Das blaue Signal stellt Kollagen dar, das durch die zweite Harmonische erkannt wird. (B) Eine optische Ebene des in (A) gezeigten 3D-Stacks. Die Positionen von Salmonellenzellen oder Mikrokolonien sind durch Sterne gekennzeichnet. (C) 3D-Rekonstruktion der Salmonellenpositionen (Sterne) in der infizierten Leber. Die Arterien sind anhand ihrer Kollagenscheiden (blau) sichtbar. Maßstabsleiste: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Bakterieninfektionen stellen eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Die Antibiotikaresistenz nimmt zu, und gegen einige wichtige Krankheitserreger fehlen nach wie vor Impfstoffe. Um neue Wege für Kontrollstrategien zu finden, müssen wir mehr darüber wissen, wie Krankheitserreger auf das Immunsystem des Wirts und auf Antibiotika in vivo in den infizierten Geweben reagieren.Überlebende Bakterien können Rückfälle verursachen, wenn antimikrobielle Mittel eine Infektion nicht ausrotten können. Mittels serieller Tomographie zeigen wir, dass Typhus-verursachende Salmonellen während der Therapie in einem bestimmten Teil der Milz persistieren können. Die Entzündung ist in dieser Region schwach, was die entscheidende Synergie zwischen Antibiotika und Entzündungen für eine effektive Beseitigung stört.Bakterien sind mikrometergroße Objekte. Es ist schwierig, solche kleinen Objekte in ihrem Gewebekontext zu lokalisieren. Mit der seriellen Zwei-Photonen-Tomographie kann ein einzelnes Bakterium in zentimetergroßen Organen nachgewiesen und seine Replikationsrate bestimmt werden.Wir können auch Immunzellen, wie zum Beispiel Neutrophile, nachweisen und ihre räumliche Beziehung zu den Bakterien bestimmen. Wir untersuchen die Aktivitäten von bakteriostatischen Antibiotika. Diese Antibiotika können Infektionen heilen, obwohl sie das Bakterienwachstum nur hemmen können, ohne den Erreger tatsächlich abzutöten.Wir bestimmen auch die Ausbreitung von bakteriellen Mutanten, denen bestimmte Virulenzfaktoren fehlen, und den Einfluss von Immundefekten auf Infektion und Behandlung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

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