Mikrofluidik-Anwendungen für Einweg-Diagnostics

Mein Name ist Catherine CloudBridge und ich bin Professorin für Fertigung, Ingenieurwesen und Biomedizintechnik an der Boston University. Und ich bin der Direktor des Labors für biomedizinische Mikrogeräte und Mikroumgebungen. Wir arbeiten in erster Linie an der Entwicklung von Einwegdiagnostika für Anwendungen in ressourcenbegrenzten Umgebungen.

Also verwenden wir Mikrofluidik, um diese Geräte herzustellen. Wir interessieren uns eigentlich für zwei Studienbereiche. In erster Linie geht es uns darum, wie Biomoleküle und Zellen mit Kunststoff-Polymer-Oberflächen interagieren.

Das ist unser wichtigster Schirm. Diese Arbeit wird in mikrofluidischen Anwendungen für die Einwegdiagnostik verkörpert. Im Labor stellen wir also mikrofluidische Geräte her.

In thermoplastischen Materialien, die wir nicht verwenden, verwenden wir in der Regel PDMS, das gummiartige Material, das die meisten Menschen zur Herstellung von Mikrofluidik im Labor verwenden. Wir stellen unsere Geräte aus thermoplastischen Kunststoffen her. Wir sind daran interessiert, diese thermoplastischen Geräte zu verwenden, um Molekularbiologie auf der Mikroskala so zu betreiben, dass diese Molekularbiologie im Feld weit weg von einem zentralisierten Labor durchgeführt werden kann.

Labor stellen wir kleine Plastikkarten her, und in diesen kleinen Plastikkarten befinden sich Festphasenextraktionssäulen oder Zelllysesäulen oder Mischsäulen. Wir führen auch eine Polymerase-Kettenreaktion auf dem Chip als Nachweistechnik durch. All diese Dinge sind in ein kleines Gerät integriert, das schließlich, in der langfristigen Perspektive der Forschung, ein integriertes Gerät sein wird, das in der Lage wäre, in der Hand gehalten und ins Feld oder in Umgebungen getragen zu werden, in denen ein großes Labor mit all den zugehörigen Zentrumsfusionen und Heizinkubatoren und so weiter nicht zur Verfügung stehen würde.

Wir möchten also idealerweise mit einer menschlichen Probe wie Blut, Urin, Stuhl oder einem Nasen-Rachen-Abstrich beginnen können, bei dem es sich um Schleim handelt. Und dann haben Sie am Ausgang des Chips eine Antwort, ob ja oder nicht, jemand ist mit einem bestimmten Mikroorganismus infiziert. Und die Art und Weise, wie wir das tun, besteht darin, nach der DNA dieses bestimmten oder RNA zu suchen, abhängig vom Mikroorganismus dieses bestimmten Mikroorganismus in der Probe des Patienten.

Die technischen Herausforderungen, die sich daraus ergeben, liegen also größtenteils in der Probenvorbereitung dieser Gleichung. Wenn man also mit Blut, Stuhl oder Urin beginnt, muss man von einer Situation, in der man eine unordentliche menschliche Probe mit vielen potenziell partikulären Partikeln oder Inhibitoren hat, zu PCR oder anderen Amplifikationstechniken kommen. Und Sie möchten am Ende eine sehr saubere, entgangene Probe von Nukleinsäuren haben, die Sie dann zur Amplifikation oder Suche nach einer bestimmten DNA oder RNA verwenden können, die Ihnen sagt, ob ein Mikroorganismus, nach dem Sie suchen, vorhanden war.

Um diese Proben zu bereinigen, müssen Sie also ein paar Dinge tun. Zuerst müssen Sie die Probe filtern, was je nach Probe eine grobe Filtration oder einen schnellen Schleuderschritt beinhalten kann, bevor die Probe auf den Chip gelangt. Deshalb versuchen wir immer, mit Proben zu beginnen, wie sie vom Arzt kommen.

Bei Urin-, Stuhl- und Nasen-Rachen-Abstrichen ist es unser Ziel, dass der Arzt seine Arbeit wie gewohnt erledigt und die Probe so entnimmt, wie er es normalerweise tun würde. Und dann nehmen wir diese Probe und legen sie auf die Chips. Wenn also in diesem Schritt eine weitere Filtration erforderlich ist, würde diese Filtration im Chip stattfinden.

Der zweite Schritt besteht darin, dass wir, da wir molekulare Assays durchführen, die Zellen und Mikroorganismen, die sich in dieser Probe befinden, lysieren müssen. Also führen wir dann einen Lyseschritt durch, bei dem die Probe in der Regel durch einen Filter gepresst wird, der eine kleine Porengröße hat. Manchmal enthält dieser Filter auch Nanopartikel wie Kohlenstoff-Nanoröhren, die scharfe Kanten haben, die verwendet werden können, um einige der Organismen zu zerreißen, die robustere Zellwände haben, wie C difficile, ein grampositives Bakterium, mit dem wir arbeiten, das sehr schwer zu lügen ist.

Wir müssen also robustere Lysesäulen haben. Aber normalerweise führen wir eine kombinierte chemische und mechanische Lyse im Inneren des Chips durch. Danach ist es unser Ziel, das Lysat zu nehmen und dann die gereinigten Nukleinsäuren zu extrahieren.

Wir leiten also die Lyse weiter, wir leiten das Lysat über eine Festphasen-Extraktionssäule, die im mikrofluidischen Chip resonant ist. Und diese Festphasen-Extraktionssäule besteht aus Kunststoff und wird mit Hilfe von photoinitiierter Chemie im Inneren des mikrofluidischen Kanals hergestellt, nachdem sie bereits hergestellt wurde. Und es ist auch mit normalerweise Kieselsäurepartikeln imprägniert, weil wir Nukleinsäuren binden und freisetzen wollen.

In einigen Fällen haben wir Oligo-DT-Kügelchen eingebaut, wenn wir zum Beispiel mRNA spezifisch binden und freisetzen wollen, oder Kügelchen, die bestimmte Antikörper enthalten, wenn wir bestimmte Proteine binden und freisetzen wollen. Und wir können Extraktionssäulen herstellen, die all diese Dinge tun. Aber heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die Sase-Extraktionssäule mit den Kieselsäurekügelchen herstellen können.

Nachdem wir das getan haben, leiten wir das Lysat über die Kieselgelsäule, es funktioniert genauso wie ein Kyogen-Kit im Labor im Makromaßstab. Dann waschen wir uns, um all die anderen Dinge loszuwerden, die wir nicht wollen, alle Kohlenhydrate und Lipide und andere Dinge im Zelllysat und im Rest der menschlichen Probe, die wir nicht wollen. Und ganz am Ende, wir spielen auf Wasser an.

Und das Schöne an diesen mikroskaligen Festphasen-Extraktionssäulen ist, dass wir mit einer sehr kleinen Menge Wasser eluieren können, normalerweise in der Größenordnung von ein bis fünf Mikrolitern. Und wir bekommen fast alle Nukleinsäuren zurück, die wir hineingesteckt haben. Wir haben einen Wirkungsgrad von etwa 70 bis 90 % und die ersten 10 Mikroliter, die wir aus diesem Kanal zurückbekommen.

Wenn wir also zweimal mit zwei bis 10 Mikrolitern durchspülen, bekommen wir fast alle Nukleinsäuren zurück, die wir dort hingegeben haben. Es handelt sich also nicht nur um eine saubere Probe, die PCR-fähig ist, sondern auch um eine Probe, die viel höher konzentriert ist, als Sie mit einem Standard-Tischkit erhalten könnten. Das Endziel all dieser Probenvorbereitungstechniken besteht also darin, Dinge herzustellen, die mit einigen der anderen Arbeiten kompatibel sind, die die Menschen geleistet haben.

Sehr schöne Arbeit im Feld, die zeigt, dass man PCR-Amplifikation auf einem Chip durchführen kann. Sie können die reverse Transkriptase-Reaktion auf einem Chip durchführen, wenn Sie es mit einem RNA-Virus zu tun haben oder wenn Sie ein Genexpressionsexperiment durchführen möchten. Unsere Probenvorbereitungstechniken können direkt mit PCR auf einem Chip gekoppelt werden, so dass Sie keine Reinigung und Probenvorbereitung am Labortisch durchführen müssen.

Und, und, und auch der Konzentrationsschritt, den Sie durchführen müssten, um die winzigen Volumina zu erhalten, die für die Multiplex-PCR auf einem kleinen Chip erforderlich sind. Die Experimente, die wir Ihnen heute zeigen werden, zeigen, wie wir den mikrofluidischen Chip zusammenbauen, der aus Thermoplast und nicht aus PDMS besteht. Es erfordert also einen etwas anderen Herstellungsprozess als den üblichen, wie diese Chips versiegelt werden.

Und dann, wie wir die lichtinitiierte Chemie im Inneren des Chips herstellen, um die Polymermonolithen herzustellen, die sowohl für die Zelllyse als auch für die Festphasenextraktion verwendet werden. Und am Ende dieses Prozesses, der im Moment modulare Prozesse im Labor sind, die aber integriert werden können und wurden, erhalten Sie am Ende eine hochkonzentrierte Probe von Nukleinsäuren, RNA und DNA in Wasser, die dann stromabwärts zu einem PCR-Modul oder einem anderen Amplifikationsmodul geleitet werden kann, wo die Identifizierung eines Mikroorganismus oder einer Infektion erfolgen kann. Wir haben also tatsächlich einen Zuschuss, an dem wir gerade arbeiten, wo wir anfangen, menschliche Proben vom Boston Medical Center von Patienten zu sammeln, die möglicherweise mit Influenza infiziert sind oder auch nicht, A.So da es Grippesaison ist, das sind die Proben, die wir sammeln.

Und dann führen wir im Labor die Goldstandard-Assays durch, um zu sehen, ob jemand mit Influenza A infiziert ist oder nicht, was im Grunde ein Kulturtest ist, dessen Durchführung mehrere Tage dauert. Und Seite an Seite damit lassen wir diese Proben gerade durch die Module unseres Chips laufen. Wir geben sie durch die Lysesäule, wir führen sie durch die Festphasenextraktionssäule und dann führen wir die PCR durch, um zu sehen, wie gut wir im Vergleich zu den Goldstandardmethoden abschneiden.

Das ist also die Phase, in der wir uns gerade befinden. Wenn diese Experimente funktionieren, denke ich, dass wir in den nächsten vier bis sechs Jahren vielleicht in einer Situation sein werden, in der wir einen integrierten Chip und einen vollständigen Assay für Influenza A haben und wir auch an Clostridium difficile- und Stuhlproben arbeiten. Und wir sind, wir sind, wir sind auch sehr nah dran, nicht nur das Gerät, sondern auch den Assay integriert zu haben.

Sowohl die Assay-Entwicklung als auch das Chip-Design müssen also Hand in Hand gehen. Für eine bestimmte Anwendung ist es also wirklich ein zielorientierter Prozess, zum Krankenbett zu gelangen. Sie müssen die Probe kennen, mit der Sie beginnen, und den Mikroorganismus, den Sie suchen, um den Chip für den Einsatz am Krankenbett zu optimieren.

Ich glaube nicht, dass wir so weit davon entfernt sind, dies in einer prototypischen Art und Weise zu erreichen. Das sind unsere Endziele, also hoffe ich, dass wir es schaffen.