Mikrofluidik-Anwendungen für Einweg-Diagnostics

Mein Name ist Catherine CloudBridge und ich bin Professorin für Fertigungstechnik, Ingenieurwesen und biomedizinische Technik an der Boston University. Außerdem leite ich das Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory. Wir arbeiten hauptsächlich an der Entwicklung von Einweg-Diagnosetests für Anwendungen in ressourcenarmen Umgebungen.

Daher verwenden wir Mikrofluidik, um diese Vorrichtungen herzustellen. Wir interessieren uns eigentlich für zwei Forschungsbereiche. Vor allem möchten wir untersuchen, wie Biomoleküle und Zellen mit Polymeroberflächen aus Kunststoff interagieren.

Das ist unser wichtigstes übergeordnetes Konzept. Diese Arbeit findet Anwendung in mikrofluidischen Systemen für Einweg-Diagnostika. Im Labor stellen wir also mikrofluidische Vorrichtungen her.

Bei thermoplastischen Materialien verwenden wir in der Regel kein PDMS, das gummiartige Material, das die meisten Menschen im Labor zur Herstellung von Mikrofluidik nutzen. Unsere Geräte stellen wir aus Thermoplasten her. Wir interessieren uns dafür, diese thermoplastischen Vorrichtungen zu nutzen, um auf mikroskaliger Ebene Molekularbiologie durchzuführen, sodass diese Molekularbiologie außerhalb eines zentralisierten Labors vor Ort durchgeführt werden könnte.

Wie dies im Labor funktioniert, ist, dass wir kleine Kunststoffkarten herstellen, in denen sich Festphasen-Extraktionskolonnen oder Zelllysekolonnen oder Mischkolonnen befinden. Außerdem führen wir auf dem Chip als Nachweismethode die Polymerase-Kettenreaktion durch. All diese Komponenten sind in einem kleinen Gerät integriert, das langfristig im Rahmen der Forschung zu einem tragbaren, handgehaltenen integrierten Gerät werden soll, das auch in Feldanwendungen oder in Umgebungen eingesetzt werden kann, in denen kein großes Labor mit Zentrifugen, Heizinkubatoren und dergleichen zur Verfügung steht.

Wir möchten daher idealerweise mit einer menschlichen Probe beginnen, beispielsweise Blut, Urin, Stuhl oder einem nasopharyngealen Abstrich, also zum Beispiel Schleim. Am Ausgang des Chips soll dann eine klare Antwort vorliegen, ob eine Person mit einem bestimmten Mikroorganismus infiziert ist oder nicht. Dies erreichen wir, indem wir in der Patientenprobe nach der DNA oder – je nach Mikroorganismus – nach der RNA dieses spezifischen Erregers suchen.

Die technischen Herausforderungen ergeben sich somit hauptsächlich beim Probenvorbereitungsschritt dieser Gleichung. Wenn Sie mit Blut, Stuhl oder Urin beginnen, müssen Sie von einer Ausgangssituation ausgehen, in der sich eine unübersichtliche humane Probe mit vielen potenziellen Partikeln oder Hemmstoffen für die PCR oder andere Amplifikationstechniken befindet. Ziel ist es, am Ende eine sehr saubere, eluierte Probe von Nukleinsäuren zu erhalten, die Sie anschließend zur Amplifikation nutzen oder nach einer bestimmten DNA oder RNA untersuchen können, um festzustellen, ob der gesuchte Mikroorganismus vorhanden war.

Um diese Proben aufzubereiten, müssen Sie einige Schritte durchführen. Zunächst müssen Sie die Probe filtrieren, wobei je nach Art der Probe eine Grobfiltration oder ein kurzer Zentrifugationsschritt erfolgen kann, bevor die Probe auf den Chip gegeben wird. Daher versuchen wir stets, mit den Proben zu beginnen, wie sie vom Kliniker stammen.

Bei Urin, Stuhl und nasopharyngealen Abstrichen verfolgen wir das Ziel, dass der behandelnde Arzt seine Arbeit wie gewohnt verrichtet und die Probe auf die übliche Weise entnimmt. Anschließend übernehmen wir die Probe und bringen sie auf die Chips auf. Falls zu diesem Zeitpunkt eine zusätzliche Filtration erforderlich ist, erfolgt diese innerhalb des Chips.

Der zweite Schritt beinhaltet, da wir molekularbiologische Tests durchführen, dass wir die Zellen und Mikroorganismen in dieser Probe lysieren müssen. Daher führen wir einen Lysisschritt durch, der üblicherweise das Durchzwingen der Probe durch einen Filter mit kleiner Porengröße umfasst. Manchmal enthält dieser Filter außerdem Nanopartikel wie Kohlenstoffnanoröhren mit scharfen Kanten, die verwendet werden können, um einige Organismen mit robusteren Zellwänden wie C difficile aufzubrechen, ein grampositives Bakterium, mit dem wir arbeiten und das sehr schwer zu lysieren ist.

Daher benötigen wir robustere Lysissäulen. Typischerweise führen wir jedoch eine kombinierte chemische und mechanische Zellzerstörung innerhalb des Chips durch. Danach besteht unser Ziel darin, das Lysat zu nehmen und daraus die gereinigten Nukleinsäuren zu isolieren.

Wir leiten also die Lyse, das Lysat, über eine Festphasen-Extraktions-Säule, die in dem mikrofluidischen Chip befestigt ist. Diese Festphasen-Extraktions-Säule besteht aus Kunststoff und wird mittels photoinitierter Chemie innerhalb des mikrofluidischen Kanals hergestellt, nachdem dieser bereits gefertigt wurde. Zudem ist sie üblicherweise mit Silicapartikeln imprägniert, da wir Nukleinsäuren binden und wieder freisetzen möchten.

In einigen Fällen haben wir Oligo-dT-Kügelchen verwendet, wenn wir beispielsweise mRNA gezielt binden und freisetzen möchten, oder Kügelchen mit spezifischen Antikörpern, um bestimmte Proteine zu binden und freizusetzen. Außerdem können wir Extraktionssäulen herstellen, die all diese Funktionen übernehmen. Heute zeigen wir Ihnen jedoch, wie man die SASE-Extraktionssäule mit Kieselkieselchen herstellt.

Nachdem wir das getan haben, wird das Lysat über die Säulenchromatographie mit Silica geleitet, was genau so funktioniert wie ein Kyogen-Kit in einem makroskaligen Labor. Anschließend waschen wir, um alle unerwünschten Bestandteile zu entfernen, wie beispielsweise die Kohlenhydrate, Lipide und sonstigen Substanzen im Zelllysat und im restlichen menschlichen Probenmaterial, die wir nicht benötigen. Ganz zum Schluss eluieren wir mit Wasser.

Und was vorteilhaft an diesen mikroskaligen Festphasen-Extraktions-Säulen ist, ist, dass wir mit einer sehr geringen Menge Wasser eluieren können, üblicherweise in der Größenordnung von ein bis fünf Mikrolitern. Dabei erhalten wir nahezu alle eingesetzten Nukleinsäuren zurück. Wir erreichen eine Effizienz von etwa 70 bis 90 % innerhalb der ersten 10 Mikroliter, die wir aus diesem Kanal zurückgewinnen.

Wenn wir also zweimal mit zwei bis 10 Mikrolitern durchwaschen, erhalten wir nahezu alle dort eingebrachten Nukleinsäuren zurück. Es handelt sich also nicht nur um eine saubere Probe, die für die PCR geeignet ist, sondern auch um eine Probe, die viel stärker konzentriert ist, als man dies mit einem herkömmlichen Bench-Top-Kit erreichen könnte. Das Endziel all dieser Probenvorbereitungstechniken besteht somit darin, Proben herzustellen, die mit anderen bereits durchgeführten Arbeiten kompatibel sind.

Sehr gute Arbeit im Bereich, die zeigt, dass man eine PCR-Amplifikation auf einem Chip durchführen kann. Man kann die Reverse-Transkriptase-Reaktion auf einem Chip durchführen, wenn man mit einem RNA-Virus arbeitet oder ein Genexpressions-Experiment durchführen möchte. Unsere Probenvorbereitungstechniken können direkt mit der PCR auf einem Chip gekoppelt werden, sodass keine Reinigung und Probenvorbereitung am Laborplatz erforderlich wäre.

Und außerdem auch der Konzentrierungsschritt, den man durchführen müsste, um die winzigen Volumina zu erhalten, die notwendig sind, um eine multiplexe PCR auf einem kleinen Chip durchzuführen. Die Experimente, die wir Ihnen heute zeigen, veranschaulichen, wie wir den mikrofluidischen Chip zusammenbauen, der aus Thermoplast und nicht aus PDMS besteht. Dies erfordert einen etwas anderen Herstellungsprozess als üblich sowie eine spezielle Methode, wie diese Chips versiegelt werden.

Und dann, wie wir die lichtinitiierte Chemie innerhalb des Chips durchführen, um die Polymermonolithe herzustellen, die sowohl für die Zelllyse als auch für die Festphasenextraktion verwendet werden. Am Ende dieses Prozesses, der derzeit aus modularen Schritten im Labor besteht, die jedoch integriert werden können und wurden, erhält man eine hochkonzentrierte Probe von Nukleinsäuren, RNA und DNA in Wasser, die anschließend in ein PCR-Modul oder ein anderes Amplifikationsmodul eingebracht werden kann, in dem die Identifizierung eines Mikroorganismus oder einer Infektion erfolgt. Wir bearbeiten derzeit tatsächlich eine Fördermittelantrag, bei dem wir anfangen, menschliche Proben vom Boston Medical Center von Patienten zu sammeln, die möglicherweise mit Influenza A infiziert sind oder nicht. Da gerade Grippesaison ist, sind dies die Proben, die wir derzeit sammeln.

Und anschließend führen wir im Labor die Goldstandard-Analysen durch, um festzustellen, ob eine Person mit Influenza A infiziert ist, was im Wesentlichen ein Kulturverfahren ist, das mehrere Tage zur Durchführung benötigt. Parallel dazu geben wir diese Proben in unsere derzeitigen Module des Chips. Wir leiten sie durch die Lysissäule, anschließend durch die Festphasen-Extraktionssäule und führen dann die PCR durch, um zu überprüfen, wie gut wir im Vergleich zu den Goldstandard-Methoden abschneiden.

Das ist derzeit der Stand. Wenn diese Experimente erfolgreich verlaufen, denke ich, dass wir in den nächsten vier bis sechs Jahren möglicherweise in einer Situation sein werden, in der wir einen integrierten Chip und einen vollständigen Test für Influenza A haben, und außerdem arbeiten wir an Clostridium difficile und Stuhlproben. Und wir sind, wir sind, wir sind auch kurz davor, nicht nur das Gerät, sondern auch den Test integriert zu haben.

Daher müssen die Assay-Entwicklung und das Chip-Design Hand in Hand erfolgen. Bei einer bestimmten Anwendung, die darauf abzielt, bis zum Krankenbett vorzudringen, handelt es sich wirklich um einen zielgerichteten Prozess. Sie müssen die Ausgangsprobe sowie den gesuchten Mikroorganismus kennen, um den Chip für die Anwendung am Krankenbett zu optimieren.

Ich denke also nicht, dass wir so weit davon entfernt sind, dies in einer prototypischen Form zu verwirklichen. Das sind unsere Endziele, und ich hoffe, dass wir sie erreichen.