Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist der Nachweis des Influenza-A-Virus mit Hilfe eines mikrofluidischen Chips. Führen Sie zunächst die Probe mit Lysepuffer durch den SPE-Kanal, um das Virus zu lyzieren und RNA zu extrahieren, laden Sie das R-T-P-C-R-Reagenz mit extrahierter RNA und führen Sie den reversen Transkriptionskanal aus, um virale RNA in CDNA umzuwandeln. Als nächstes führen Sie die Mischung in den PCR-Kanal, um die DNA zu amplifizieren, und erhalten Ergebnisse, die die Größe und Konzentration des Amplikons basierend auf dem Fluoreszenzsignal aus der Kapillarelektrophorese zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, dass sie die rohe Patientenprobe aufnimmt und Nukleinsäureextraktion, Reinigung, reverse Transkription und Amplifikation in einem einzigen Chip integriert. Um zwei Plaques zu erzeugen, verteilen Sie etwa neun Gramm XN X-Pellets gleichmäßig in der Mitte einer Metallplatte und legen Sie sie fünf Minuten lang auf eine bei 198 Grad Celsius erhitzte Presse. Üben Sie dann weitere fünf Minuten lang langsam Druck auf 2.500 PSI aus. Positionieren Sie nun eine Plaque auf der Epoxidform, heizen Sie sie 10 Minuten lang auf 157 Grad Celsius vor und üben Sie weitere 10 Minuten lang langsam Druck auf 1000 PSI aus.

Tragen Sie anschließend Thermohandschuhe, entfernen Sie die Plaque und den Schimmel aus der Heißpresse und entfernen Sie dann den Plaque aus der Form, bevor sie abkühlt. Bohren Sie drei Löcher in den geprägten Chip, je eines am Einlass, der Abflussöffnung und dem Ausgang des mikrofluidischen Kanals. Dann die Chips mit IPA waschen, gefolgt von RNAs und Diannas Wasser.

Trocknen Sie die Chips mit Luft, um die Chips zu verbinden, heizen Sie sie zuerst 10 Minuten lang bei 131 Grad Celsius vor und drücken Sie sie dann weitere 10 Minuten lang bei 350 PSI. Befestigen Sie mit JB Weld Epoxy Nano-Ports am Einlassabfall, und die Auslassöffnungen härten separat 15 bis 24 Stunden lang aus. Spülen Sie den SPE-Kanal gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 50 Mikrolitern RNAs und anschließend mit 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser aus.

Beladen Sie nun den SPE-Kanal mit vier Mikrolitern frisch zubereiteter Pfropflösung, um das Methacrylat-Inkubat 10 Minuten lang in einem UV-Ofen zu vernetzen, und entfernen Sie die restliche Pfropflösung mit einem Vakuum. Zerkleinern Sie das getrocknete Mikrokugel-Pellet, indem Sie bei geschlossenem Deckel auf das Röhrchen klopfen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter frisch zubereitete SPE-Säulenlösung hinzu und wirbeln Sie sie zum Mischen ein.

Laden Sie vier Mikroliter der SPE-Lösung in denselben Kanal und vernetzen Sie sie durch UV-Bestrahlung für 2,5 Minuten auf jeder Seite, was zu einer undurchsichtigen, weißen, polymerisierten SPE-Säule führt. Waschen Sie den Kanal mit 500 Mikrolitern 100%igem Methanol, um überschüssige Reaktanten und pyrogene Lösungsmittel innerhalb des Polymers zu entfernen. Befestigen Sie zwei Dünnschichtheizungen mit wärmeleitendem Klebeband an der Unterseite des Chips.

Beachten Sie, dass die Seiten der Heizungen für die Dene-Dauer mit dem Rand der breiten Kanäle ausgerichtet werden müssen und beim separaten Knien fünf Thermoelemente durch die toten offenen Seitenkanäle jedes Chipbandes in den Chip eingesetzt werden müssen. Um die Position der Thermoelemente zu bestimmen, fügen Sie vier Mikroliter 25 XRNA Secure zu 96 Mikrolitern 70 % Ethanol in einem Röhrchen und zu 100 % Ethanol in einem zweiten Röhrchen hinzu. Bereiten Sie außerdem 300 Mikroliter Kanalpuffer und 316 Mikroliter Lysepuffer vor.

Erhitzen Sie die Lösungen 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Um die RNA zu aktivieren, sichert sich, dann um den mikrofluidischen Kanal auszugleichen. Lassen Sie den Kanalpuffer mit einer Durchflussrate von 0,8 Millilitern pro Stunde durch den SPE-Kanal laufen.

Jetzt schnelles Fava-Testmuster in VTM bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Probe, sobald sie aufgetaut ist. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 13.000 U/min zentrifugiert.

Übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands in 300 Mikroliter des Lysepuffers und fügen Sie sechs Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter Träger hinzu, RNA-Vortex zum Mischen. Drehen Sie sich dann fünf Sekunden lang und laden Sie das gesamte Lysat in eine Ködersperre mit einer CC-Spritze. Lassen Sie das Lysat mit einer Durchflussrate von 0,8 Millilitern pro Stunde durch den SPE-Kanal laufen.

Waschen Sie dann den SPE-Kanal mit 100 Mikrolitern 70 % Ethanol, gefolgt von 100 Mikrolitern 100 % Ethanol bei einem Milliliter pro Stunde. Positionieren Sie eine leere Spritze an der 0,5-Milliliter-Markierung und drücken Sie Luft durch den Kanal, um sie mit einem Milliliter pro Stunde zu trocknen. Lassen Sie nun 67,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser durch den Kanal laufen, um die gebundenen Nukleinsäuren mit 0,5 Millilitern pro Stunde zu eluieren, und sammeln Sie 13,5 Mikroliter aus dem Nanoport an der Abfallöffnung.

Laden Sie 36,5 Mikroliter des R-T-P-C-R Masters. Mischen Sie den Nanoport an der Abfallöffnung ein und mischen Sie ihn mit Template-RNA für eine 50 Mikroliter R-T-P-C-R-Reaktion. Laden Sie dann das R-T-P-C-R-Gemisch durch sanftes Vakuum in den RT-Kanal.

Verschließen Sie den Nano-Port mit einer geschlossenen Armatur. Legen Sie 35 Volt an die erste Heizung an. Bewahren Sie die Reagenzien 30 Minuten lang im RT-Kanal auf, nachdem das Erhitzen bei 50 Grad Celsius ausgeglichen wurde.

Bewahren Sie die Reagenzien 15 Minuten lang im RT-Kanal auf, nachdem das Erhitzen bei 95 Grad Celsius ausgeglichen wurde. Legen Sie als Nächstes 27 Volt an die erste Heizung und 50 Volt an die Heizung an, zwei zum Ausgleich der Heizung, eine bei 60 Grad Celsius und die zweite Heizung bei 95 Grad Celsius. Schieben Sie die Reagenzien mit 0,5 Mikrolitern pro Minute in den PCR-Kanal.

Etwa 20 Minuten später, wenn sich die Reagenzien dem Ende des Serpentinkanals nähern, sammeln Sie die PCR-Produkte am Auslass mit einer Pipette und einer Spitze in geeigneter Größe für den hochempfindlichen DNA-Test von Agilent. Nehmen Sie das hochempfindliche DNA-Kit von Agilent 30 Minuten vor dem Test aus dem Kühlschrank. Schalten Sie den Bioanalyzer ein und öffnen Sie die 2.100 Expertensoftware.

Laden Sie einen Mikroliter der PCR-Produkte für den Test und befolgen Sie das Agilent-Protokoll. Analysieren und Aufzeichnen der Daten In diesem Workflow. Die Nasen-Rachen-Probe des Patienten wird mit Lysepuffer gemischt und auf den Chip aufgetragen.

Der Chip wird ausgeführt und die PCR-Produkte des Influenzavirus werden mit einem handelsüblichen Kapillarelektrophorese-Chip rot behandelt. Aufgrund der unterschiedlichen Mengen an Influenzaviren in der Probe jedes Patienten variiert die endgültige Konzentration des PCR-Produkts. Ein gutes Ergebnis sollte ein geringes Rauschen aufweisen, um Leiterspitzen bei 35 und 10, 380 Basenpaar und einen einzelnen Produktpeak bei der vorgesehenen Produktgröße von 107 Basenpaar für die positive Probe zu beseitigen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Mikroflüssigkeitschip hergestellt und ausgeführt wird, um Influenza-A-Viren zu erkennen.