Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

DNA-Doppelstrangbrüche stellen die gefährlichsten DNA-Läsionen dar. Als Reaktion darauf nutzen Zellen zwei primäre Mechanismen für die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, NHEJ und HR. Die getrennte Quantifizierung der Effizienz von NHEJ und HR ist entscheidend für die Erforschung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die mit ihnen verbunden sind. Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind etablierte Methoden zur Messung der Effizienz von NHEJ und HR. Diese Methoden beruhen auf sorgfältig entworfenen Plasmiden, die ein gestörtes grün fluoreszierendes Proteingen mit Erkennungsstellen für die Endonuklease I-SceI zur Induktion von DSBs enthalten.

Der NHEJ-Assay und der HR-Assay können mit einem chromosomal integrierten oder extrachromosomalen Ansatz durchgeführt werden. Der chromosomal integrierte Ansatz ermöglicht die Analyse der DSB-Reparatur innerhalb eines chromosomalen Wettbewerbs. Der chromosomal integrierte Ansatz erfordert jedoch eine verlängerte Zelldauer und ist für vergleichende Studien mit mehreren Zelllinien ungeeignet.

In diesem Protokoll beschreiben wir die extrachromosomalen NHEJ- und HR-Assays, die eine transiente Transfektion der gestörten GFP- und I-SceI-Plasmide in HEK-293T-Zellen und eine anschließende durchflusszytometrische Analyse beinhalten. Diese nicht integrierten Reporter-Assays wurden von mehreren Labors, einschließlich unserem, zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und der HR-Effizienz eingesetzt. Im Gegensatz zum chromosomal integrierten Ansatz ermöglicht dieser extrachromosomale Ansatz eine schnelle Analyse der NHEJ- oder HR-Effizienz durch die Verwendung etablierter, stabiler Zelllinien.