Name: Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die Analyse von NHEJ- und HR-Reparatureffizienz in HEK-293T-Zellen mit GFP-basierten Reportersystemen. Diese extrachromosomalen Assays ermöglichen die schnelle Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbruchreparaturmechanismen durch Flusszytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde von der Natural Science Foundation der chinesischen Provinz Heilongjiang (YQ2022C036) und der Graduate Innovation Foundation der Qiqihar Medical University (QYYCX2022-06) finanziert. Abbildung 1 erstellt mit MedPeer.

1. Isolierung von Plasmiden
<ol><li>Transformieren Sie kompetente E. coli mit den Plasmiden EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-SceI-exprimierendes Plasmid) und PCI2-HA-mCherry (mCherry-exprimierendes Plasmid) (siehe Materialtabelle) nach dem Standard-Transformationsprotokoll20. HINWEIS: PCI2-HA-mCherry kann durch andere mCherry oder DsRed exprimierende Plasmide substituiert werden.</li>
	<li>Die transformierten E. coli werden in 500 mL flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln kultiviert.</li>
	<li>Isolieren Sie die Plasmide mit einem im Handel erhältlichen endotoxinfreien Plasmid-Maxi-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Plasmidkonzentrationen mit Nanotropfen-Mikrovolumen-Spektralphotometern. Stellen Sie die Plasmidkonzentration auf 1 μg/μl ein.</li>
</ol>2. Zellvorbereitung und Transfektion
<ol><li>Kultivierung von HEK-293T-Zellen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum. Stellen Sie sicher, dass sich die HEK-293T-Zellen oder etablierten stabilen HEK-293T-Zellen in einem guten Wachstumszustand befinden. HINWEIS: Gefrorene Zellen sollten vor der Transfektion mindestens zwei Teilungsrunden durchlaufen.</li>
	<li>Am Tag vor der Transfektion werden HEK-293T-Zellen in einer 6-Well-Platte bei 2 × 105 Zellen/Well gesät, um am nächsten Tag eine Konfluenz von etwa 60 % zu erreichen.</li>
	<li>Bestätigen Sie am Tag der Transfektion die Zellkonfluenz, wobei Sie auf etwa 60 % abzielen. Für den NHEJ-Assay transfizieren Sie die experimentellen Probenzellen in einer 6-Well-Platte mit 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI und 1 μg PCI2-HA-mCherry-Plasmiden unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Ersetzen Sie für den HR-Assay das EJ5-GFP-Plasmid durch das DR-GFP-Plasmid.</li>
	<li>Lassen Sie für FACS-Kalibrierungskontrollen eine Vertiefung mit Zellen als Negativkontrolle undurchtrennt. Transfizieren Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte entweder mit (1) 1 μg EJ5-GFP (für NHEJ-Assay) oder 1 μg DR-GFP (für HR-Assay) zusammen mit 1 μg pCBASceI als einfarbige GFP-Kontrolle oder (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry als einfarbige mCherry-Kontrolle.</li>
</ol>3. Analyse der GFP-positiven und mCherry-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Zwei Tage nach der Transfektion bestätigen Sie die Expression von GFP- und mCherry-Proteinen mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Entfernen Sie drei Tage nach der Transfektion das Medium aus den Vertiefungen, waschen Sie es einmal mit PBS und geben Sie 500 μl Trypsin in jede Vertiefung. 5 min bei 37 °C inkubieren, um alle Zellen von der Platte zu lösen. Schirmen Sie die Zellen während dieses und der folgenden Schritte vor direktem Licht ab.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl vollständiges DMEM-Medium in jede Vertiefung, resuspendieren Sie die Zellen und stellen Sie sicher, dass keine Klumpen sichtbar sind.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 2 Minuten lang bei 1000 × g bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren und waschen Sie ihn einmal mit 1,0 mL PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie erneut vorsichtig den Überstand durch Pipettieren, resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS und übertragen Sie die Zellen in FACS-Röhrchen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie unmittelbar nach der Zellernte mit der Durchflusszytometrie-Analyse. Alternativ können die Zellen auch mehrere Stunden auf Eis gelagert werden.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das FACS mit untransfizierten Zellen (Negativkontrolle), EJ5-GFP/DR-GFP und pCBASceI-transfizierten Zellen (GFP-Einfarbkontrolle) und mCherry-transfizierten Zellen (mCherry-Einfarbkontrolle). Passen Sie Spannung und Kompensation an, um den Fluoreszenz-Spillover zwischen GFP und mCherry zu minimieren.</li>
	<li>Erfassen und erfassen Sie mindestens 10.000 intakte Zellen aus jedem Röhrchen.</li>
</ol>4. Datenanalyse
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden mit der FlowJo-Software (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um die FACS-Daten zu analysieren. Vergleichbare Verfahren können in alternativer Analysesoftware ausgeführt werden.
<ol><li>Ziehen Sie alle FACS-Dateien in das Dashboard. Doppelklicken Sie auf eine der Dateien, um den FSC/SSC-Plot anzuzeigen.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Polygon-Tor, um intakte Zellen auszuwählen, ohne Ablagerungen in der unteren linken Ecke. Nennen Sie diese Teilpopulation "Intakte Zellen" und ziehen Sie dieses Tor in die Leiste "Alle Stichproben". Scrollen Sie mit der Schaltfläche "Nächste Probe" durch jede Probe, um ein geeignetes Gating für jede Probe sicherzustellen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Subpopulation Intakte Zellen der negativen Kontrollprobe (nicht transfizierte Zellen), um ein neues Diagramm aufzurufen. Ändern Sie die Achsen in FL1-H (x-Achse, GFP) und FL2-H (y-Achse, mCherry).</li>
	<li>Wählen Sie das Quad-Gating-Werkzeug aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation (Abbildung 2B). Ziehen Sie die vier rechteckigen Tore in die Leiste "Intakte Zellen". Scrollen Sie mit der Schaltfläche "Nächste Probe" durch die Proben der einfarbigen GFP-Steuerung oder der einfarbigen mCherry-Kontrolle, um ein geeignetes Gating für die Unterscheidung von GFP-positiven oder mCherry-positiven von negativen Kontrollzellen sicherzustellen (Abbildung 2C, D). Passen Sie bei Bedarf die Feinabstimmung des Quadranten-Gating an und wenden Sie dieses Gating auf alle "intakten Zellen" Populationen an.</li>
	<li>Klicken Sie auf den Layout-Editor. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die repräsentativen Diagramme, und wählen Sie In Layouteditor kopieren. Wählen Sie alle repräsentativen Diagramme aus, und doppelklicken Sie dann, um die Diagrammdefinition zu öffnen. Passen Sie die Achsenbeschriftung, die Beschriftung und die Legende wie gewünscht an.</li>
	<li>Der Prozentsatz der mCherry-positiven Zellen in experimentellen Proben dient als Kontrolle der Transfektionseffizienz. Berechnen Sie die relative DNA-Reparatureffizienz, indem Sie die Anzahl der GFP-positiven Zellen mit der Anzahl der mCherry-positiven Zellen im selben Diagramm vergleichen.</li>
</ol>

FACS-Analyse von GFP- und mCherry-Reporterzellen zur Bewertung der NHEJ- und HR-Effizienz

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Die hier beschriebene Methode wurde in mehreren Arbeiten zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und der HR-Effizienz 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19 eingesetzt. Diese Methode ist relevant, um die zugrunde liegenden Mechanismen der DNA-DSB-Reparatur aufzuklären und neue Faktoren zu identifizieren, die mit NHEJ und HR assoziiert sind. Zum Beispiel die Funktion der DNA-abhängigen katalytischen Proteinkinase-Untereinheit (DNA-PKcs)9, des Coilin-interagierenden nukleären ATPase-Proteins (hCINAP)10, WASH11, des Retinsäure-induzierbaren Gens I (RIG-I)12, des kreuzkomplementären Röntgenreparaturproteins 4 (XRCC4)12, des HORMA-Domänen-haltigen Proteins 1 (HORMAD1)13, der Ubiquitin-spezifischen Protease 44 (USP44)14und lncRNA NIHCOLE (noncoding RNA induced in hepatocellular carcinoma with an oncogenic role in ligation efficiency) in NHEJ oder HR wurden durch die Anwendung extrachromosomaler Methoden enthüllt oder validiert. Im Gegensatz zum chromosomal integrierten Ansatz ermöglicht dieser extrachromosomale Ansatz eine schnelle Analyse der NHEJ- oder HR-Effizienz durch die Verwendung etablierter stabiler Zelllinien.
Die extrachromosomalen NHEJ- und HR-Assays, die zuvor von uns und anderen 10,11,12 in HEK-293T-Zellen verwendet wurden, wurden auch von mehreren anderen Forschungsgruppen in verschiedenen Zelllinien eingesetzt, darunter U2OS-Zellen 16,17, embryonale Karzinomzellen17,19, HCT116-Zellen 9, SUM159-Zellen13, HCC1143-Zellen13, MDA-MB-436-Zellen13, SUNE1-Zellen14, Huh7-Zellen18 und JHH6-Zellen18. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der NHEJ- und HR-Assays, die in HEK-293T-Zellen durchgeführt wurden. Angesichts der bemerkenswerten Transfektionseffizienz von HEK-293-Zellen wird eine Kombination von 1 μg EJ5-GFP oder 1 μg DR-GFP zusammen mit 1 μg pCBASceI für HEK-293T-Zellen, die in einer 6-Well-Platte kultiviert werden, als ausreichend erachtet. Die Transfektionsbedingungen können jedoch in anderen Zelllinien als HEK-293T 9,16,17 unterschiedlich sein, so dass der Prüfarzt die genauen Bedingungen für eine erfolgreiche Transfektion sorgfältig bestimmen muss.
Das Erreichen der erforderlichen Zellkonfluenz vor der Transfektion ist ein zentrales Verfahren im Protokoll. Eine unzureichende oder übermäßige Anzahl von Zellen kann die Wirksamkeit der Transfektion erheblich beeinträchtigen. Eine unzureichende Anzahl von Zellen verschlimmert die Toxizität nach der Transfektion und erschwert damit die genaue Bewertung der DSB-Reparatur. Darüber hinaus ist es wichtig, die gleiche Mischung aus Plasmiden und Transfektionsreagenz innerhalb eines Experiments zu verwenden, da Abweichungen in der Mischung von EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry und Transfektionsreagenz das Ergebnis möglicherweise beeinflussen können.
Neben NHEJ und HR wurden das alternative Endfügen (a-EJ) und das Einzelstrangglühen (SSA) als zusätzliche Mechanismen für die Reparatur von DSBs identifiziert. In Wildtyp-Zellen sind NHEJ und HR jedoch die primären Signalwege für die DSB-Reparatur, während a-EJ und SSA in dieser Hinsicht nur einen geringen Beitrag leisten. Es ist erwähnenswert, dass der NHEJ-Assay unter Verwendung des EJ5-GFP-Plasmids sowohl NHEJ- als auch a-EJ-Ereignisse erkennt und daher als Assay für Gesamt-NHEJ betrachtet werden kann, einschließlich sowohl NHEJ als auch a-EJ5. Eine individuelle Analyse von a-EJ kann einfach durch den Austausch des EJ5-GFP durch den EJ2-GFP18 erreicht werden. Ähnliche Assays könnten auch durchgeführt werden, um die Reparatureffizienz von SSA zu analysieren, indem der gestörte GFP-Reporter durch hprtSAGFP21 ersetzt wird.

Ein DNA-Doppelstrangbruch (DSB) ist die schädlichste Form von DNA-Schäden, die zu Genominstabilität, chromosomalen Umlagerungen, zellulärer Seneszenz und Zelltod führen kann, wenn sie nicht sofort repariert wird1. Zwei gut etablierte Signalwege, die nicht-homologe Endbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR), sind für ihre Wirksamkeit bei der Adressierung von DNA-DSBs bekannt 2,3. HR gilt als fehlerfreier Mechanismus für die DSB-Reparatur, wobei homologe Sequenzen im Schwesterchromatid als Vorlage verwendet werden, um die ursprüngliche Konfiguration des verletzten DNA-Moleküls3 wiederherzustellen. NHEJ hingegen ist ein fehleranfälliger DSB-Reparaturweg, der die defekten DNA-Enden verbindet, ohne sich auf eine Vorlage2 zu verlassen.
Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind klassische Methoden, die ursprünglich in Jasins Labor am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center entwickelt und zur Quantifizierung der Effizienz von NHEJ bzw. HR verwendet wurden 4,5,6,7. Diese Assays spielen eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die mit NHEJ und HR verbunden sind 8,9,10,11,12,13,14. Beide Assays beruhen auf der Implementierung von zwei gestörten GFP-Reportern, EJ5-GFP und DR-GFP, um die Reparatur von DSBs zu überwachen, die durch die I-SceI-Endonukapase induziert werden. Der EJ5-GFP-Reporter wird im NHEJ-Assay verwendet, während der DR-GFP-Reporter im HR-Assay verwendet wird. Jeder Reporter ist subtil so gestaltet, dass die I-SceI-induzierten DSBs nur durch einen spezifischen Reparaturweg repariert werden können, um eine GFP-Expressionskassette wiederherzustellen 4,5.
Der NHEJ-Assay und der HR-Assay können entweder mit einem chromosomal integrierten oder einem extrachromosomalen Ansatz durchgeführt werden15,16. Der chromosomal integrierte Ansatz erfordert die Integration der gestörten GFP-Reporter in das Genom, was die Analyse der DSB-Reparatur im chromosomalen Kontext ermöglicht 6,15. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine verlängerte Zellpassage und ist für vergleichende Studien mit mehreren Zelllinien aufgrund willkürlicher chromosomaler Integration ungeeignet, was neben den inhärenten Unterschieden einen zusätzlichen Störfaktor mit sich bringt. In diesem Protokoll beschreiben wir den extrachromosomalen NHEJ-Assay und die HR-Assays, die die transiente Transfektion der gestörten GFP- und I-SceI-Plasmide in HEK-293T-Zellen beinhalten, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse (der Arbeitsablauf des Experiments ist in Abbildung 1 dargestellt). Diese nicht integrierten Reporter-Assays wurden ursprünglich von Jasins Labor zur Untersuchung der DNA-Vernetzungsreparatur16 gemeldet und wurden von mehreren Laboratorien 9,10,11,12,13,14,17,18,19, einschließlich unseres Labors 11, zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und HR-Effizienz eingesetzt . Diese extrachromosomalen Ansätze erleichtern die Analyse der DSB-Reparatur in vergleichenden Studien mit mehreren etablierten stabilen Zelllinien.

<table><tbody><tr><td>6 cm Schalen&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>Arbeitskonzentration: 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DH5&alpha; Kompetente Zellen</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>alternatives endotoxinfreies Plasmid-Extraktionskit kann verwendet werden</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>Biosciences BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>alternative Analysesoftware kann verwendet werden</td></tr><tr><td>HEK-293T-Zellen</td><td>Nationale Infrastruktur für Zelllinien Ressource</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>alternative Transfektionsregenten können verwendet werden</td></tr><tr><td>: PBS</td><td>Biosharp</td><td>, BL601A</td><td></td></tr><tr><td>, pCBASceI,</td><td>Addgene</td><td>26477</td>, <td>I-SceI, exprimierendes Plasmid</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td><td>, alternative Plasmide, die DsRed enthalten, können verwendet werden</td></tr><tr><td>: Trypsin</td>, <td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der nicht-homologen endverknüpfung und der homologen rekombinationseffizienz in hek-293t-zellen unter verwendung von gfp-basierten reportersystemen

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen die gefährlichsten DNA-Läsionen dar, die zu einem erheblichen Verlust genetischer Informationen und dem Ableben von Zellen führen können. Als Reaktion darauf nutzen die Zellen zwei primäre Mechanismen für die DSB-Reparatur: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). Die getrennte Quantifizierung der Effizienz von NHEJ und HR ist entscheidend für die Erforschung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die damit verbunden sind. Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind etablierte Methoden, mit denen die Effizienz ihrer jeweiligen Reparaturwege gemessen wird. Diese Methoden beruhen auf sorgfältig entworfenen Plasmiden, die ein gestörtes Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit Erkennungsstellen für die Endonuklease I-SceI enthalten, die DSBs induziert. Hier beschreiben wir den extrachromosomalen NHEJ-Assay und den HR-Assay, bei denen HEK-293T-Zellen mit EJ5-GFP/DR-GFP-Plasmiden, einem I-SceI-exprimierenden Plasmid und einem mCherry-exprimierenden Plasmid co-transfiziert werden. Quantitative Ergebnisse der NHEJ- und HR-Effizienz erhalten Sie durch Berechnung des Verhältnisses von GFP-positiven Zellen zu mCherry-positiven Zellen, wie es durch Durchflusszytometrie gezählt wird. Im Gegensatz zu chromosomal integrierten Assays eignen sich diese extrachromosomalen Assays eher für vergleichende Untersuchungen mit mehreren etablierten stabilen Zelllinien.

Um die Genauigkeit der NHEJ- und HR-Analyse zu gewährleisten, ist die Implementierung einer geeigneten Vergütungsanpassungs- und Gating-Strategie erforderlich. In der Regel manifestiert sich die mCherry-Fluoreszenz im GFP-Detektor nicht, wenn ein 530-nm-Filter verwendet wird. In Fällen, in denen Zellen eine extrem hohe GFP-Expression aufweisen, kann die GFP-Fluoreszenz den mCherry-Detektor jedoch verunreinigen, wenn ein 575-nm-Filter verwendet wird. Um diese Bedenken auszuräumen, wurden Negativkontroll-, GFP-Einfarb- und mCherry-Einfarben-Kontrollproben zur Kompensation und zur Regulierung der Gating-Strategie verwendet. Typische FACS-Ergebnisse der Kontrollzellen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Kompensationsanpassung und die Gating-Strategie sollten die Mehrheit der GFP-positiven Zellen im unteren rechten Quadranten (Abbildung 2C) und die Mehrheit der mCherry-positiven Zellen im oberen linken Quadranten (Abbildung 2D) positionieren.
Die endgültigen repräsentativen Diagramme sind in Abbildung 3A, B dargestellt. Nach der Induktion von DSBs durch I-SceI wird das GFP-Gen durch erfolgreiche Reparaturereignisse rekonstituiert. Der Anteil der GFP-positiven Zellen entspricht somit der Effizienz der DNA-DSB-Reparatur und der Transfektionseffizienz. Der Anteil der mCherry-positiven Zellen entspricht nur der Transfektionseffizienz. Die relative Effizienz der DNA-DSB-Reparatur kann als Verhältnis von GFP-positiven Zellen zu mCherry-positiven Zellen berechnet werden (Abbildung 3C).
Ein konkretes Beispiel für den NHEJ-Assay zur Charakterisierung der Rolle des Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteins und des SCAR-Homologs (WASH) bei der DNA-Reparatur ist in Abbildung 4 dargestellt. In diesem Beispiel haben wir den NHEJ-Assay durchgeführt, um die NHEJ-Effizienz von shControl-Zellen und shWASH-Zellen zu beurteilen (Abbildung 4). Offensichtlich führte der Verlust von WASH zu einer Verringerung der NHEJ-Effizienz, was die Rolle von WASH bei der Förderung der NHEJ-Effizienz bestätigt, wie sie durch den NHEJ-Assay bestimmt wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf für NHEJ/HR-Assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> Abbildung 2: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. (A) FSC-H/SSC-H-Gating an intakten Zellen. (B) Nicht transfizierte HEK-293T-Zellen wurden als Negativkontrolle für den Ausschluss autofluoreszierender Zellen verwendet. (C) HEK-293T-Zellen, die mit EJ5-GFP- und pCBASceI-Plasmiden transfiziert wurden, wurden verwendet, um das Gating für GFP-positive Zellen zu setzen. (D) HEK-293T-Zellen, die mit mCherry-Plasmiden transfiziert wurden, wurden verwendet, um das Gating für mCherry-positive Zellen zu setzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> Abbildung 3: Typische Ergebnisse. (A) Repräsentative Diagramme, die die Analyse des NHEJ veranschaulichen. (B) Repräsentative Diagramme, die die Analyse der HR veranschaulichen. (C) Modelldiagramm der Berechnungsmethode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> Abbildung 4: WASH fördert die NHEJ-Effizienz. (A) Repräsentative Diagramme, die die Analyse der NHEJ-Effizienz in shControl-Zellen und shWASH-Zellen veranschaulichen. (B) Repräsentative statistische Ergebnisse zum Vergleich der NHEJ-Effizienz zwischen shControl- und shWASH-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt einen extrachromosomalen nicht-homologen Endverbindungs-Assay (NHEJ) und einen homologen Rekombinations-Assay (HR), um die Effizienz von NHEJ und HR in HEK-293T-Zellen zu quantifizieren.

Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

DNA-Doppelstrangbrüche stellen die gefährlichsten DNA-Läsionen dar. Als Reaktion darauf nutzen Zellen zwei primäre Mechanismen für die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, NHEJ und HR. Die getrennte Quantifizierung der Effizienz von NHEJ und HR ist entscheidend für die Erforschung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die mit ihnen verbunden sind. Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind etablierte Methoden zur Messung der Effizienz von NHEJ und HR. Diese Methoden beruhen auf sorgfältig entworfenen Plasmiden, die ein gestörtes grün fluoreszierendes Proteingen mit Erkennungsstellen für die Endonuklease I-SceI zur Induktion von DSBs enthalten.Der NHEJ-Assay und der HR-Assay können mit einem chromosomal integrierten oder extrachromosomalen Ansatz durchgeführt werden. Der chromosomal integrierte Ansatz ermöglicht die Analyse der DSB-Reparatur innerhalb eines chromosomalen Wettbewerbs. Der chromosomal integrierte Ansatz erfordert jedoch eine verlängerte Zelldauer und ist für vergleichende Studien mit mehreren Zelllinien ungeeignet.In diesem Protokoll beschreiben wir die extrachromosomalen NHEJ- und HR-Assays, die eine transiente Transfektion der gestörten GFP- und I-SceI-Plasmide in HEK-293T-Zellen und eine anschließende durchflusszytometrische Analyse beinhalten. Diese nicht integrierten Reporter-Assays wurden von mehreren Labors, einschließlich unserem, zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und der HR-Effizienz eingesetzt. Im Gegensatz zum chromosomal integrierten Ansatz ermöglicht dieser extrachromosomale Ansatz eine schnelle Analyse der NHEJ- oder HR-Effizienz durch die Verwendung etablierter, stabiler Zelllinien.

analysis-nonhomologous-end-joining-homologous-recombination

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte...

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

Wir stellen eine Methode zur Prüfung von BRCA1-Varianten in einer Gewebekultur basierter Assay für die homologe Rekombination Reparatur von DNA-Schäden, die durch abbauende endogenen BRCA1-Protein aus einer Zelle mit RNAi und ersetzt sie mit einer BRCA1 Punktmutante, dass eine Codierung ändern enthält.

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

Die HO-stimulierte Translokation Assay überwacht Einzelstrang-Glühen nach der Gründung von DNA-Doppelstrangbrüche an mehreren Loci in...

Quantifizierung und Analyse der Bildung von HO-Endonuklease Stimulated chromosomalen Translokationen von Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Hier wird das sgRNA/CAS9-Endonuklease- und Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um die Mutationen zu identifizieren, die mit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind.

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Hier beschreiben wir eine Methode zur zellbasierten Visualisierung, subzellulären Lokalisierung und quantitativer Analyse von poly(ADP-ribose) (PAR)-angereicherten Fokussen in fixierten Säugetierzellen. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung von Stellen mit DNA-Schaden-induzierter PARP-Aktivierung, einschließlich derjenigen, die mit der Basen-Exzisionsreparatur oder der Reparatur eines Einzelstrangbruchs verbunden sind, in den Kkernen von genotoxin-exponierten Zellen.

Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Lernen Sie die Analyse von NHEJ- und HR-Reparatureffizienz in HEK-293T-Zellen mit GFP-basierten Reportersystemen. Diese extrachromosomalen Assays ermöglichen die schnelle Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbruchreparaturmechanismen durch Flusszytometrie.

Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen (Video) | JoVE Journal

Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

Weitere Videos entdecken