Name: Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Probenpräparation von retinalen Organoiden für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse synaptischer Ultrastrukturen auf Nanometerskala.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimiertes Protokoll für die Vorbereitung von retinalen Organoid-Proben für TEM

<ol><li>Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+pluripotent+stem+cells+to+model+and+treat+inherited+degenerative+diseases+of+the+outer+retina%3A+3d-organoids+limitations+and+bioengineering+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions.</a> Cells. 10 (9), 2489(2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribbon+synapses+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Ribbon synapses of the retina.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%3A+The+organization+of+the+retina+and+visual%22">Webvision: The organization of the retina and visual</a>. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).</li>
<li>Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maintenance+and+restoration+in+the+retina+by+ngl2%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2.</a> Elife. 7, e30388(2018).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746 (2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
<li>Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-chip+for+therapy+development+and+fundamental+science%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human-on-chip for therapy development and fundamental science.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).</li>
<li>Chahine Karam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ipsc-derived+retinal+organoids+and+retinal+pigment+epithelium+for+novel+intronic+rpgr+variant+assessment+for+therapy+suitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability.</a> J Pers Med. 12 (3), 502(2022).</li>
<li>Lo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+for+glaucoma+and+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies.</a> Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3d+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686(2019).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).</li>
<li>Cora, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cleared+view+on+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A cleared view on retinal organoids.</a> Cells. 8 (5), 391(2019).</li>
<li>Żak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%E2%94%80development%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives.</a> Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).</li>
<li>Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+foveola+reinvestigated%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the foveola reinvestigated.</a> PeerJ. 6, e4482(2018).</li>
<li>Syrbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cells+of+the+primate+foveola%3A+An+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study.</a> Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+receive+cone+photoreceptor+inputs+through+both+invaginating+synapses+and+flat+contacts+in+the+mouse+and+guinea+pig+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas.</a> J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+rpgra+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%CE%B1-synuclein+in+the+mouse+retina+is+confined+to+inhibitory+presynaptic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements.</a> J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+degeneration+of+photoreceptor+synapse+in+ccl2%2Fcx3cr1-deficient+mice+on+crb1%28rd8%29+background%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background.</a> Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).</li>
<li>De Robertis, E., Franchi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+on+synaptic+vesicles+in+synapses+of+the+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones.</a> J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).</li>
<li>Frey, T. G., Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+structure+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The internal structure of mitochondria.</a> Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+retinal+organoids+recapitulate+disease+features+of+late-onset+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).</li>
<li>Afanasyeva, T. aV., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+into+retinal+organoids%3A+Methods%2C+analytical+techniques%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-395251</td><td></td></tr><tr><td>Kupfergitter</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AZH400HH</tr><tr><td>DigitalMicrograph Software</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>#07913</td><td>Bakterielle Protease</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>Gibco</td><td>#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungsschimmel</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GZ10592</tr><tr><td>Epon-812 Harz</td><td>Elektronenmikroskopie-Wissenschaft</td><td>#14900</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biologische Industrie</td><td>#04-0021A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd-Elektronenmikroskopie-Wissenschaft</td><td>16020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Shownin Biotechnology Co., Ltd.</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GZ02618</tr><tr><td>L-GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050061</td><td>L-Glutamin-Ersatz</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Eine Komponente von PB/PBS</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Ein Bestandteil von PB/PBS</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Sigma</td><td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Labor Binokulares biologisches Mikroskop</td><td>Xsz-107bnii</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Bluepard</td><td>BPG9040A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Elektronenmikroskopie</td><td>Science</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Halb-/ultradünnes Mikrotom</td><td>Reichert-Jung</td><td>396649</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>#T0625</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Sangon Biotech</td><td>E670105-0100</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskope</td><td>HITACHI</td><td>H-7500</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma 444203</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung von retinalen organoidproben für die transmissionselektronenmikroskopie

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Die Etablierung von 3D-ROs durch iPS-Differenzierung bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von Netzhauterkrankungen und der Stammzellersatztherapie. Obwohl andere die synaptischen Verbindungen in ROs funktionell und immunzytochemisch nachgewiesen haben, ist die direkte Evidenz von konventionellen und Bandsynapsen sehr begrenzt. Hier stellen wir eine Methode vor, mit der die Ultrastruktur von zwei Arten von Synapsen in ROs mittels TEM untersucht werden kann. Nach 180 Tagen Kultur wurden die ROs fixiert, gefärbt, eingebettet und ultradünn geschnitten. Die TEM-Beobachtung zeigte Bandsynapsen an den axonalen Enden der Photorezeptoren (Abbildung 1 und Abbildung 2), die im OPL verteilt sind. Unter TEM sphäuten sich Bänder aus Stäbchen um die synaptische Invagination herum und bilden ein hufeisenförmiges Profil mit horizontalen Zellen (Abbildung 1). Stäbe haben in der Regel nur ein einzelnes Band, aber Kegel haben mehrere Bänder (Abbildung 2). Zusätzlich wurden klassische chemische Synapsen zwischen Amakrinzellen im IPL beobachtet (Abbildung 3). Unter TEM besteht die chemische Synapse aus drei Teilen: dem präsynaptischen, dem synaptischen Spalt und dem postsynaptischen. Die Zellmembranen, die dem präsynaptischen und postsynaptischen Teil entsprechen, sind etwas dicker als der Rest der Teile, und der schmale Spalt zwischen den beiden Membranen wird als synaptischer Spalt bezeichnet. Es gibt viele synaptische Vesikel im Zytoplasma der präsynaptischen Membranstelle. Diese Studie bestätigt das Vorhandensein vollständiger synaptischer Verbindungen in 3D-ROs, die von iPSC abgeleitet wurden. Es ist jedoch zu beachten, dass ein unvollständiges Spülen zwischen den Schritten zur Ausfällung von schwarzen Partikeln während des Prozesses der Probenvorbereitung führen würde (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig01.jpg"> Abbildung 1: TEM-Bilder von Stäbchenbandsynapsen in ROs. (A,B) Stäbchen und horizontale Zellen bilden ein hufeisenförmiges Profil. Ein einzelnes Band (Pfeilspitzen) wurde an jedem Stabkügelchen in der OPL von ROs beobachtet, das von zahlreichen Vesikeln umgeben war. Maßstabsleisten = 0,2 μm. Abkürzungen: ROs = retinale Organoide; HC = horizontale Zelle; OPL = äußere plexiforme Schicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig02.jpg"> Abbildung 2: TEM-Bilder von Zapfenband-Synapsen in ROs. Drei Bandsynapsen (Pfeilspitzen) waren an einem Kegelstiel in der OPL von ROs sichtbar. Maßstabsleiste = 0,2 μm. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; ROs = Netzhaut-Organoide; OPL = äußere plexiforme Schicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig03.jpg"> Abbildung 3: TEM-Bild von chemischen Synapsen in ROs. Eine konventionelle chemische Synapse wurde zwischen Amakrinzellen in der IPL-Schicht von ROs beobachtet. Die chemische Synapse besteht aus drei Teilen: dem präsynaptischen, dem synaptischen Spalt und dem postsynaptischen. Es gibt viele synaptische Vesikel im Zytoplasma der präsynaptischen Membranstelle. Ein Pfeil zeigt die Richtung der synaptischen Übertragung an und zeigt den Transfer zahlreicher Vesikel von einem AC1-Prozess zu einem anderen AC2-Profil an. Maßstabsleiste = 0,2 μm. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; ROs = Netzhaut-Organoide; IPL = innere plexiforme Schicht; ACs = amakrine Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig04.jpg"> Abbildung 4: Ein Beispiel für ein Problem, das während des Prozesses der Probenvorbereitung auftreten kann. Es gibt viele schwarze Partikel (Kreise) im Kegelstiel, weil das Spülen zwischen den Schritten unvollständig ist. Pfeile: Bandsynapse. Maßstabsleiste = 0,2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

preparing-retinal-organoid-samples-for-transmission-electron

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Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für unser Verständnis der Entwicklung und Alterung. Die anatomische Organisation des Primas Netzhaut kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern.

Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Dieses Video Artikel veranschaulicht die Einrichtung von organotypischen Retina wholemount Kulturen und einer Cytospin Verfahren zur Analyse von exogen induzierten Effekte. Organotypischen Retina wholemount Kulturen imitieren...

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Diese Studie zielt darauf ab, ein neuartiges humanes organotypisches Netzhautkulturmodell (HORC) zu entwickeln, das eine Beeinträchtigung der Netzhautintegrität während der Behandlung mit Explanten verhindert. Dies wird erreicht, indem die Netzhaut mit dem darüber liegenden Glaskörper und dem darunter liegenden retinalen Pigmentepithel-Choroid (RPE-Choroid) und Sklera kultiviert wird.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.

Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Vorbereitung von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf den strukturellen Merkmalen retinaler Photorezeptorterminalien liegt.

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll kombiniert optisches Clearing und Immunmarkierung für die konfokale Bildgebung des gesamten Volumens von Netzhautorganoiden in der gesamten Halterung. Es bewahrt die 3D-Struktur und ermöglicht eine detaillierte Visualisierung wichtiger neuronaler Signalwege und verbessert die Untersuchung der Netzhautreifung, der räumlichen Organisation und ihrer potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin.

Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Erfahren Sie die optimierte Probenpräparation von retinalen Organoiden für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse synaptischer Ultrastrukturen auf Nanometerskala.

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

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