Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie
7. Juni 2024
Dieses Protokoll bietet ein optimiertes und aufwändiges Präparationsverfahren für retinale Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Es eignet sich für Anwendungen, die die Analyse von Synapsen in reifen retinalen Organoiden beinhalten.
Unsere Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die Analyse der synaptischen Ultrastruktur in reifen retinalen Organoiden. Unser Ziel ist es, eine reproduzierbare und unkomplizierte Methode zur Probenvorbereitung von Netzhaut-Organoiden (TEM) für Netzhaut-Organoide zu entwickeln, die für das Gebiet der Netzhaut-Organoid-Forschung von großem Nutzen sein könnte. Im Vergleich zu anderen Techniken wie dem optischen Mikroskop bietet das Transmissionselektronenmikroskop die Möglichkeit, die Ultrastruktur der integralen Synapse und der subzellulären Organellen in Netzhautorganoiden auf nanoskaliger Ebene zu charakterisieren.
Unser Protokoll bietet optimierte Bedingungen für die Probenvorbereitung von Netzhautorganoiden durch das Transmissionselektronenmikroskop und liefert einfache und benutzerfreundliche Statistiken. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich die Ultrastrukturmorphologie der Synapse innerhalb von retinalen Organoiden, einschließlich der konventionellen Synapse und der Bandsynapse. Damit wird eine solide Grundlage geschaffen und eine reproduzierbare Methode für die anschließende funktionelle Untersuchung von retinalen Organoiden sowie die Evaluation ihrer klinischen Anwendungen wie z.B. das Drug Screening vorgestellt.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes Verfahren zur Probenvorbereitung retinaler Organoiden für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Die Studie konzentriert sich auf die Analyse der synaptischen Autostruktur in ausgereiften retinalen Organoiden und stellt eine benutzerfreundliche Methode bereit, die eine detaillierte subzelluläre Analyse auf Nanoskala-Ebene ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Retinale Biologie
- Elektronenmikroskopie
Hintergrund
- Retinale Organoiden dienen als wertvolle Modelle zur Untersuchung retinaler Strukturen und Funktionen.
- Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ermöglicht die hochauflösende Abbildung zellulärer Bestandteile.
- Ziel der Studie ist es, die Probenvorbereitung für die TEM zu verbessern, um detaillierte Analysen durchführen zu können.
- Reife retinale Organoiden weisen synaptische Strukturen auf, die mit dieser Methode charakterisiert werden können.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren und einfachen Methode zur TEM-Probenpräparation von Netzhautorganoiden.
- Beurteilung der ultrasruckturellen Morphologie von Synapsen in diesen Organoiden.
- Vorbereitung der Grundlagen für funktionelle Untersuchungen und klinische Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnenen Netzhaut-Organoide.
- Das Protokoll umfasst Fixierung, Färbung, Dehydrierung und Einbettungsschritte, die auf die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) abgestimmt sind.
- Zu den zentralen Schritten gehören die Osmium-Färbung, die gestufte Dehydrierung und die Einbettung in Epoxidharz.
- Die Beobachtungen erfolgen nach der Probenvorbereitung mittels eines Dünnschnittmikrotoms und der optischen Mikroskopie.
Hauptergebnisse
- Die Methode stellt sowohl konventionelle als auch Band-Synapsen in den Netzhaut-Organoiden erfolgreich dar.
- Die ultrastrukturellen Morphologien sind deutlich abgegrenzt und schaffen eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen.
- Die Ergebnisse untermauern die Reproduzierbarkeit der Methode und ermöglichen anschließende funktionelle Studien.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie ermöglicht eine detaillierte Analyse synaptischer Strukturen in retinalen Organoiden mittels TEM.
- Die optimierte Probenvorbereitungsmethode erleichtert zukünftige Forschungsarbeiten zu funktionellen retinalen Organoiden.
- Die Auswirkungen reichen von einem besseren Verständnis neuronaler Mechanismen bis hin zu potenziellen klinischen Anwendungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels hochauflösender ultrasrucktureller Analyse von Netzhaut-Organoiden lassen sich Mechanismen entrisiken und Zielstrukturen in der frühen ophthalmologischen Wirkstoffforschung validieren. Protokolle zur Probenvorbereitung von Netzhaut-Organoiden für die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) liefern reproduzierbare, quantitative Einblicke in die synaptische Architektur und stützen so die Vorhersagekraft in krankheitsrelevanten Systemen. Diese Fähigkeit stärkt die translationale Kontinuität von der Entdeckungsbiologie bis zur präklinischen Modellbewertung in Forschungsportfolios zur Netzhaut.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung der synaptischen Ultrastruktur zur funktionellen Zielstrukturvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung durch Unterscheidung von Riebelsynapsen und konventionellen Synapsen in Organoidmodellen.
- Liefert quantitative morphologische Referenzgrößen für Hypothesentests in der retinalen Biologie.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Probenvorbereitungs-Workflows für konsistente nachgeschaltete Bildgebungsanalysen.
- Erleichtert die reproduzierbare Beurteilung der Organoidreifung und synaptischen Integrität.
- Ermöglicht die Standardisierung des Probenumgangs für skalierbare Screening-Verfahren von retinalen Phänotypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ordnet die Ultrastruktur von Organoiden krankheitsrelevanten, humanen Netzhautmerkmalen zu, um translationsfähige Biomarker zu entwickeln.
- Unterstützt die Kontinuität von der In-vitro-Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste morphologische Endpunkte bereitgestellt werden.
- Verringert die biologische Mehrdeutigkeit bei der Modellauswahl für die Entwicklung ophthalmologischer Arzneimittel.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses TEM-Probenpräparationsprotokoll integriert sich in den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase, indem es eine verlässliche morphologische Analyse von aus iPSCs abgeleiteten Netzhaut-Organoiden ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Liefert direkte Nachweise für die Bildung und Reifung synaptischer Kontakte in Organoid-Systemen.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten für den vergleichenden Analysen über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Analytik: Ermöglicht die statistische Auswertung der synaptischen Morphologie und Dichte in experimentellen Kohorten.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Endpunkten durch ultrastrukturelle Übereinstimmung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten, wiederholbaren Protokollablauf, der auf verschiedenen Netzhaut-Organoid-Plattformen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Modellierung von Netzhauterkrankungen und der Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Arbeitsabläufen zur ultrasruckturellen Bildgebung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch von Projekten, indem mechanistische Unsicherheiten in der frühen Forschung reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Netzhautzielen und -modellen für die Weiterentwicklung.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der TEM-Probenpräparation und der Analyse der subzellulären Abbildung voraus.
- Benötigt Zugang zu spezieller Ausrüstung für Fixierung, Einbettung und Mikroskopie.
- Erfordert eine standardisierte Probenvorbereitung und Bildgebungsprotokolle über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann an verschiedene aus iPSCs abgeleitete Organoidsysteme angepasst werden, sofern das Protokoll optimiert wird.
- Hängt von der Qualitätskontrolle der Reagenzien und Einbettungsmaterialien für die Reproduzierbarkeit ab.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
