Name: Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-NK-Zellen gegen Aspergillus fumigatus mit dem Sleeping Beauty-Transposon-System. Diese nicht-virale Methode ermöglicht skalierbare zelluläre Therapien für invasive Pilzinfektionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Dornröschen-Ansatz zur Gewinnung von CAR-NK-Zellen zur Bekämpfung von Pilzpathogenen

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+Human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: Human fungal infections.</a> Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).</li>
<li>Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcome+and+prognostic+factors+associated+with+invasive+pulmonary+aspergillosis%3A+An+11-year+follow-up+report+from+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan.</a> PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).</li>
<li>Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+globally+emerging+azole+resistance+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).</li>
<li>Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+beyond+cancer%3A+Hope+for+immunomodulatory+therapy+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases.</a> Front Immunol. 10, 2711(2019).</li>
<li>Seif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+targeting+Aspergillus+fumigatus+are+effective+at+treating+invasive+pulmonary+aspergillosis+in+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models.</a> Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lentiviral+vector-based+approach+to+generate+chimeric+antigen+receptor+T+cells+targeting+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 15 (4), e0341323(2024).</li>
<li>Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CAR-T+cells+to+CAR-NK+cells%3A+A+developing+immunotherapy+method+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies.</a> Front Oncol. 11, 720501(2021).</li>
<li>Robertson, M. J., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of human natural killer cells.</a> Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).</li>
<li>Ziegler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD56+is+a+pathogen+recognition+receptor+on+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).</li>
<li>Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+of+chimeric+antigen+receptor+%28car%29+t+versus+car+nk+cell+for+immunotherapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors.</a> Life Sci. 337, 122381(2024).</li>
<li>Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+current+applications+of+chimeric+antigen+receptor-modified+NK-92+cells+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy.</a> Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).</li>
<li>Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-transduced+natural+killer+cells+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy.</a> Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+The+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Amberger, M., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+advances+for+the+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+23+years+of+insomnia+but+prettier+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever.</a> BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).</li>
<li>Ingegnere, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+car+nk+cells%3A+A+new+non-viral+method+allowing+high+efficient+transfection+and+strong+tumor+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing.</a> Front Immunol. 10, 957(2019).</li>
<li>Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+DNA-dependent+cell+death+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages.</a> Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+cellular+immunotherapy%3A+Chimeric+antigen+receptor-natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells.</a> Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 ML Röhrchen mit konischem Boden</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERIL</td></tr><tr><td>50 ML Röhrchen mit konischem Boden</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE</td></tr><tr><td>6- und 96-Well- Zellkulturplatte</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, flache Böden, Behandelt für optimale Zellanhaftung, Sterilisiert durch Gammabestrahlung, Nichtpyrogener</td></tr><tr><td>7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td>leicht zu verwendender Nukleinsäurefarbstoff zum Ausschluss nicht lebensfähiger Zellen in durchflusszytometrischen Assays</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Human-EGFR-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>Klon AY13</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>UltraPure MicroBeads, konjugiert mit monoklonalem Maus-Antibiotin Antikörper</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>Biosphären-Filterspitzen (20 und 100 &mu; L)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&nbsp; Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, Endotoxin,</td></tr><tr><td>geprüft ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-& gamma;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzlösung (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>für die Molekularbiologie, 0,5&nbsp; M in H2O, DNase, RNase, NICKase und Protease, nicht nachgewiesen, 0,2 &mu; m gefiltert.</td></tr><tr><td>FACS clean</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS Flow Swrap Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS Rinse Solution</td><td>BD Bioscience</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, vor Gebrauch hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>Gibco, MEM &alpha;, Nukleoside</td><td>Thermofisher Wissenschaftliche</td><td>22571020</td><td>Phenolrot, Ribonukleoside, Desoxyribonukleoside, Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>Steril gefiltert, vor Gebrauch von Hitze inaktiviert</td></tr><tr><td>Humanes IL-2 IS, Forschungsqualität</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>Forschungsqualität. Der ED50 ist &le; 0,3 ng/ml, entsprechend einer Aktivität von &ge; 3 & mal; 106 IE/mg.</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>aus Streptomyces conglobatus, verwendet als Positivkontrolle für die Zytokinsekretion&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>MACS LS Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp; Säulen und Kolben, steril verpackt</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem 100&nbsp; &mu; L-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Resuspension Puffer R, Elektrolytpuffer E2, 100 &mu; L Neonspitzen, Neon-Elektroporationsröhrchen</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>als Positivkontrolle für die Zytokinsekretion&nbsp;</td></tr><tr><td>Polystyrol-Rundbodenröhrchen, 5 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td><td>für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Reaktionsgefäß, 1,5 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP, transparent, Kappe aufgesetzt, mit injizierter Graduierung. Vor Gebrauch sterilisiert.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I,&nbsp; Phenolrot, HEPES, steril gefiltert</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L XL Verlaufsfilterspitze</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator C60&nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX Mikroplatten-Waschmaschine</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung chimärer antigenrezeptor-natürlicher killerzellen zur bekämpfung von pilzinfektionen mit dem nicht-viralen transposon-system von dornröschen

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

Der gesamte Prozess der Erzeugung von Af-CAR NK-92-Zellen, einschließlich Transfektion, Rückgewinnung, Anreicherung und Expansion, dauert etwa 14 Tage. Nach der Transfektion werden die Zellen jeden zweiten Tag kultiviert und gespalten. Die Zellviabilität kann während der ersten Teilung zwei Tage nach der Transfektion abnehmen. In der Regel erholen sich die Zellen 4 Tage nach der Transfektion und beginnen sich zu vermehren, mit einer Verdopplungszeit von 48 Stunden.
Nach der Genesung wird die Transfektionseffizienz gemessen, die voraussichtlich 10-20 % erreichen wird (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3). Die Anreicherung von EGFR-positiven Zellen über MACS erhöht den Anteil der Af-CAR NK-92-Zellen auf über 95% (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 4).
Für funktionelle Assays wurden Kulturen mit mehr als 95% Af-CAR-Zellen verwendet. Hier haben wir die Zellen mit A. fumigatus Keimröhrchen für 6 h co-kultiviert und die IFN-ɣ-Sekretion als Aktivierungsmarker gemessen. Wie in Abbildung 5 gezeigt, zeigten die Af-CAR-Zellen eine signifikante Zytokinsekretion (Mittelwert = 340,6 ± 86,5 pg/ml) im Vergleich zu Mock-NK-92-Zellen (Mittelwert = 75,6 ± 19,5 pg/ml), was auf eine wesentlich höhere Aktivierung der Af-CAR-Zellen hinweist (p-Wert = 0,03).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Keimschläuche von Aspergillus fumigatus. Mikroskopische Aufnahme von A. fumigatus nach 16 Stunden Inkubation. Keimröhren/kleine Hyphen werden beobachtet und homogen um die Vertiefung verteilt. Maßstabsleiste = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Co-Kultur von Aspergillus fumigatus Keimröhrchen mit NK-92 Zellen. Mikroskopische Aufnahme einer Co-Kultur. Die NK-92-Zellen bilden Cluster und stehen in Kontakt mit den Keimschläuchen von A. fumigatus . Maßstabsleiste = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Bewertung der Transfektionseffizienz durch Färbung für den Transfektionsmarker EGFR. Am Tag 5 wurden nach der Elektroporation NK-92-Zellen mit 7-AAD und Anti-EGFR gefärbt. Die Ergebnisse sind für ein repräsentatives Experiment für (A) Mock- und (B) Af-CAR NK-92-Zellen dargestellt. Die linke Spalte zeigt Punktdiagramme der Zellengröße im Vergleich zur Zellengranularität. das Gate ist auf die NK-92-Zellen gesetzt. Die toten Zellen werden mit Hilfe der 7-AAD-Markierung (zweite Spalte) ausgelagert. Der prozentuale Anteil lebender EGFR+ -Zellen ist in der dritten Spalte angegeben. Abkürzungen: EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; 7-AAD = 7-Aminoactinomycin D; CAR = chimärer Antigenrezeptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Ergebnisse der Zelloberflächenfärbung nach Anreicherung von NK-92-Zellen, die das Transgen exprimieren. Auf der linken Seite werden die Mock-Zellen angezeigt. Auf der rechten Seite sind die Af-CAR-NK-Zellen dargestellt. Die roten Histogramme stellen die ungefärbten Zellen dar. Die blauen Histogramme stellen die entsprechenden gefärbten Zellen dar. Das Gate wird auf die EGFR+ -Zellen gesetzt; Die Zahlen zeigen den prozentualen Anteil positiver Zellen. Abkürzungen: EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; CAR = chimärer Antigenrezeptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Zytokinsekretion von NK-Zellen, die durch Aspergillus fumigatus-Keimschläuche aktiviert werden. Die Diagramme zeigen die Ergebnisse der IFN-ɣ-Sekretion von Af-CAR- und Mock-Zellen in Co-Kultur mit Pilzen, gemessen per ELISA nach 6 h Co-Kultur. Bei den gezeigten Daten handelt es sich um die mittlere ± SD von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (n = 3). P-Wert, berechnet durch Welchs t-Test unter Verwendung von GraphPad Prism 10, * p &lt; 0,05. Abkürzungen: NK = natürlicher Killer; IFN-ɣ = Interferon-Gamma; CAR = chimärer Antigenrezeptor; ELISA = Enzyme-linked Immunosorbent Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Name</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Bestandskonzentration</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposase</td>
			<td>SB100X Mini-Kreis</td>
			<td>PlasmidFabrik</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposon</td>
			<td>Af-CAR-Plasmid</td>
			<td>Hergestellt im eigenen Haus</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete DNA.
Ergänzende Abbildung S1: Plasmidkarte des Af-CAR-Transposons: Schema des Plasmidvektors und Design des CAR-Transposons. Abkürzungen: EF1 = Elongationsfaktor-1 Alpha-Promotor; ORI = bakterieller Ursprung der Replikation; LIR = links invertierte Wiederholung; RIR: rechtsinvertierte Wiederholung; Cyto = zytoplasmatisch; Tm = Transmembran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

engineering-chimeric-antigen-receptor-natural-killer-cells-targeting

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Cas9-Ribonukleoprotein-vermittelten genetischen Modifikation von primären natürlichen Killerzellen (NK). Ein Cas9-Ribonukleoprotein, bestehend aus einer Cas9-Endonuklease, die an eine durch Basenpaarung gebildete Guide-RNA (gRNA) gebunden ist, eine CRISPR-RNA (crRNA) und eine trans-aktivierende crRNA (tracrRNA), wird mittels Elektroporation in primäre natürliche Killerzellen eingebracht. Das Ribonukleoprotein zielt auf die Wirts-DNA ab und spaltet sie...

Eine Technik zur Gen-Editierung in natürlichen Killerzellen mit CRISPR Cas9

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe...

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Hier stellen wir eine Methode zur Differenzierung und Erweiterung von humanen iPSC-abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierenden natürlichen Killerzellen mit verbesserter Abtötung gegen verschiedene Malignome vor. Dieses Protokoll demonstriert die Differenzierung und Expansion von für natürliche Killer (NK) optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen und die Messung der Antitumoraktivität gegen verschiedene Tumorzelllinien.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-NK-Zellen gegen Aspergillus fumigatus mit dem Sleeping Beauty-Transposon-System. Diese nicht-virale Methode ermöglicht skalierbare zelluläre Therapien für invasive Pilzinfektionen.

Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen (Video) | JoVE Journal

Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

Weitere Videos entdecken