Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer handelsüblichen CAR-Zelltherapie für invasive Pilzinfektionen. Unser Ziel ist es, die besten Ziele, CAR-Designs und Immunzellenkombinationen zu identifizieren, um optimale therapeutische Ergebnisse zu erzielen. Jüngste Entwicklungen, einschließlich unserer eigenen Arbeit, konzentrieren sich auf die Entwicklung von CAR-T-Zelltherapien gegen Aspergillus fumigatus.

Diese gentechnisch veränderten Zellen haben in präklinischen Modellen vielversprechende Ergebnisse gezeigt, indem sie die Pilzlast signifikant reduzierten, die antimykotische Immunität kontrollierten und das Gesamtüberleben verbesserten. Derzeit konzentriert sich der Großteil der Forschung auf diesem Gebiet auf die Herstellung von CAR-T-Zellen, die spezifisch für eine sehr begrenzte Anzahl von Zielen sind, unter Verwendung viraler Vektoren oder des Dornröschen-Transposon-Systems. Die größten Herausforderungen bestehen darin, optimale Ziele für Pilze zu identifizieren und ein gebrauchsfertiges zelluläres Produkt herzustellen, das sowohl wirksam als auch skalierbar für klinische Anwendungen ist.

Mit diesem Protokoll adressieren wir den Bedarf an kostengünstigen und skalierbaren Methoden zur Erzeugung nicht-viraler CAR-NK-Zellen. Es bietet einen zugänglichen Ansatz für das Screening neuer antimykotischer Ziele und stellt einen grundlegenden Schritt in Richtung einer handelsüblichen CAR-NK-Zelltherapie für Pilzinfektionen dar. Überprüfen Sie zunächst die NK-92-Zellen unter dem Mikroskop auf Cluster in einem klaren Hintergrund, geben Sie 2 Milliliter Zellkulturmedium pro Vertiefung für jede Bedingung in eine Sechs-Well-Platte und legen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

8 mal 10 hoch 6 NK-92 Zellen in ein 15 Milliliter konisches Bodenröhrchen umfüllen und das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 G zentrifugieren, mit einer Beschleunigung und Verzögerung von 3. Nach dem Verwerfen des Überstands das Röhrchen mit dem Zellpellet mit bis zu 15 Millilitern vorgewärmtem PBS füllen und erneut zentrifugieren. Während der Zentrifugation pipettieren Sie 8 Mikrogramm Af-CAR-Plasmid-DNA und 4 Mikrogramm SB100X-Minikreis in ein Reaktionsröhrchen und halten Sie die DNA des zweiten Röhrchens frei, um als Scheinkontrolle zu dienen.

Für das Transfektionssystem geben Sie 3 Milliliter Elektrolytpuffer in das erste Röhrchen und geben es in die Pipettenstation. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig verworfen und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Resuspensionspuffer resuspendiert. Geben Sie dann je 100 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der beiden Reaktionsgefäße und mischen Sie vorsichtig.

Pipettieren Sie das DNA-Zellgemisch aus dem ersten Reaktionsröhrchen mit der Pipette des Transfektionssystems und führen Sie die Transfektionspipette senkrecht in das Röhrchen in der Pipettenstation ein. Stellen Sie den ersten Impuls auf 1.650 Volt und die Impulszeit auf 20 Millisekunden ein, bevor Sie auf Start drücken, um den Impuls zu starten. Stellen Sie nach dem ersten Impuls den zweiten Impuls auf 500 Volt und die Impulszeit auf 100 Millisekunden ein und initiieren Sie den zweiten Impuls.

Sobald der zweite Impuls abgeschlossen ist, nehmen Sie die Pipette langsam aus der Pipettenstation. Übertragen Sie die Zellen sofort in eine Vertiefung der vorbereiteten Kulturplatte mit 2 Millilitern vorgewärmtem Zellkulturmedium und bewegen Sie die Platte vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nach 30 Minuten Inkubation wird Interleukin-2 in einer Endkonzentration von 150 internationalen Einheiten pro Milliliter in die Vertiefungen gegeben. Transfizieren Sie zunächst die NK-92-Zellen mit dem gewünschten Plasmid. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter konisches Bodenröhrchen.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen und verdünnen Sie sie mit dem Puffer auf eine Konzentration von 1 bis 2 mal 10 auf die Potenz von 6 Zellen pro 100 Mikroliter. Fügen Sie einen Mikroliter Anti-EGFR-T-Biotin pro 1 mal 10 hoch 6 Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie das Röhrchen 25 Minuten lang bei 4 Grad Celsius.

Füllen Sie das Röhrchen nach der Inkubation mit bis zu 10 Millilitern Puffer. Anschließend wird das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 G mit einer Beschleunigung und Verzögerung von 3 zentrifugiert und der Überstand nach der Zentrifugation verworfen. Fügen Sie dann 8 Mikroliter kalten Puffer hinzu, gefolgt von zwei Mikrolitern Anti-Biotin-Magnetkügelchen pro 1 mal 10 mit der Leistung von 6 Zellen.

Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Um die Zellen zu waschen, füllen Sie das Röhrchen mit bis zu 10 Millilitern Puffer und zentrifugieren Sie. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Puffer.

Setzen Sie eine LS-Säule in den Max-Magneten ein und waschen Sie sie mit 3 Millilitern Puffer. Fügen Sie die Zellsuspension hinzu, sobald der Puffer vollständig durch die Spalte migriert ist. Entfernen Sie die Säule nach dem Waschen vom Magneten und legen Sie sie in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden.

Geben Sie 5 Milliliter Puffer in die Säule und spülen Sie mit dem Kolben die EGF-R-positiven Zellen so schnell wie möglich aus. Die Transfektionseffizienz nach der Wiederherstellung erreichte 10 bis 20 % und die maximale Anreicherung erhöhte die Reinheit der Af-CAR-NK-92-Zellen auf über 95 %. Zu Beginn erhalten Sie angereicherte Transgen-exprimierende NK-92-Zellen mit Hilfe der magnetisch aktivierten Zellsortiertechnik. Bereiten Sie dann eine Aspergillus fumigatus Konidiensuspension in einer Konzentration von 2,5 mal 10 hoch 5 Konidien pro Milliliter im Medium vor.

Geben Sie 100 Mikroliter der Konidiensuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Waschen Sie am zweiten Tag die Schein- und Plasmid-transfizierten NK-92-Zellen zweimal mit dem Medium und fügen Sie 5 mal 10 zur Potenz von 4 NK-92-Zellen in 100 Mikrolitern Medium pro Vertiefung der Platte mit dem Pilz zur Co-Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator für mindestens 6 Stunden.

Nachdem Sie die Platte fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert haben, ernten Sie 100 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung, ohne den Boden zu berühren. Übertragen Sie schließlich die Überstände in Reaktionsröhrchen, um den ELISA durchzuführen. Af-CAR-NK-92-Zellen zeigten eine signifikant höhere Interferon-Gamma-Sekretion im Vergleich zu Schein-NK-92-Zellen während der Co-Kultur mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen.