Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins
14. Juni 2018
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.
Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der NK-Zellbiologie über die Rolle und Funktion spezifischer Gene und Signalwege zu beantworten, die die Funktion von Effektorzellen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre hohe Erfolgsrate im Vergleich zu DNA-abhängigen Ansätzen, die einen hocheffizienten Knockout eines der klinisch relevantesten Gene in der NK-Zelltherapie ermöglichen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Immuntherapie von soliden Tumoren und Hirntumoren, die TGF-beta als Mittel zur Immunflucht exprimieren.
Für die primäre NK-Zelltransduktion werden die fünf frisch isolierten NK-Zellen pro Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 100 IE pro Milliliter IL2 pro T75-Kolben, vier Tage lang dreimal 10 inkubiert, wobei das Medium jeden zweiten Tag und am Tag vor der Transduktion ausgetauscht wird. Für eine erweiterte NK-Zelltransduktion stimulieren Sie die primären NK-Zellen am Tag Null mit einer strahlenförmigen, membrangebundenen IL21-exprimierenden K562-Feederzelle im Eins-zu-Eins-Verhältnis, wobei das Medium jeden zweiten Tag und am Tag vor der Transduktion ausgetauscht wird. Am Tag der Elektroporation wird ein T25-Kolben mit acht Millilitern frischem Nährmedium gefüllt, das mit 100 IE pro Milliliter IL2 pro experimenteller Zellbedingung ergänzt wird, und die Kolben in einen befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % CO2 gestellt.
Während das Medium sich im Gleichgewicht befindet, fügen Sie drei- bis viermal 10 zu den sechsten Zellen pro Bedingung pro 26 Mikroliter Transduktion hinzu, mischen Sie es in ein konisches Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie dann die Zellen dreimal in 12 Millilitern sterilem PBS pro Waschgang, um das gesamte FBS aus den Zellsuspensionen zu entfernen. Während die Zellen gewaschen werden, resuspendieren Sie jede CRISPR-RNA und tracrRNA auf 200 mikromolare Endkonzentrationen.
Mischen Sie 2,2 Mikroliter jeder CRISPR-RNA mit einem 200 Mikromolaren Volumen tracrRNA pro Probe und erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Lassen Sie die Proben dann auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie die CRISPR-RNA/tracrRNA-Komplexe bis zu ihrer Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Um die Ribonukleoproteinkomplexe zu bilden, geben Sie Cas9-Endonuklease durch Schwenken über 30 bis 60 Sekunden in den entsprechenden CRISPR-RNA/tracrRNA-Komplex und inkubieren Sie die resultierenden Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten.
Fügen Sie nach der letzten Wäsche das gesamte Volumen des Elektroporationszusatzes aus dem Nucleofector-Lösungskit P3 hinzu und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 20 Mikrolitern der P3-Primärlösung 4D-Nucleofector, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden. Geben Sie sofort fünf Mikroliter jedes Ribonukleoproteinkomplexes in die entsprechende Zellsuspension und fügen Sie einen Mikroliter 100 mikromolaren Cas9-Elektroporationsverstärker zum Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex-Zellmix hinzu. Übertragen Sie 26 Mikroliter der Cas9-Ribonukleoprotein-Zelllösung in einzelne Vertiefungen eines Nukleocuvette-Streifens und klopfen Sie vorsichtig auf den Streifen, um sicherzustellen, dass die Proben den Boden jeder Vertiefung bedecken.
Starten Sie dann das Programm 4D-Nucleofector System EN138. Lassen Sie die Zellen am Ende der Transduktion drei Minuten ruhen. Geben Sie dann 80 Mikroliter des voräquilibrierten Kulturmediums zu jeder Küvette und überführen Sie die Proben vorsichtig in einen Kolben pro Bedingung bei 37 Grad Celsius Inkubation.
Nach 48-stündiger Kultur extrahieren Sie die genomische DNA von fünf mal 10 zu den fünf transduzierten Zellen für das Gendeletionsscreening gemäß Standardprotokollen. Stimulieren Sie dann den Rest der transduzierten Zellen mit frischen membrangebundenen IL21-exprimierenden Feederzellen im Verhältnis eins zu eins und extrahieren Sie die RNA nach fünf Tagen Co-Kultur gemäß Standardprotokollen für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass das EN138-Programm den höchsten Prozentsatz an Zellviabilität und Transduktionseffizienz unter den verfügbaren Nukleofector-Systemprogrammen aufweist.
Mit den kommerziell erhältlichen Guide-RNAs wird beispielsweise humanes HPRT1 erfolgreich in expandierten humanen NK-Zellen ausgeschaltet. Darüber hinaus weisen Cas9-Ribonukleoproteine, die Guide-RNA2, Guide-RNA1 plus Guide-RNA2 und Guide-RNA3 enthalten, einen erfolgreichen TGF-beta-Rezeptor-Zwei-Ektodomänen-Gen-Knockout auf, während Guide-RNA1 allein keine T7E1-nachweisbaren Insertionsdeletionen induziert. Tatsächlich führt die Verwendung des EN138-Programms für die Cas9-Ribonukleoprotein-Elektroporation zu einer 60%igen Verringerung der TGF-beta-Rezeptor-2-mRNA-Expression in Zellen, die über dieses Programm transduziert werden.
Darüber hinaus hat die Co-Kultur der transduzierten Zellen mit TGF-beta und einer humanen primären Medulloblastom-Zelllinie keinen signifikanten Einfluss auf die Zytotoxizität der NK-Zellen im Vergleich zu Kontroll-nicht-TGF-beta-behandelten transduzierten Zellen, was zu einem entsprechenden Mangel an TGF-beta-Rezeptor-2-Funktion in den Cas9-Ribonukleoprotein-modifizierten Zellen auf Proteinebene führt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mehrere verschiedene Guide-RNAs zu entwerfen, um das beste Ergebnis bei der Genbearbeitung zu erzielen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die DNA-Sequenzierung oder der T7E1-Mutationsassay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Effizienz der Geneditierung oder zur Bestimmung potenzieller genetischer Off-Target-Mutationen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie, um das Potenzial für den Einsatz von geneditierten NK-Zellen in der Krebsbehandlung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Genbearbeitung von primären menschlichen NK-Zellen durchführt.
Weitere Informationen zur Expansion der NK-Zellen nach diesem Prozess finden Sie in unserem früheren Jove-Artikel. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer allgemeine Gesundheits- und Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.
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Überblick
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur genetischen Modifizierung menschlicher natürlicher Killer (NK)-Zellen mithilfe von Cas9 Ribonukleoproteinen (Cas9/RNPs) vor. Die Methode ermöglicht die Erzeugung von NK-Zellen, denen TGFBR2 und HPRT1 fehlen, was die Forschung zur NK-Zellbiologie und Immuntherapie erleichtert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Genbearbeitung
Hintergrund
- Natürliche Killer (NK)-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Immunantwort.
- Das Verständnis der Genfunktionen in NK-Zellen kann Immuntherapieansätze verbessern.
- Aktuelle Methoden zur Genbearbeitung in NK-Zellen haben Einschränkungen.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Effizienz des Gen-Knockouts in NK-Zellen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Modifizierung von NK-Zellen zu etablieren.
- Die Rollen spezifischer Gene in der NK-Zellfunktion zu untersuchen.
- Implikationen für die Immuntherapie von soliden Tumoren zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Isolierung und Kultivierung von primären NK-Zellen in RPMI-Medium.
- Transduktion von NK-Zellen unter Verwendung von IL2 und Feederzellen.
- Elektroporation zur Einführung von Cas9/RNPs in NK-Zellen.
- Bewertung der Effizienz und Funktionalität des Gen-Knockouts.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung von NK-Zellen, denen TGFBR2 und HPRT1 fehlen.
- Hohe Erfolgsrate des Gen-Knockouts im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Potenzielle Anwendungen zur Verbesserung der NK-Zelltherapie bei Tumoren.
- Einblicke in die Mechanismen der Immunflucht bei Tumoren.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen robusten Ansatz zur Modifizierung von NK-Zellen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der NK-Zellbiologie und -therapie bei.
- Zukünftige Studien können diese Technik für klinische Anwendungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
