Name: Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Knockout-Generierung in menschlichen NK-Zellen mittels Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und verbessert Ansätze für die Immuntherapie solider Tumoren.

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Wir erkennen Brian Tullius für seine freundliche Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

Gesunden Spenders buffy Coats wurden als Quellenmaterial aus dem Central Ohio Region amerikanischen Roten Kreuz erhalten. Diese Forschung war entschlossen, ausgenommen Forschung werden durch die institutionelle Review Board der bundesweit Kinderkrankenhaus.
1. menschliche NK Zelle Reinigung und Ausbau
<ol><li>PBMCs von Buffy Coat12isolieren.<ol>
<li>35 mL buffy Coat Probe auf 15 mL Ficoll-Paque Schicht.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 400 X g für 20 Minuten ohne Bremse und sammeln die PBMC aus der Schnittstelle.</li>
		<li>Die wiederhergestellten PBMCs dreimal durch Zugabe von mindestens ein gleiches Volumen an PBS waschen, waschen Sie für 5 Minuten bei 400 X g zentrifugieren und Absaugen der PBC. NK-Zellen kann in diesem Stadium von RosettesSep13isoliert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erweitern von NK-Zellen durch die Stimulierung mit bestrahlten 10 x 106 mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen am Tag 0, 7 und 14. Ersetzen Sie Medien mit frischen RPMI mit 10 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 100 IU/mL von Il-2 für die gesamte Medienlautstärke jeden zweiten Tag.</li>
</ol>2. gRNA Design und Auswahl
<ol><li>Wählen Sie die spezifische genomic Loci Ziel mit online-Tools, z. B. NCBI, Ensemble. Beispiel. Beschreibung: Transforming Wachstumsfaktor-Beta-Rezeptor 2 (TGFBRR2) ektodomäne Datensatz anzeigen: PF08917 InterPro anzeigen: IPR015013 Position: 49 157 aa Gezielte Abfolge: Exon 4 des TGFBR2-Gen (ENSG00000163513)</li>
	<li>Um die gRNAs zu entwerfen, nutzen Sie CRISPR-Design-Web-Tools wie http://crispr.mit.edu und "Benchling."<ol>
<li>Geben Sie in die DNA-Sequenz in Schritt 2.1ausgewählt. Wählen Sie Menschen (hg 19) als ein Ziel-Genom. CRISPR-Führer (20 Nukleotiden gefolgt von einer PAM-Sequenz: NGG) wird aus der zuvor eingegebene Sequenz gescannt werden. Es zeigt auch mögliche Ziel Übereinstimmungen in den ausgewählten Genom.</li>
		<li>Wählen Sie die besten drei gRNAs, die die höchste Punktzahl, basierend auf ihre Ziel- und Ziel-Preise haben. Tabelle 1 zeigt beispielsweise der gestalteten CRISPR-RNAs auf Exon 4 des TGFBR2-Gen vorgeschlagen von CRISPR-Design-Web-Tools.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reihenfolge der CRISPR-RNAs als synthetische Sequenz-spezifische CrRNAs.</li>
	<li>Bestellen Sie eine erhaltene transactivating RNA (TracrRNA) durch partiellen Homologie mit dem CrRNA zu interagieren.</li>
</ol>3. Design löschen Screening-Primer
<ol><li>Design-Primer überspannt die gRNA spaltstellen für T7E1 Mutation Assay.</li>
	<li>Einsatz Primer mindestens 100 bp Weg von den vorhergesagten spaltstelle kleine einfügen-Löschung (Indels) an der SgRNA-Ziel-Site sicherzustellen wird auf 1,5 % Agarosegel nach der Mutation Assay angezeigt. Tabelle 2 zeigt die Primer, die verwendet werden, um die TGFBR2 ektodomäne zu verstärken.</li>
</ol>(4) Transduktion von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen
Hinweis: Transduktion von Cas9/RNPs Elemente in NK erfolgt durch Elektroporation mit 4D System wie folgt.
<ol><li>
Zelle Vorbereitung
	<ol>
<li>
Für primäre NK-Zellen, 4 Tage frisch isolierte NK-Zellen in RPMI Medium in Anwesenheit von 100 IE/mL von Il-2 inkubieren und führen die Elektroporation an Tag 5. Ersetzen Sie die Medien täglich, wie zuvor und am Vortag Transduktion beschrieben.</li>
		<li>
Für erweiterte NK-Zellen, stimulieren die Zellen am Tag 0 mit bestrahlten Feeder-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 und die Elektroporation am Tag 5 oder 6 oder 7 durchführen. Ersetzen Sie die Medien täglich, wie zuvor und am Vortag Transduktion beschrieben.</li>
		<li>Am Tag der Elektroporation bereiten Sie ein T25-Fläschchen gefüllt mit 8 mL frisches RPMI, enthält 100 IE/mL von Il-2 für Zellen Electroporation und Pre incubate Fläschchen in einem befeuchteten 37 ° C und 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Aufgetauten Zellen oder Zellen, die 2Nd oder 3rd Stimulation durchlaufen haben können elektroporiert jederzeit nach ihrer Genesung wie beschrieben werden.</li>
		<li>Nehmen Sie 3 bis 4 × 106 Zellen pro Bedingung für 26 µL Transduktion Mix. Hinweis: Sehr hoher Konzentration von NK-Zellen in Elektroporation Lösung verbessert die Transduktion Rate.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, alle FBS zu entfernen die häufigsten RNase Aktivität enthält. Drehen sie jedes Mal bei 300 X g für 8 Minuten. Hinweis: Betrachten Sie 7 Elektroporation Bedingungen für Cas/RNPs als einzigen gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) und eine Kombination von zwei gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + gRNA3) und ein Steuerelement mit keine Cas9/RNPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bilden die CrRNA:tracerRNA / Komplex
	<ol>
<li>CrRNAs (gRNA1, gRNA2 und gRNA3) und TracerRNA in 1 x TE Lösung Endkonzentrationen von 200 μM aufzuwirbeln. Mix-2.2 μL von jeweils 200 μM gRNA mit 200 μM TracerRNA wie in Tabelle 3dargestellt.</li>
		<li>Erwärmen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 min und auf den Tisch auf Raumtemperatur (15-25 ° C) abkühlen lassen. Shop Nukleinsäuretablette RNAs und CrRNA: TracerRNA/Komplex bei-20 ° C für die spätere Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bilden Sie die RNP-Komplex Hinweis: um Zeit zu sparen, bilden komplexe während des Waschens RNP Schritt 4.1.5.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie für einzelne CrRNA:tracrRNA duplex Reaktion Cas9 Endonuklease, 36 μM wie im Beispiel in Tabelle 4gezeigt.</li>
		<li>Für Kombination Transduktion von CrRNA:tracrRNA Maisonetten, verdünnen Cas9 Endonuklease, 36 μM, wie im Beispiel gezeigt Tabelle 5.
</li>
		<li>Hinzufügen Cas9 Endonuklease CrRNA:tracrRNA Duplex langsam während der wirbelnden PIPETTENSPITZE, über 30 s bis 1 Minute.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung bei 15-20 min bei Raumtemperatur. Wenn nicht bereit, die Mischung nach der Inkubation zu verwenden, halten Sie die Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroporation
	<ol>
<li>Die gesamte Ergänzung der Elektroporation Lösung P3 hinzufügen und bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet (3 bis 4 × 106 Zellen aus Schritt 4.1.5) in 20 μL der P3 primäre 4D Elektroporation Lösung. Vermeiden Sie Luftblasen beim pipettieren. Hinweis: die Zellen sollten nicht für eine lange Zeit in P3 Lösung überlassen werden.</li>
		<li>Sofort fügen Sie 5 µL der RNP Komplex (Schritt 4.3 hinzu), die Zellsuspension.</li>
		<li>Mischen Sie 1 μL von 100 μM Cas9 Elektroporation Enhancer an die Cas9/RNPs/Zelle hinzufügen.</li>
		<li>Cas9/RNPs/Zelle Mischung in 20 μL Elektroporation Streifen zu übertragen.</li>
		<li>Klopfen Sie leicht die Streifen um sicherzustellen, dass die Stichprobe die Unterseite der Streifen umfasst.</li>
		<li>Starten Sie 4D Elektroporation System und wählen Sie das EN-138 -Programm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Post Transduktion
<ol><li>Lassen Sie die Zellen in den Streifen 3 Minuten ruhen.</li>
	<li>Die Küvette 80 µL der Pre äquilibriert Kultur Medien hinzu und übertragen Sie sanft die Probe in Flaschen.</li>
	<li>48 Stunden nach Transduktion, Auszug genomischen DNA aus 5 × 105 Zellen für die Gen-Deletionen screening.</li>
	<li>Verstärken Sie das Gen des Interesses unter Verwendung der Zündkapseln in Schritt 3.2 mit Taq-DNA-Polymerase-Kits entwickelt.</li>
	<li>PCR-Amplifikate Heteroduplexes für die T7EI Verdauung zu bilden und das Produkt für 30-60 Minuten mit einem T7EI Enzym in 37 ° c inkubieren Hinweis: Die T7EI, die Probe wird bevorzugt für das screening, wie es ist schnell, einfach und bietet reinigen Elektrophorese Ergebnisse im Vergleich zur Verwendung von Surveyor-Assay. Aber diese Methode kann nicht erkennen, Einfügungen und Löschungen von < 2 Basen, die durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Aktivität in Cas9 RNPs Experimente14generiert werden.</li>
	<li>Führen Sie die verdaute DNA auf 1,5 % Agarosegel bei 110 V für 30-45 Minuten, alle 15 Minuten visualisieren das Gel.</li>
	<li>Stimulieren Sie den Rest der Zellen mit den mbIL21-mit dem Ausdruck Feeder-Zellen in einem Verhältnis von 1:1.</li>
	<li>Fünf Tage nach der Stimulation extrahieren die RNA für die Gen-Expression-Ebene mit qPCR.</li>
	<li>Führen Sie Calcein Assays als zuvor gemeldeten12. Kurz, laden Sie Zielzellen mit Calcein AM (im Beispiel gezeigt, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY Zellen diente). Zytotoxizität Assays durch ausruhen über Nacht in IL2 NK-Zellen vorbereiten (100 IE/mL) plus oder minus 10 ng/mL lösliche TGFβ. Führen Sie Calcein Assays in der gleichen Zytokine wie der NK-Zellen über Nacht ausgeruht waren.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
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<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL dient diente als Berater für Kurier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories und Miltenyi Biotec / Eigenkapital/Leitung CytoSen Therapeutics hat.

DNA-abhängige Änderung der NK-Zellen hat4,9streitig gemacht. Wir, stellten daher direkt eine synthetisch vorgeformten Ribonucleoprotein (RNPs) Komplex und Cas9 Protein als gereinigtes Protein in Grund- und erweiterten NK Zellen8. Diese Methode erlaubte uns, Deckelung, zu beseitigen, Beschatten, und andere transkriptionelle und translationalen Prozesse gestartet durch RNA-Polymerase II, die NK Zelle Apoptose DNA-abhängige Signaltransduktion...

Krebs-Immuntherapie wurde in den letzten Jahren vorgebracht worden. Genetisch veränderte chimeric Antigen-Rezeptor (Auto)-T-Zellen sind ein hervorragendes Beispiel von veränderter Immunzellen erfolgreich in Krebsimmuntherapie eingesetzt. Diese Zellen wurden vor kurzem genehmigt durch die FDA für die Behandlung gegen CD19 + B-Zell-Tumoren, aber Erfolg ist bisher beschränkt sich auf Krankheiten, die mit ein paar Aktionsleisten Antigene und targeting so begrenzten Antigen Repertoire ist anfällig für Fehler durch immun Flucht. Darüber hinaus haben Auto-T-Zellen auf die Verwendung von autologen T-Zellen wegen der Gefahr der Graft - Versus - Host-Seuche verursacht durch allogenen T-Zellen konzentriert. Im Gegensatz dazu, NK-Zellen sind in der Lage, Tumor Zielen auf ein Antigen-unabhängige Weise zu töten und verursachen keine GvHD, wodurch sie einen guten Kandidat für Krebs Immuntherapie6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 Technologie wurde vor kurzem in engineering Immunzellen verwendet, aber genetisch Umprogrammierung NK-Zellen mit Plasmiden seit jeher schwierig. Dies wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei Transgen Lieferung in einer DNA-abhängigen Weise wie Lentivirale und retrovirale Transduktion verursacht erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptosis und der begrenzten Produktion gentechnisch NK-Zellen-4 , 9.
Viele angeborene immune Zellen express hohes Maß an Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie Retinoic Säure-induzierbaren gen ich (RIG-ich), die es ermöglichen erhöhte Anerkennung von Fremd-DNA. Unterdrückung dieser Wege hat höhere Effizienz der Transduktion in NK-Zellen aktiviert, bei Verwendung von DNA-basierten Methoden für gentechnische Veränderung10.
Hier beschreiben wir die Methode für die Verwendung einer DNA-freie-Genom-Bearbeitung von primären und erweiterten menschlichen NK-Zellen unter Verwendung Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs besteht aus drei Komponenten, rekombinante Cas9 Protein komplexiert mit synthetischen Single-Guide RNA, bestehend aus einem komplexierten CrRNA und TracerRNA. Diese Cas9/RNPs sind in der Lage Spalten genomische Ziele mit einem höheren Wirkungsgrad im Vergleich zu ausländischen DNA-abhängige Ansätze aufgrund ihrer Lieferung als funktionelle komplexe. Darüber hinaus kann schnelle Abfertigung von Cas9/RNPs aus den Zellen der Ziel-Effekte wie Induktion der Apoptose reduzieren. So dienen sie Durchbrüche oder Knock-ins für homologe Rekombination6,7in Kombination mit DNA zu erzeugen. Wir haben gezeigt, dass Elektroporation von Cas9/RNPs ist eine einfache und relativ effiziente Methode, die die bisherigen Einschränkungen der gentechnischen Veränderung in NK-Zellen überwindet.
TGFβ ist eine große immunsuppressive Cytokine, die die Aktivierung und Funktionen von NK-Zellen hemmt. Es wurde vermutet, dass targeting TGFβ Weg Immunzelle Funktionen erhöhen kann. Wir gezielt die Region Codierung TGBR2 ektodomäne die bindet TGFβ11. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen einen deutlichen Rückgang der Ebene der mRNA Expression dieses Gens und weiteren zeigen, dass die veränderten NK-Zellen gegen TGFβ resistent geworden. Darüber hinaus behalten die veränderten Zellen Lebensfähigkeit und proliferative Potential, wie sie in der Lage, erweiterte Post-Elektroporation mit bestrahlten Feeder-Zellen. Daher die folgende Methode ist ein vielversprechender Ansatz zur NK-Zellen genetisch manipulieren, für jeden weiteren klinischen oder wissenschaftliche Zwecke.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep&Handel; Menschlicher NK Zellanreicherungscocktail</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Die RosetteSep&trade; Der Human NK Cell Enrichment Cocktail wurde entwickelt, um NK-Zellen durch Negativselektion aus Vollblut zu isolieren.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Biowissenschaften</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072532</td><td>TracrRNA, die proprietäre chemische Modifikationen enthält, die eine erhöhte Nukleaseresistenz verleihen. Hybridisiert zu crRNA, um das Cas9-Enzym</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; zu aktivieren CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Synthetisch hergestellt als Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA, basierend auf der Sequenz der designten gRNA, die auf das Gen des Interesses abzielt</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Genom-Editing-Detektionskit</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>1075931</td><td>Jedes Kit enthält T7EI-Endonuklease, T7EI-Reaktionspuffer und T7EI-Assay-Kontrollen.</td></tr><tr><td>Platin&reg; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nukleofector & Handel; System</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes IL-2-Protein</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primärzelle 4D-Nukleofector&trade; X Kit</td><td></td><td>Lonza V4XP-3032</td><td>Enthält pmaxGFP&trade; Vektor, Nukleofector & Handel; Lösung, Ergänzung, 16-Well-Nukleocuvette&Handel; Strips</td></tr><tr><td>Non-Targeting: Custom siRNA, Standard 0,05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nuclease</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; Blut & Taschentuchhandbuch</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9-Kontrollkit,</td> Human <td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072554</td><td>Enthält tracrRNA, HPRT-Positivkontroll-crRNA, Negativkontroll-crRNA#1, HPRT-Primer-Mix und nukleasefreien Duplex-Puffer.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7,5 (1X TE Lösung)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Elektroporationsverstärker</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>1075915</td><td>Cas9 Elektroporationsverstärker</td></tr></tbody></table>

generation von knock-out-grund- und erweiterten menschlichen nk-zellen mit cas9 ribonucleoproteins

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 Technologie beschleunigt sich Genom-Technik in vielen Zelltypen, aber so weit gen Lieferung und stabile gentechnische Veränderung im primären NK-Zellen herausfordernd gewesen. Transgen-Lieferung mit Lentivirale oder retrovirale Transduktion führte beispielsweise in einer begrenzten Ausbeute von gentechnisch NK-Zellen durch erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptose. Wir beschreiben hier eine DNA-freie Methode für Genom-Bearbeitung von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Diese Methode erlaubt effiziente ko von TGFBR2 und HPRT1 Gene in NK-Zellen. RT-PCR-Daten zeigten eine signifikante Abnahme der Gen-Expression-Ebene, und ein Zytotoxizität Assay eines repräsentativen Zelle Produkts vorgeschlagen, dass die RNP-modifizierte NK-Zellen weniger empfindlich auf TGFβ wurde. Genetisch veränderte Zellen möglicherweise erweiterte Post-Elektroporation durch Stimulation mit bestrahlten mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen.

Elektroporation Effizienz
Zur Optimierung der Elektroporation von Cas9/RNPs haben wir 16 verschiedene Programme mit Transduktion von GFP-targeting SiRNA und DNA Plasmid in NK-Zellen getestet. Flow Cytometry Test zeigte, dass die EN-138 den höchsten Anteil an Lebensfähigkeit und Transduktion Zelleffizienz (35 % lebenden GFP positive Zellen) für beide Teilchen (Abbildung 1 und <strong cl...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der NK-Zellbiologie über die Rolle und Funktion spezifischer Gene und Signalwege zu beantworten, die die Funktion von Effektorzellen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre hohe Erfolgsrate im Vergleich zu DNA-abhängigen Ansätzen, die einen hocheffizienten Knockout eines der klinisch relevantesten Gene in der NK-Zelltherapie ermöglichen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Immuntherapie von soliden Tumoren und Hirntumoren, die TGF-beta als Mittel zur Immunflucht exprimieren.Für die primäre NK-Zelltransduktion werden die fünf frisch isolierten NK-Zellen pro Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 100 IE pro Milliliter IL2 pro T75-Kolben, vier Tage lang dreimal 10 inkubiert, wobei das Medium jeden zweiten Tag und am Tag vor der Transduktion ausgetauscht wird. Für eine erweiterte NK-Zelltransduktion stimulieren Sie die primären NK-Zellen am Tag Null mit einer strahlenförmigen, membrangebundenen IL21-exprimierenden K562-Feederzelle im Eins-zu-Eins-Verhältnis, wobei das Medium jeden zweiten Tag und am Tag vor der Transduktion ausgetauscht wird. Am Tag der Elektroporation wird ein T25-Kolben mit a

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Cas9-Ribonukleoprotein-vermittelten genetischen Modifikation von primären natürlichen Killerzellen (NK). Ein Cas9-Ribonukleoprotein, bestehend aus einer Cas9-Endonuklease, die an eine durch Basenpaarung gebildete Guide-RNA (gRNA) gebunden ist, eine CRISPR-RNA (crRNA) und eine trans-aktivierende crRNA (tracrRNA), wird mittels Elektroporation in primäre natürliche Killerzellen eingebracht. Das Ribonukleoprotein zielt auf die Wirts-DNA ab und spaltet sie...

Eine Technik zur Gen-Editierung in natürlichen Killerzellen mit CRISPR Cas9

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Wir haben ein einfaches und kostengünstiges Protokoll entwickelt, um Cas9/Single-Guide-RNA (sgRNA)-Ribonukleoproteinkomplexe in virusähnliche Partikel zu laden. Diese Partikel, "Nanoblades" genannt, ermöglichen eine effiziente Abgabe des Cas9/sgRNA-Komplexes in immortalisierten und primären Zellen sowie in vivo.

Abgabe des Cas9/sgRNA Ribonukleoprotein-Komplexes in Immortalisierte und Primärzellen über virusähnliche Partikel ("Nanoblades")

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Das Protokoll beschreibt, wie Knock-out-Myoblasten mit CRISPR/Cas9 erzeugt werden können, beginnend mit dem Design von Guide-RNAs bis hin zur zellulären Klonierung und Charakterisierung der Knock-out-Klone.

Entwicklung von Knock-out-Muskelzelllinien mittels Lentivirus-vermittelter CRISPR/Cas9-Gen-Editing

Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.

Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Erfahren Sie die effiziente Knockout-Generierung in menschlichen NK-Zellen mittels Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen und verbessert Ansätze für die Immuntherapie solider Tumoren.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

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